百合GARP家族鉴定和鳞片发育的基因克隆与表达

Identification of GARP Transcription Factor Family and Cloning and Expression of Bulb Development Related Genes in Lilium

摘要

GARP是植物特异性转录因子家族，在植物生长发育和非生物胁迫响应中发挥关键作用。为全面了解百合GARP转录因子提供基础资料，为探索百合鳞片的生长发育机制奠定一定基础，基于二代、三代百合转录组数据，对其GARP家族成员进行鉴定和表达分析。结果表明，在转录组数据中共鉴定出34个GARP蛋白，均为亲水性蛋白，68%为酸性蛋白，94%为不稳定蛋白。系统进化树将百合GARPs分为5个亚家族：ARR-B、GLK、NIGT1/HRS1/HHO、PHR1/PHL1和KAN，进化分析发现，百合GARPs可能参与生长发育、生物钟调节、开花转化、激素运输、非生物胁迫等过程。对鳞片发育具有重要作用的ARR-B亚家族成员进行qRT-PCR分析，结果发现，LhGARP33、LhGARP30和LhGARP3可能对鳞茎发育起重要作用。LhGARP3和LhGARP30被成功克隆，氨基酸序列具有典型的ARR-Bs磷酸受体结构域（REC）及金属和磷酸化结合位点。空间表达分析了ARR-B I亚组在花、叶和鳞片中的表达模式，结果表明，LhGARP5在叶中的表达量最高，而LhGARP31在花中的表达量最高，LhGARP33、LhGARP30和LhGARP3的表达特征基本一致，均在鳞片中高表达，其可能作为关键基因在鳞片发育过程中发挥主要作用。

Abstract

GARP is a plant specific transcription factor family and plays a key role in plant growth, development, and abiotic stress response. In order to provide basic information for a comprehensive understanding of GARP transcription factors in Lilium, and laid a foundation for exploring the growth and development mechanism of bulbs in Lilium, in this study, based on the transcriptome data of Next-generation sequencing and Third-generation sequencing of Lilium, identification and expression analysis of GARP family members were conducted. The results indicated that a total of 34 GARP proteins were identified in transcriptome data, all the GARP proteins were hydrophilic, 68% of which were acidic proteins, and 94% were unstable proteins. Based on the phylogenetic analysis, Lilium GARPs were clustered into five subfamilies: ARR-B, GLK, NIGT1/HRS1/HHO, PHR1/PHL1, and KAN, and they were annotated with functions on growth and development, biological clock regulation, flowering transformation, hormone transport, abiotic stress and other processes. The ARR-B subfamily members that played important roles in bulb development were analyzed by qRT-PCR, and the results showed that LhGARP33, LhGARP30, and LhGARP3 may play important roles in bulb development. The LhGARP3 and LhGARP30 were successfully cloned and their amino acid sequences exhibited the typical ARR-Bs phosphate receptor domain（REC) and metal and phosphorylation binding sites. Spatial expression patterns of ARR-B I subgroup in flowers, leaves, and bulbs were analyzed and the results revealed that LhGARP5 had the highest expression in leaves, while LhGARP31 had the highest expression in flowers, LhGARP33, LhGARP30 and LhGARP3 had the basically consistent expression characteristics, the highest expression in bulbs, indicating that they may play a major role in bulb development as a key gene.

Graphical abstract

关键词

百合 / GARP家族 / 鳞片发育 / 实时荧光定量PCR / 基因克隆

Key words

Lilium / GARP family / bulb development / real time fluorescence quantitative PCR / gene cloning

Author summay

刘佳鑫，在读硕士，研究方向：园艺植物种质创新与利用，E-mail：[e-mail]

