三浅裂野牵牛植物防御素基因家族鉴定及表达分析

Identification and Expression Analysis of Plant Defensin Gene Family in Ipomoea trifida

摘要

植物防御素普遍存在于植物中，是植物先天免疫的组成部分，具有抗真菌、细菌及抑制蛋白酶活性等作用，在植物生长发育、抗病、逆境胁迫应答中发挥重要作用。为了在甘薯中开展相关分子生物学研究及抗逆性分子育种，为植物防御素在抗菌类药剂生产研发、植物保护等方面开展相关研究工作奠定基础，对甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam.）近缘野生种三浅裂野牵牛（Ipomoea trifida）全基因组水平的植物防御素基因PDF家族成员进行鉴定和表达分析。结果表明，在其基因组中共鉴定到15个防御素蛋白，其等电点变化范围为7.56~9.30，表明这些蛋白质均呈弱碱性。染色体定位发现，这15个ItfPDFs基因不均匀分布于4条染色体上（Chr03、Chr06、Chr13和Chr14）。转录组数据分析表明，ItfPDF14在愈伤组织、根、茎、叶、花中均有表达，并且能够响应不同非生物胁迫，推测ItfPDF14可能在三浅裂野牵牛生长发育及非生物胁迫响应中发挥着重要功能。ItfPDF11、ItfPDF13、ItfPDF14和ItfPDF15可能参与调控三浅裂野牵牛的花芽发育。在进化过程中，基因片段复制可能是该基因家族成员扩张的重要方式。

Abstract

Plant defensin is commonly found in plants, and it is the component of the innate immunity of plants, serving functions such as antifungal, antibacterial, and protease inhibition, and playing important roles in plant growth and development, disease resistance, and stress response. In order to provide a reference basis for molecular biology research and resistance breeding in sweet potatoes and lay a foundation for research and development of plant defensin the production of antimicrobial agents and plant protection, in this study, the members of the plant defensin gene(PDF) family was identified and analyzed at the genome-wide level in Ipomoea trifida, a species related to sweet potato(I. batatas (L.) Lam). The results showed that there were 15 plant defensin proteins in the genome and their isoelectric point ranged from 7.56 to 9.30, indicating that these proteins were alkaline. Chromosome localization analysis revealed that the 15 ItfPDFs genes were unevenly distributed across four chromosomes(Chr03, Chr06, Chr13, and Chr14). Based on transcription data, the expression of ItfPDF genes under different tissue types(callus-follower, callus-stem, flower, flower bud, leaf, root, and stem) was found and they could respond different abiotic stress, inferring that ItfPDF could play an important role in growth and development, and abiotic stress response of Ipomoea trifida. ItfPDF11, ItfPDF13, ItfPDF14, and ItfPDF15 might also play roles in flower bud development of Ipomoea trifida. In the process of evolution, gene fragment replication could be an important mechanism for the members of the ItfPDF gene family.

Graphical abstract

关键词

三浅裂野牵牛 / 防御素基因 / 生物信息学 / 表达分析

Key words

Ipomoea trifida / defensin genes / bioinformatics / expression analysis

在自然界中，植物在生长发育过程中不断面临害虫和其他微生物的攻击，如真菌和细菌等病原体的侵袭。同时，植物也会受到恶劣环境的影响，如盐、热、干旱胁迫等。为了克服这些逆境胁迫，植物中已经建立了一套保护自身免受害虫、病原体、不良环境攻击的复杂机制^[1]。此外，逆境胁迫下，植物体内还会产生许多防御因子，如聚乙炔、酚类、生物碱、萜类、过氧化氢、防御素和防御素相关蛋白^[2-3]，进一步增强其抗逆能力。

