苍耳不同溶剂提取物对棉铃虫的生物活性

Biological Activity of Different Solvent Extracts from Xanthium sibiricum on Cotton Bollworm

摘要

棉铃虫是一种高度适应性害虫，它通过啃食花生叶片和钻蛀花蕾影响叶片光合作用和结实，导致花生产量大幅下降，可使花生减产20%~50%，甚至导致花生绝收。为减少花生田化学农药使用量，保护生态环境，以苍耳为材料，通过喷雾法和浸叶法研究苍耳不同溶剂甲醇、氯仿、乙酸乙酯提取物对棉铃虫幼虫的杀虫活性。结果发现，苍耳不同溶剂提取物对棉铃虫3龄幼虫均有触杀、拒食、胃毒和生长抑制作用，提取物浓度越高，效果越明显，其中氯仿提取物作用效果好于甲醇提取物和乙酸乙酯提取物。表明苍耳活性成分在不同溶剂中的溶解度存在差异，从而影响其对棉铃虫的毒性效果。氯仿提取物72 h后触杀致死中浓度（LC₅₀）为0.246 5 g/L；24 h的选择性拒食中浓度（AFC₅₀）为0.188 0 g/L，非选择性AFC₅₀为0.188 7 g/L；氯仿提取物处理7 d后胃毒LC₅₀为0.389 7 g/L；氯仿提取物处理72 h后对棉铃虫生长的IC₅₀为0.011 2 g/L，表明该提取物不仅能致死幼虫，还能显著抑制其生长。因此，苍耳氯仿提取物对棉铃虫幼虫具有较高的杀虫活性，苍耳作为一种植物源农药具有研发潜力。

Abstract

Cotton bollworm(Helicoverpa armigera(Hübner)), as a pest with high adaptability, impacts photosynthesis and fruit of peanuts by feeding on foliage and boring the flower buds resulting in a significant decrease in peanut yield. The pest can reduce the peanut yield by 20% to 50%, and even lead to peanut failure in severe cases. In order to reduce the use of chemical pesticides in peanut fields and protect the ecological environment, in this study, using Xanthium sibiricum as the material, the insecticidal activity of Xanthium sibiricum extracts against cotton bollworm larvae was determined by the spray method and leaf soaking method. The results showed that extracts from different solvents of Xanthium sibiricum had contact killing, antifeedant, gastric toxicity, and growth inhibition effects on the 3rd instar larvae of cotton bollworm. The higher the concentration of the extracts were, the more obvious the effect was. Among them, the effect of chloroform extract against cotton bollworms was better than that of methanol extract and ethyl acetate extract. This indicated that the active components solubilities of Xanthium sibiricum were different in various solvents, thereby its toxicity against cotton bollworm larvae was affected. The contact-killing lethal concentration(LC₅₀) of chloroform extract after 72 h was 0.246 5 g/L. The concentration of selective antifeedant activity(AFC₅₀) was 0.188 0 g/L at 24 h, and the concentration of non-selective AFC₅₀ was 0.188 7 g/L. After 7 days of treatment with chloroform extract, the LC₅₀ of gastric toxicity was 0.389 7 g/L. After 72 h of treatment with chloroform extract, the IC₅₀ was 0.011 2 g/L. This indicated that the extracts not only killed larvae but also significantly inhibited their growth. Therefore, the chloroform extract of Xanthium sibiricum had high insecticidal activity against cotton bollworm larvae, and Xanthium sibiricum had potential for research and development as a plant-based pesticide.

关键词

苍耳 / 提取物 / 棉铃虫 / 浸叶法 / 杀虫活性

Key words

Xanthium sibiricum / extracts / Helicoverpa armigera / leaf soaking method / insecticidal activity

Author summay

朱秀苗，高级农艺师，硕士，主要从事植物保护研究工作，E-mail：[e-mail]

棉铃虫（Helicoverpa armigera（Hübner））属鳞翅目夜蛾科，寄主植物种类200种以上^[1]，作为一种具有高度适应性的害虫，在华北花生种植区频繁发生，通过啃食叶片和钻蛀花蕾影响叶片光合作用和花生结实，严重时会造成大幅度减产^[2-3]。为了控制棉铃虫的危害，目前普遍采用化学农药进行防治。然而，化学农药的长期使用导致棉铃虫对有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药产生较高水平的抗性，农药残留也成为影响农产品质量安全及生态环境安全性的重要因素^[4-6]。因此，寻找高效、环境友好型杀虫剂防治棉铃虫显得尤为迫切。植物源杀虫剂作为一种环保友好型农药备受关注。植物源杀虫剂由从植物中提取的植物次生代谢物制成，具有多种生物活性物质，可通过忌避、拒食、触杀和抑制生长发育等多种方式对害虫产生作用，被誉为“环境和谐农药”^[7-8]。