GARP（Golden2、ARR-B、Psr1）是植物特有的转录因子（Transcription factors，TFs）家族，在植物中发挥多样化的作用，如参与植物叶绿体发育、根和芽的发育、昼夜节律调控、开花转换、营养感测、激素运输和信号转导等多个途径^[1-2]。B-motif是GARP TFs的特征基序，约由60个氨基酸构成，负责核定位和DNA结合^[1-3]。在拟南芥中，已鉴定出56个GARP TFs，根据其主要功能被分为5个亚家族：ARR-B、GLK、NIGT1/HRS1/HHO、KAN和PHR1/PHL1^[1-2]。ARR-B TFs主要参与调控植物根、茎组织的分化，作为细胞分裂素正向调控因子冗余地参与植物的生长发育^[4-5]。在拟南芥中，ARR-Bs共有11个成员，被分为3个亚组。Ⅰ亚组包括ARR1/2/10/11/12/14/18共7个成员，Ⅱ亚组和Ⅲ亚组则分别由ARR13/ARR21和ARR19/ARR20组成^[6]，Ⅰ亚组被广泛认为负责DNA结合，并在磷酸化调节途径中发挥关键作用^[4,7]。GLK TFs在生物和非生物胁迫中发挥重要作用，如盐胁迫、干旱、病原体侵染^[8]，并在不同物种中参与调控叶绿体的发育^[9]。AtGLK1调控病害防御相关基因的表达^[10]，GLK突变体植株产生白化叶片表型^[9]。NIGT1/HRS1/HHO TFs参与调控植物氮、磷的吸收和利用，在植物生长发育和非生物胁迫中起着重要作用^[11]。KAN TFs在叶原基的远轴面和维管组织中的韧皮部表达,调控叶远轴面极性维持和近轴极性的抑制，在拟南芥中以功能冗余的方式参与功能调控^[12-13]。PHR1/PHL1 TFs主要参与植物磷饥饿响应途径^[14]，其中PHR1被认为是低磷信号通路中的核心转录因子^[15]。

百合（Lilium spp.）是百合科百合属多年生球根花卉，具有很高的观赏价值和经济价值。本研究选用的材料是索邦百合，作为著名的切花品种，在全国范围内广泛应用^[16]。随着测序技术的发展，越来越多的转录因子家族在百合中被鉴定，但GARP家族的研究很少，仅有ARR-BsⅠ亚家族（ARR-Bs）的5个基因：LlRR1、LlRR2、LlRR10、LlRR11和LlRR12在卷丹（L. lancifolium）中进行了功能研究，以功能冗余的方式参与卷丹珠芽的形成，LlARR1/2/12在外源细胞分裂素6-BA处理下被激活表达^[17]。在亚洲百合Matrix中，LlRR1在细胞分裂素介导的小鳞片形成中不发挥主要效应^[18]，表明不同百合中ARR-Bs作用的机理不同。鉴于GARP在植物中广泛且多样的功能，且鳞片是百合进行无性繁殖的重要器官，对百合GARP家族的系统分析和对ARR-BsⅠ亚家族进行克隆是非常必要的。

本研究基于百合二代、三代转录组数据库，挖掘百合GARP转录因子家族，进行理化性质分析和分类，分析GARP基因在不同组织中的差异表达情况，对ARR-BsⅠ亚家族中参与鳞片特异表达基因进行克隆，分析其序列特征，以期为深入探讨百合GARP基因的功能提供理论依据，并为探索百合Sorbonne鳞片生长发育机制奠定一定基础。

1 材料和方法

1.1 数据来源

二代转录组数据（NGS）源于山西农业大学杜方课题组之前的L.-Unigene-All数据库^[19]，由东方百合Sorbonne花、叶、鳞、茎皮、根和柱头等6个器官的混合测序数据^[19]、麝香百合White Europe花粉转录组数据^[20]和4个基因型百合（Star Gazer、White Fox、Connecticut King、Trumpet）叶片转录组数据^[21]杂交组装获得。三代转录组数据（TGS）由LI等^[22]提供，包括分别用低浓度和高浓度IAA处理的7个组织（植株顶端、上茎、下茎、叶、支柱根、根和鳞片）的转录组数据。拟南芥GARP蛋白序列（ARR-B和G2-like）下载于PlantTF数据库（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）。

1.2 材料来源

以种于实验室样盆里的东方百合Sorbonne为试验材料，取盛花期的内外花被片、托叶和内鳞片分别作为样本，采样后迅速置于液氮速冻，存入-80 ℃冰箱保存。

1.3 百合GARP转录因子家族的鉴定

对PlantTFDB下载的85个拟南芥蛋白序列进行B-motif结构域重新鉴定，剔除不含完整B-motif保守位点（单个色氨酸残基W和SHLQ（K/M）（Y/F））的序列。之后基于重新鉴定的AtGARPs对百合NGS和TGS数据库进行BLASTP分析（设置E<1e-5，其余参数默认），初步鉴定百合中的GARP同源基因。对鉴定出的百合GARP家族进行B-motif保守位点确认，去除不含完整B-motif结构域的序列，并将鉴定结果提交至TBtools（v.1.120）的Blast Zone工具去冗余，保留最长的序列。取NGS和TGS数据库鉴定结果的并集，命名为LhGARPs。