植物防御素是一类具有强抗菌活性的短肽，具有45~54个氨基酸残基，由8个半胱氨酸残基形成，以稳定一个螺旋和3个β-折叠的Csαβ（Cysteine stabilized αβ motif）三维结构^[4]。该结构类似于昆虫和哺乳动物的防御肽，揭示了它们具有共同的起源。防御素主要作用于病原微生物的细胞膜上，与磷脂外侧结合，破坏细胞膜结构，改变膜的通透性，产生Ca²⁺向内流动、K⁺向外流动和介质液化等现象^[5]。植物防御素普遍存在于植物体内，包括根、茎、叶、花、果实和种子等部位，在种子发芽和幼苗生长过程中起着重要的保护作用^[6-10]，是植物先天免疫的组成部分，具有抗真菌、抗细菌或抑制蛋白酶活性等作用^[11-14]。此外，植物防御素也存在于不同的组织中，如气孔、木质部、薄壁细胞以及胞外区域^[15]。植物防御素在保护植物免受病原微生物和其他昆虫侵害方面发挥着重要作用，预计将在不久的将来成为提高作物生产力的重要手段，在抗菌类药物生产研发、植物保护、作物抗病性分子育种等领域具有极大的应用前景^[16]。

1990年，COLILLA等^[17]和MENDEZ等^[18]最早在小麦（Triticum turgidum）和大麦（Hordeum vulgare）胚乳中发现植物防御素，起初命名为γ-thionine，后来发现其在序列和结构上与昆虫防御肽类似，最终命名为植物防御素。DEBEER等^[19]从十字花科植物日冠花（Heliophila coronopifolia）中分离出4个具有同源性的防御素基因（Hc-AFP1-4），并发现这些防御素基因对日冠花灰霉病（Botrytis cinerea）具有抵抗能力。许多植物中的防御素基因（Plant defensin gene，PDF）已被成功克隆，包括大蒜^[20]、甘蓝型油菜^[21]、萝卜^[22]等。研究表明，植物防御素参与植物的非生物胁迫响应^[23]。盐胁迫可诱导大蒜AsPDF1表达^[11]，小麦防御素基因可响应冷胁迫诱导^[24]。LIU等^[25]在异源四倍体油菜籽（Brassica napus）全基因组水平进行鉴定，共得到37个PDFs基因家族成员，并发现这些基因不同程度地响应各种营养胁迫（硝酸盐限制、铵过量、饥饿、缺钾、镉毒性）和盐胁迫，推测它们可能参与营养胁迫和盐胁迫响应。通过转基因技术，在受体植物中过量表达植物防御素基因，可以增强植物的抗逆性。如LI等^[22]在小麦中过量表达萝卜防御素基因RsAFP2，提高了小麦对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的抗病性。防御素TAD1赋予了转基因小麦对白霉病（Snow mold）和赤霉病（Fusarium head blight）的抵抗能力^[24]。马铃薯中过量表达苜蓿防御素基因后，对大丽花轮枝孢菌（Verticillium dahliae）的抗性提高^[26]。防御素基因在植物抗逆性中发挥重要作用，这为培育植物抗性品种提供了新方向和新途径。

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam.）在我国种植面积广，但是干旱、盐、热胁迫等不良环境条件以及种植过程易感染各种真菌病、病毒病，严重影响其产量。同时甘薯六倍体的复杂遗传背景，使其分子生物学相关研究相对滞后。研究表明，三浅裂野牵牛（I. trifida）是甘薯的二倍体近缘野生种^[27-28]，其基因组信息的挖掘将为甘薯抗性分子育种相关研究提供理论依据。目前，已在异源四倍体油菜籽^[25]、小麦^[29]、番茄^[30]、芸薹属3种植物^[31]等物种中开展了植物防御素基因家族成员的全基因组鉴定。本研究对三浅裂野牵牛中ItfPDFs基因家族进行分析，旨在为甘薯防御素基因的克隆和功能分析提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 三浅裂野牵牛防御素基因家族成员的鉴定

在密歇根州立大学甘薯资源库（Sweetpotato Genomics Resource，http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/）下载三浅裂野牵牛基因组数据。从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）中获得PDF保守结构域（Gamma-thionin）的隐马尔可夫模型文件（Hidden Markov Models，HMM）PF00304，并使用HMMER 3.0软件筛选三浅裂野牵牛基因组，获得候选序列（E-value>0.05）。为了验证这些序列是否为PDF蛋白，利用NCBI在线工具CD-search（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析其保守结构域，根据是否存在PDF基因家族特有的保守结构域（Gamma-thionin，PF00304），最终确定ItfPDFs基因家族成员。