苍耳（Xanthium sibiricum Patfin）为菊科（Compositae）苍耳属（Xanthium）1年生草本植物，全草均可入药^[9]。近年来，苍耳作为一种植物源农药在抗菌、除草、杀虫等方面的作用受到学者们的广泛关注，取得一系列显著研究成果。马丽等^[10]对苍耳的水提取物及乙醇提取物在抗真菌、除草、杀虫方面的作用进行研究，结果表明，苍耳的水提取物具有一定的除草潜力，苍耳的乙醇提取物具有毒杀棉铃虫及抑制小麦颖枯菌和小麦赤霉菌的潜力；何源等^[11]选取苍耳全草3种萃取相研究其对4种植物病原真菌的抑制作用，结果发现，苍耳提取物对植物病原真菌也具有明显的抑制作用；苍耳茎叶的提取物也可满足一些常见病虫害的生物防治需求^[12]。但目前仅限于苍耳果实单一溶剂粗提物对棉铃虫的生物活性方面的研究^[13-14]，缺乏苍耳全草不同溶剂精提物对棉铃虫生物活性的详细研究。

在前人研究的基础上，本试验研究苍耳全草甲醇、氯仿、乙酸乙酯不同溶剂精提物对棉铃虫生物活性的影响，进一步明确苍耳作为植物源农药开发利用的潜在应用价值，以期为植物源农药的开发提供新的参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

棉铃虫（Helicoverpa armigera（Hübner））采自新泰市未施用农药的花生田内。将棉铃虫置于人工气候箱中，在（25±1）℃、相对湿度为70%~80%、L∶D=12 h∶12 h条件下，以花生叶续代饲养。挑取发育健康、大小相近的3~5龄幼虫进行试验。

苍耳采自新泰市境内，选择高度1 m左右，大小1.0 cm×0.5 cm左右的成熟期苍耳开展试验。将苍耳洗净后晾干，45 ℃恒温烘干至脆，粉碎后过0.42 mm筛，将粉末放在阴暗处，密封后备用。

1.2 试验试剂及仪器

水、乙醇、氯仿、甲醇、乙酸乙酯。人工气候箱、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、植物粉碎机、电子天平、旋转蒸发仪、超声波振荡仪、直径为9 cm的培养皿、圆形打孔器（φ=1.5 cm）。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物的制备

称取50 g苍耳全草干粉，加入80%乙醇400 mL加热回流2 h，过滤，滤渣再用8倍体积的80%乙醇回流提取2 h后过滤。将2次滤液合并，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，溶剂蒸干后得到苍耳乙醇提取物，将提取物置于4 ℃冰箱中。

将苍耳乙醇提取物加8倍体积的蒸馏水，超声波振荡热溶后装入分液漏斗，分别用等体积甲醇、氯仿、乙酸乙酯3种溶剂萃取，每个处理重复3次，将各萃取液放入旋转蒸发仪中，减压后浓缩至稠膏状，将提取物保存于4 ℃冰箱中。称取各浓缩浸膏，分别用其提取溶剂定容至0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 g/mL。

1.3.2 提取物的生物活性测定

1.3.2.1 提取物对棉铃虫的触杀作用

采用喷雾法进行。将配制好的不同浓度的提取物依次均匀用喷雾器喷到供试3龄棉铃虫虫体上，每次处理30头，重复3次。以50%丙酮溶液作相同处理后，作为对照。处理后的幼虫放在培养皿中用新鲜无毒花生叶片继续饲养。将培养皿置于温度为25 ℃、相对湿度为65%、光照周期为L∶D=14 h∶10 h的人工气候箱中，记录处理24、48、72 h后试虫的死亡数量，计算出试虫的死亡率和校正死亡率。将校正死亡率转化为概率值，将浓度转化成对数后进行概率分析，通过SPSS v23.0非线性拟合计算致死中浓度（LC₅₀）。死亡标准：虫体失水皱缩，无法取食，触之不动^[15-16]。

1.3.2.2 提取物对棉铃虫的拒食作用

采用浸叶法进行。用直径1.5 cm的圆形打孔器将新鲜花生叶片打成叶碟，将叶碟放入各供试药液中浸泡5 s后取出；待叶碟上溶液挥发后，放入保湿培养皿中^[17]。选择性拒食活性试验：在每个培养皿中放入2片处理后的叶碟、2片对照叶碟，十字交叉型排列，在每个培养皿中放入饥饿了3 h的3龄棉铃虫幼虫30头，重复3次；对照以50%丙酮作相同处理。非选择性拒食活性试验：4片叶碟十字交叉排列放入培养皿中，每皿接入饥饿了3 h的3龄幼虫30头，3次重复；在人工气候箱中饲养24、48、72 h后，用坐标方格纸分别测定棉铃虫的取食叶面积，计算拒食率。将拒食率转化为概率值，将浓度转化成对数后进行线性回归，计算拒食中浓度（AFC₅₀）^[15-20]。

1.3.2.3 提取物对棉铃虫的胃毒作用

将干净的花生叶片在各供试药液中浸渍5 s，取出晾干后放入培养皿中，每皿接入饥饿了3 h的3龄幼虫30头，每组重复3次。对照以50%丙酮作相同处理。在人工气候箱中继续饲养3、5、7 d后记录中毒死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率^[21]。将校正死亡率转化为概率值，将浓度转化成对数后进行概率分析，计算致死中浓度（LC₅₀）。