1.4 百合GARP转录因子家族的理化特征

利用在线工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对LhGARPs进行理化性质分析：氨基酸数量、蛋白分子量、等电点及总平均亲水性；利用CELLO（v.2.5）（http://cello.life.nctu.edu.tw/）在线版本进行亚细胞定位预测。

1.5 百合GARP系统发育分析

利用LhGARPs、AtGARPs蛋白序列构建系统发育树。使用Mega 7.0的Clustalw（参数默认）工具对LhGARPs、AtGARPs和葡萄GARP蛋白序列进行多序列比对。基于比对结果在Mega 7.0中使用邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育树，参数选择P-distance、pairwise deletion，Bootstrap method为1 000，其他参数选择默认值。使用TVBOT在线工具（https：//www.chiplot.online/tvbot.html）对系统发育树进行可视化与美化^[23]。

1.6 实时荧光定量PCR

使用Bio-RAD的Taq SYBR^® Green qPCR Premix（Universal）试剂，选取Actin为内参基因，以基因在Sorbonne花瓣中的表达量为对照进行qRT-PCR（表1）。qRT-PCR反应体系20 μL，包括：Taq SYBR^® Green qPCR Premix 10 μL，正、反向引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH₂O 7.6 μL。扩增条件为：95 ℃ 30 s；94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，循环数40。利用2^-ΔΔCt法计算相对表达量，用Origin 2021绘图。

1.7 ARR-B I的克隆与空间表达特征

使用卷丹ARR-Bs引物（LlARR1/2/10/11/12）^[24]在Sorbonne花、叶和鳞中均未扩增出目的条带，以L.-Unigene-All数据库序列为模板重新设计引物（LhGARP5/31/30/33/3）和内参Actin引物，交由上海生工生物工程股份有限公司合成（表2）。以东方百合Sorbonne花、叶和鳞cDNA为模板进行克隆。PCR反应体系为10 μL，包括cDNA 2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 3 μL（诺唯赞生物科技股份有限公司），ddH₂O 4 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；35个循环的变性（95 ℃，15 s）、退火（58 ℃，15 s）和延伸（72 ℃，1 min）过程；最后在72 ℃延伸5 min。取8 μL PCR产物和5 μL Marker，在1%琼脂糖凝胶上进行检测。

使用凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，连接至pMD™19-T载体上，转化大肠杆菌（Escherichia coli）Trans5α，涂入蓝白斑筛选的平板上，挑取单克隆白斑进行菌液PCR验证后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。利用NCBI ORF工具确定测序结果的CDS序列。

2 结果与分析

2.1 百合GARP转录因子家族的鉴定及其理化特征

对86个AtGARPs进行重新确认，剔除不含完整B-motif保守位点（单个色氨酸残基W和SHLQ（K/M）（Y/F））的序列，鉴定出61个含完整B-motif保守位点的AtGARPs。基于重新鉴定出的拟南芥GARP序列Blast检索NGS和TGS数据,去除不完整序列和冗余序列后，最终在NGS鉴定出25个GARP成员，TGS鉴定出27个GARP成员。NGS和TGS中有18个序列同源性达94%~100%，其中NGS中的7个序列和TGS中的9个序列匹配不到任何的同源序列。取2个数据库的并集，34个GARP基因被命名为LhGARP1~LhGARP34。LhGARPs的鉴定及蛋白理化性质如图1所示。

从图1可以看出，LhGARPs编码125~676个氨基酸，分子质量在13 878.75~74 472.78 u。理论等电点在5.27~10.15，LhGARPs蛋白pI值>7的有11个（32%），为碱性蛋白；其余23个（68%）LhGARPs的pI值<7，为酸性蛋白。所有蛋白的总平均亲水性（GRAVY）均<0，表明百合GARP都是亲水性蛋白。不稳定指数（II）分析表明，除LhGARP18和LhGARP3为稳定蛋白（Ⅱ<40）外，其余LhGARPs均为不稳定蛋白（94%）。

2.2 GARP系统发育树分析

为了分析百合GARP家族的分类及进化关系，构建并分析了百合与拟南芥GARP系统发育树，结果显示（图2），GARPs主要聚成5个分支，即ARR-B、GLK、NIGT1/HRS1/HHO、PHR1/PHL1和KAN。其中，PHR1/PHL1s成员最多，有14个；NIGT1/HRS1/HHOs和APRR成员最少，均仅包含1个；ARR-Bs有8个成员，GLKs和KANs均含有5个成员。