1.2 ItfPDF蛋白的理化性质分析

为了进一步研究ItfPDFs蛋白的理化性质，使用在线程序ExPASy Proteomics Server（https://web. expasy.org/protparam/）进行理化性质预测分析，包括氨基酸数量（Number of amino acids）、相对分子质量（Molecular weight，MW）以及等电点（Protein isoelectric，pI）等。

1.3 染色体定位分析

在甘薯资源库下载得到关于三浅裂野牵牛基因位置信息的GFF文件。利用上述1.1中确定的ItfPDFs基因家族成员的基因ID和TBtools^[32]软件中的Gene Location Visualize from GTF/GFF工具进行染色体定位分析，获取ItfPDFs基因家族各成员的染色体位置信息，绘制出染色体定位图。

1.4 多序列比对和系统进化分析

在TAIR网站（http://www.arabidopsis.org）获取拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）防御素蛋白（AtPDF）的序列信息。使用MEGA 7.0软件进行ItfPDFs的多序列比对（基于Muscle法），使用JalView软件提取多序列比对结果，选取包含特征结构域的等长序列，提交至在线软件Weblogo进行保守结构域的可视化。通过计算分析、参数比对，筛选得到ItfPDFs基因家族最适的WAG氨基酸替换模型，并使用最大似然法（Maximum likelihood method）的P-距离（P-distance）模型建立ItfPDFs和AtPDFs的系统进化树。校验参数（Bootstrap）取值为1 000，其他运行参数设置为默认值。使用FigTree软件对进化树进行处理。

1.5 保守基序分析和基因结构分析

使用MEME在线工具（http://meme-suite.org/tools/meme）对ItfPDFs基因家族成员进行保守基序分析，利用TBtools^[32]对ItfPDFs基因家族成员的基因结构进行分析，使用TBtools^[32]软件的Gene Structure View工具对分析结果进行可视化。

1.6 表达模式分析

利用甘薯资源库下载得到三浅裂野牵牛的转录组数据，通过TBtools^[32]软件的HeatMap工具绘制ItfPDFs基因家族在不同组织、非生物胁迫下的基因表达热图（数据均为FPKM值经过log₂处理）。

2 结果与分析

2.1 三浅裂野牵牛防御素基因家族成员的鉴定

使用HMMER 3.0软件筛选三浅裂野牵牛基因组，共鉴定到15条候选ItfPDFs序列，利用NCBI在线工具CD-search和SMART对这15条序列进行保守结构域分析，结果表明（图1），这15条序列都有PDF基因家族特有的Gamma-thionin保守结构域，根据各成员在染色体上的相对位置，将它们依次命名为ItfPDF1~ItfPDF15。

从表1可以看出，这15条ItfPDFs蛋白的氨基酸个数为72~179个，其中ItfPDF1序列最短，ItfPDF6序列最长；各成员编码的氨基酸数目小于100的成员有14个，占比93.3%，氨基酸数目在100~200个的成员有1个，占比6.7%。三浅裂野牵牛防御素基因家族蛋白分子质量相差较大，介于7 898.32~19 678.64 u，其中ItfPDF6最大，ItfPDF15最小；等电点变化范围为7.56~9.30，ItfPDF4最小，ItfPDF5最大。

2.2 染色体定位分析

染色体定位分析结果表明（图2），鉴定到的15个ItfPDFs基因分布于4条染色体上（Chr03、Chr06、Chr13和Chr14），其中，ItfPDF1和ItfPDF2位于3号染色体上，ItfPDF3、ItfPDF4、ItfPDF5、ItfPDF6和ItfPDF7位于6号染色体上，而ItfPDF8、ItfPDF9、ItfPDF10、ItfPDF11、ItfPDF12、ItfPDF13和ItfPDF14位于13号染色体上，ItfPDF15位于14号染色体上。除了ItfPDF3、ItfPDF4和ItfPDF5位于Chr06染色体的中下部外，其余12个ItfPDFs基因均位于各自所在染色体的端部。除了在染色体Chr14上分布有1个ItfPDF外，在Chr03、Chr06、Chr13染色体上均分布多个串联重复的ItfPDFs基因。