同一亚家族的成员可能具有相似的调控功能，由此结合进化树分析预测LhGARPs的功能。ARR-Bs成员LhGARP5/31/30/33/3分别与已克隆到的卷丹LlRR1/2/10/11/12同源，LhGAR18/31分别与ARR10/12进化关系密切，属于Ⅰ亚组成员，可能通过细胞分裂素途径参与百合鳞片的生长发育，并调控ARR-A型蛋白的表达；LhGARP13与AtRR19同源，属于Ⅲ亚组，未鉴定出Ⅲ亚组成员。

GLK亚家族中，LhGARP10与AtGLK1同源，可能参与调控叶绿体发育、病毒侵染、干旱胁迫等多个途径；LhGARP4/8和LhGARP7/9分别与AtBOA和AtLUX同源，可能参与生物钟信号转导途径。NIGT1/HRS1/HHOs亚家族成员LhGARP1与AtHHO3同源，可能作为转录抑制因子参与磷获取和磷饥饿信号响应。PHR1/PHL1亚家族中，LhGARP6与AtPHR1同源，可能参与低磷响应途径；LhGARP17和LhGARP14/24分别与AtAPL1和AtPHL2同源,可能参与韧皮部发育途径；LhGARP19与AtγMYB2同源，可能抑制茎和花药次生细胞壁的增厚；LhGARP22/26/27/34与AtMYR1/2同源，可能调控弱光下开花时间；LhGARP15/20/21/25/29与AtPHL7同源，可能在DNA结合中发挥重要作用。KAN亚家族中，LhGARP3/11/12与AtKAN1同源，可能作为远轴面极性基因参与植物远轴面极性的维持及近轴面极性特征的抑制；LhGARP32与AtMYS2同源，可能调控叶蜡的生物合成，增强植物抗寒性。

2.3 ARR-B I的空间表达特征与克隆

在系统发育树的分析中，ARR-BⅠ亚组成员LhGARP5/31/30/33/3分别与卷丹LlRR1/2/10/11/12同源，在卷丹中冗余地调控珠芽的形成，为了研究ARR-BⅠ亚组成员在Sorbonne中的功能，对其进行了qRT-PCR分析，结果表明（图3），LhGARP5、LhGARP31、LhGARP33、LhGARP30和LhGARP3在花、叶和鳞中均有所表达，表达水平存在差异。

其中，LhGARP33、LhGARP30和LhGARP3的表达特征基本一致，表达水平大小为鳞片>花>叶。LhGARP5的表达水平大小为叶>花>鳞片，LhGARP31的表达水平大小为花>叶>鳞片。推测在Sorbonne中，LhGARP33、LhGARP30和LhGARP3可能对鳞茎发育起重要作用，LhGARP5可能参与叶片的发育，LhGARP31可能在花中发挥主要作用。

为了解Sorbonne鳞片相关基因的序列特征，对LhGARP5/31/30/33/3进行克隆。使用卷丹引物（LlRR1/2/10/11/12-F/R，表2），在Sorbonne中未扩增到LhGARP5/31/30/33/3。将卷丹基因LlRR1/2/11与Sorbonne转录组数据库中的LhGARP5/31/33进行序列比对发现，卷丹的引物与Sorbonne转录组相应序列不完全匹配（图4-A、B、C）。重新设计引物后，在Sorbonne中依然没有扩增出LhGARP5/31/33（表2），更改模板浓度或使用1次PCR的产物为模板进行2次PCR，依然没有获得PCR产物，最终只有LhGARP30和LhGARP3成功扩增出目的条带。

最终获得长2 197 bp的LhGARP3序列，包括1 941 bp的CDS区，编码646个氨基酸，与LlARR12相似性为96.75%，存在21个SAP（单氨基酸多态性）位点（图4-D）。LhGARP30序列长1 459 bp，包括1 443 bp的CDS区，编码481个氨基酸，与LlARR10相似性为74.31%，存在1个小片段的插入和多个SAP位点（图4-E）。序列分析发现，LhGARP3和LhGARP30含有ARR-Bs的2个典型结构：磷酸受体结构域（REC domain）和B-motif结构域，REC结构域中存在金属位点（天冬氨酸D）、磷酸化结合位点（丝氨酸S）和YXXK功能域。