2.3 保守结构域分析

保守结构域的Weblogo分析结果表明（图3），在这15个ItfPDFs蛋白的保守结构域中，第1、12、19、23、33、43、45、50位的半胱氨酸残基（C）高度保守。另外，第10、27、31、35位的甘氨酸（G），第34、40、41、42位的精氨酸（R），第26位的谷氨酸（E），第9位的赖氨酸（K），第28位的色氨酸（F）也高度保守。

2.4 保守基序分析及基因结构分析

利用MEME工具对ItfPDFs蛋白的保守基序进行分析（Motif 1~Motif 15代表ItfPDFs蛋白质序列中15个不同的保守氨基酸基序），结果表明（图4-A），这15个ItfPDFs蛋白中出现频率最多的是Motif 1、Motif 3和Motif 4。除ItfPDF8之外，其余的ItfPDFs成员均包含Motif 1，比率为93.3%；除ItfPDF12和ItfPDF13之外，其余的ItfPDFs成员均包含Motif 3，比率为86.7%；除ItfPDF5、ItfPDF12、ItfPDF13和ItfPDF15之外，其余的ItfPDF成员均包含Motif 4，比率为73.3%。表明在ItfPDFs蛋白中，Motif 1、Motif 3、Motif 4是重要的保守基序。ItfPDF6包含的Motif数量最多，有10个，其余14个ItfPDFs蛋白中含4~6个Motif。ItfPDF9、ItfPDF10、ItfPDF11和ItfPDF14含有相同的4个Motif（Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4）。基因结构分析结果表明（图4-B），这15个ItfPDFs基因均含有内含子，其中，13个基因含有1个内含子，占比为86.7%；ItfPDF12含有2个内含子；ItfPDF6含有3个内含子。

2.5 系统进化分析

在拟南芥中，AtPDFs家族成员15个，主要分为PDF1s（图5中蓝色分支）和PDF2s（图5中红色分支）2个进化分支^[25]。系统进化分析结果表明，三浅裂野牵牛的ItfPDFs成员均属于PDF2s亚族；ItfPDF1蛋白与ItfPDF2蛋白、ItfPDF10蛋白与ItfPDF11蛋白、ItfPDF12蛋白与ItfPDF13蛋白的亲缘关系较近。

2.6 ItfPDFs基因的组织特异性表达分析

从图6可以看出，ItfPDFs基因在不同组织中的表达情况可以分为2类：第1类在叶、根、茎、花、花芽、愈伤组织中几乎不表达，如ItfPDF1、ItfPDF3、ItfPDF4、ItfPDF5、ItfPDF6、ItfPDF7、ItfPDF8、ItfPDF9、ItfPDF10、ItfPDF12；第2类在花芽中表达量高，例如ItfPDF11、ItfPDF13、ItfPDF14和ItfPDF15，这些基因可能参与花芽发育过程。另外，ItfPDF14在根、茎、叶、花、花芽和愈伤组织中表达量均较高，可以初步推断ItfPDF14可能在三浅裂野牵牛生长发育过程中发挥重要的生理作用。

2.7 ItfPDFs基因在非生物胁迫下的表达分析

分析了三浅裂野牵牛的ItfPDFs基因在冷、热、盐、干旱胁迫下的基因表达情况，结果表明（图7），只有ItfPDF14基因响应冷胁迫；热胁迫诱导ItfPDF2、ItfPDF5和ItfPDF14表达，ItfPDF14的表达量最高；有4个ItfPDFs基因受盐胁迫诱导表达，ItfPDF14表达量最高，ItfPDF1和ItfPDF2次之，ItfPDF5最低；干旱胁迫时，有3个ItfPDFs基因表达，其中ItfPDF14表达量最高，ItfPDF2和ItfPDF5次之。综上，大部分ItfPDFs基因家族成员不响应非生物胁迫，只有ItfPDF1、ItfPDF2、ItfPDF5和ItfPDF14受非生物胁迫诱导表达；ItfPDF14在不同非生物胁迫条件均有较高表达量，且在干旱和盐胁迫下的表达量高于冷胁迫和热胁迫。说明ItfPDF14可能在三浅裂野牵牛响应非生物胁迫应答，尤其是干旱和盐胁迫中发挥重要作用。

3 结论与讨论

植物防御素是一种阳离子性的多肽，分子质量约为5 ku，包括1个α-螺旋和3个反平行的β-折叠片层结构，呈现出球形的三维结构，一般含有8个保守的半胱氨酸残基，形成稳定的βαββ结构^[1-4]。本研究鉴定到15个ItfPDFs蛋白，其结构域中含8个高度保守的半胱氨酸残基，可能与植物防御素功能密切相关。

3.1 三浅裂野牵牛PDF家族扩张的主要原因分析

本研究共鉴定到15个三浅裂野牵牛防御素基因家族成员ItfPDFs。理化性质分析表明，各成员的等电点介于7.56~9.30，均大于7，为碱性蛋白，由此可初步推断其主要在碱性的亚细胞环境中存在并发挥生理作用。已有研究在小麦、水稻、拟南芥、玉米中分别鉴定出73、15、15、11个PDF蛋白^[33]。不同物种的基因数量差异表明，PDF蛋白存在功能冗余，然而，基因数量并不对应于基因组大小。小麦中PDF蛋白数量远远多于拟南芥、玉米和水稻^[33]，说明小麦遗传性状的复杂性，小麦是异源六倍体，在其进化中可能会发生多次基因重复事件，推测这与小麦进化过程中适应多变的外部环境有关。本研究染色体定位分析发现，ItfPDFs基因不均匀地分布于三浅裂野牵牛第3、6、13、14号染色体上，大部分分布于染色体的端部，这与在番茄中的研究结果类似^[19]。除了在染色体Chl14上分布有1个ItfPDF外，在Chl03、Chl06、Chl13染色体上都分布有多个串联重复的ItfPDFs基因。表明基因片段复制是三浅裂野牵牛进化过程中PDF家族成员扩张的主要原因，这与小麦PDF基因家族的研究结果类似^[29]。

3.2 三浅裂野牵牛ItfPDFs基因家族成员的功能

已有的研究结果表明，防御素主要参与植物抗病性、抗营养胁迫^[24-26]，关于参与非生物胁迫响应的相关研究较少。有研究发现，大蒜AsPDF1在根、鳞茎、叶片中均有表达，但在根中表达量最高，且受盐胁迫诱导表达^[20]。本研究中，鉴定到的15个ItfPDFs基因在三浅裂野牵牛不同组织和非生物胁迫条件下差异表达，可能原因是ItfPDFs蛋白在进化中发生了功能分化。值得注意的是，ItfPDF11、ItfPDF13、ItfPDF14和ItfPDF15在花芽中高表达，这些基因可能参与三浅裂野牵牛的花芽发育过程。ItfPDF14基因在各组织及非生物胁迫下均有较高表达，推测ItfPDF14基因可能在三浅裂野牵牛的生长发育和非生物胁迫应答中发挥重要作用。关于ItfPDF14基因功能及其甘薯同源基因的相关功能解析需要后续进一步验证。

相较于传统育种，分子育种技术具有短期、高效、定向改良目标性状等优点。利用转基因技术能够增强植物抗逆性，加速作物遗传改良^[33-35]。随着基因组测序技术以及基因家族分析方法研究^[36-37]的不断深入，植物中将鉴定出更多的防御素基因家族成员。植物功能基因组学和蛋白质组学的快速发展，将逐步解析这些防御素基因在植物抗性中的作用机制。植物防御素具有高效、广谱抗菌的特性，研究人员已注意到植物防御素在植物分子育种、抗菌素生产等多个领域有着广阔的发展前景和无限的应用潜力^[38-39]。本研究鉴定分析了三浅裂野牵牛ItfPDFs基因家族15个成员，推测ItfPDF11、ItfPDF13、ItfPDF14和ItfPDF15可能参与三浅裂野牵牛的花芽发育过程，ItfPDF14基因可能在三浅裂野牵牛的生长发育和非生物胁迫应答中发挥关键作用。这些结果对于今后深入研究这些基因在抗逆性分子育种方面的作用具有重要的参考价值，同时可为甘薯中PDF基因的相关研究提供参考依据。

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基金资助

山西省研究生教育创新项目(2020BY057)