3 结论与讨论

GARP转录因子家族在植物的多种生理过程和非生物胁迫中发挥重要作用，已在拟南芥、玉米、番茄、黄瓜等多种植物中被研究。本研究共鉴定了34个GARP转录因子，与油菜（n=146）^[25]、茶树（n=69）^[26]和紫萍（n=35）^[3]等物种的GARP数量不同，这说明不同物种的转录因子家族成员数量存在差异。且本研究虽基于二代、三代转录组数据尽可能挖掘百合GARP转录因子，但百合全基因组库的缺少，仍限制了GARP转录因子的挖掘，这也可能是百合GARP数量较少的原因。所鉴定的百合GARP多为酸性蛋白、不稳定蛋白，均为亲水蛋白，与茶树^[26]和大豆^[27]GARP家族的蛋白理化性质相似。亚细胞定位预测表明，有2个GARP转录因子定位于叶绿体，3个定位于细胞质，其他29个均定位于细胞核，可见GARP家族执行功能的位置具有多样性。

GARP一般可分为5个亚家族：ARR-B、GLK、KAN、NIGT1/HRS1/HHO和PHR1/PHL1，百合也是如此（图2）。亚家族数量分布KANs、ARR-Bs和PHR1/PHLa1s多于NIGT1/HRS1/HHOs和GLKs，与茶树^[26]、大豆^[27]和紫萍^[3]等亚家族数量分布规律一致。进化结果预测了34个百合GARP的功能，可能参与鳞片生长发育、生物钟调节、磷饥饿信号响应、硝酸盐转运途径、韧皮部发育、光影响的开花时间、叶极性形成等多个过程。

基因的表达模式是预测基因功能的重要依据之一，组织差异表达暗示基因可能发挥调控作用的部位^[28-29]。卷丹是亚洲百合的亲本之一，而Sorbonne属于东方百合。在Sorbonne中，LhGARP5在叶中高表达，在花中次之，在鳞片中低表达，与卷丹同源基因LlRR1在叶高表达，在花和鳞片中低表达的结果一致。LhGARP31在花中表达量较高，在叶和鳞中低表达，与卷丹同源基因LlRR2在叶高表达，在花和鳞片中低表达的结果不一致。在Sorbonne中，LhGARP33/30/3在鳞片中表达量最高，在花中次之，在叶中低表达。在卷丹中，LhGARP33同源卷丹基因LlRR11在花药高表达，在花、叶和鳞片中均低表达，LhGARP30同源基因LlARR10在营养器官中均高表达（根>茎>幼叶>鳞片）^[26]和LhGARP3同源基因LlARR12在鳞片中表达量最高，在叶和花中表达量较低^[26]，与本研究结果一致。百合Sorbonne和卷丹同源基因表达水平的差异可能是由基因型不同所致，在Sorbonne鳞片发育中，LhGARP33/30/3可能发挥重要作用。

ARR-Bs在细胞分裂素介导的植物根系生长和发育中发挥重要作用^[4-5]，其中ARR-BⅠ成员在卷丹中参与珠芽的形成^[26]。本研究在Sorbonne中鉴定到了5个ARR-BⅠ组成员LhGARP5/31/30/33/3，分别与卷丹LlRR1/2/10/11/12同源，对LhGARP5/31/30/33/3进行克隆，最终只有LhGARP3和LhGARP30成功克隆。LhGARP3和LhGARP30氨基酸序列具有ARR-Bs典型的REC domain及金属和磷酸化结合位点。LhGARP3和LhGARP30与卷丹同源蛋白存在SAP位点的差异，说明不同百合ARR-B基因的序列存在差异，可能使ARR-Bs在百合中发挥不同功能。

综上所述，本研究首次在百合中对转录因子家族进行了系统研究，共鉴定了34个百合GARP转录因子，分为5个亚家族。通过与拟南芥GARP的比较分析，预测百合GARP可能参与生长发育、生物钟调节、开花转化、激素运输、非生物胁迫等多个途径。ARR-BⅠ成员LhGARP33、LhGARP30和LhGARP3可能作为关键基因在Sorbonne鳞片发育过程中发挥主要作用。本研究结果为全面了解百合GARP转录因子提供了基础资料，为探索Sorbonne百合鳞片生长发育机制奠定了一定基础。

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基金资助

山西省基础研究计划自然科学研究面上项目(20210302123416)

山西农业大学2023年‘特优’农业科技支撑工程(TYGC23-64)

山西农业大学横向科技项目(2023HX292)