1.3.2.4 提取物对棉铃虫生长发育的抑制作用

处理方法同1.3.2.3。对照以50%丙酮作相同处理。分别称取饲养24、48、72 h后幼虫体质量，计算抑制率^[22]。将抑制率转化为概率值，将浓度转化成对数后进行概率分析，计算抑制中浓度（IC₅₀）。

1.4 数据分析

试验数据采用统计软件SPSS v23.0非线性拟合，计算致死中浓度；采用SPSS v23.0统计软件进行差异显著性分析，用LSD法比较不同处理间的差异显著性（P<0.05）。

死亡率=死亡试虫数/供试总虫数×100%（1）

校正死亡率=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100%（2）

生长抑制率=（对照组平均体质量增加量-处理组平均体质量增加量）/对照组平均体质量增加量×100%（3）

选择性拒食率=（对照组平均取食面积-处理组平均取食面积）/（对照组平均取食面积+处理组平均取食面积）×100%（4）

非选择性拒食率=（对照组平均取食面积-处理组平均取食面积）/对照组平均取食面积×100%（5）

2 结果与分析

2.1 苍耳提取物对棉铃虫的触杀作用

由表1可知，3种不同苍耳提取物对棉铃虫3龄幼虫的触杀毒力随着处理时间的不同毒力强弱也不同。处理24 h时，触杀毒力大小为甲醇提取物>氯仿提取物>乙酸乙酯提取物；处理48 h时，毒力大小为氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物；处理72 h时，毒力大小为氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物。其中氯仿提取物处理72 h时的毒力最大，LC₅₀值为0.246 5 g/L；其次为氯仿提取物处理48 h时的毒力，LC₅₀值为0.482 3 g/L。

2.2 苍耳提取物对棉铃虫的拒食作用

苍耳提取物对棉铃虫的选择性拒食效果如表2所示，同种提取物随着作用时间的延长毒力逐渐减弱；处理24、48、72 h时，毒力大小依次为氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物。其中，氯仿提取物处理24 h时的毒力最大，AFC₅₀值为0.188 0 g/L；其次为甲醇提取物，处理24 h时的AFC₅₀值为0.237 8 g/L。

从表3可以看出，苍耳不同溶剂提取物对棉铃虫的非选择性拒食毒力，在处理24、48、72 h时，毒力大小依次均为氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物。甲醇提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物对棉铃虫在不同处理时间的非选择性拒食毒力大小均依次为24 h>48 h>72 h；其中氯仿提取物处理24 h时的毒力最大，AFC₅₀值为0.188 7 g/L，其次为氯仿提取物处理48 h时的毒力，AFC₅₀值为0.191 4 g/L。

2.3 苍耳提取物对棉铃虫的胃毒作用

处理1 d后调查，棉铃虫均未死亡。从表4可以看出，3种提取物对棉铃虫的毒力均随处理时间的延长而增大；处理时间相同时，各提取物对棉铃虫毒力大小表现为氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物。其中氯仿提取物处理7 d后对棉铃虫毒力最高，LC₅₀为0.389 7 g/L；其次为甲醇提取物，处理7 d后的毒力LC₅₀为0.558 3 g/L。

2.4 苍耳提取物对棉铃虫的生长抑制作用

从表5可以看出，甲醇、氯仿、乙酸乙酯3种苍耳提取物对棉铃虫幼虫的体质量增长均有一定的抑制作用，同种提取物处理不同时间后抑制毒力大小表现为72 h>48 h>24 h。相同处理时间，不同提取物之间抑制毒力大小表现为氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物。其中，氯仿提取物处理72 h后抑制毒力最高，IC₅₀为0.011 2 g/L；其次为甲醇提取物处理72 h后的毒力，IC₅₀为0.106 3 g/L。

3 结论与讨论

棉铃虫是一种全球范围内广泛分布的农业害虫。目前，化学农药防治仍是防治这一害虫的主要措施^[23-24]，但是随着棉铃虫不断进化，农药使用不规范、利用率低，其对杀虫剂产生抗药性越来越强并呈现出了逐年递增的趋势^[5]。随着各级政府对农业面源污染治理及农药使用量零增长等政策的出台，寻找环境友好型杀虫剂成为害虫防治的一个重要方向。植物源农药因其作用机制特殊、靶标专一性强，对环境安全友好，越来越受到研究者们的青睐^[15，25-26]。

植物源农药的主要活性成分是天然存在的植物次生代谢产物，对昆虫内部新陈代谢起到干扰作用，使昆虫产生拒食、体质量减轻、难以蜕皮、不能正常化蛹直至死亡等，其作用机理有别于常规农药，因此，不易使害虫产生抗药性。植物源农药来源于自然，在自然环境下易降解，不易产生残留，因此，对环境及作物较安全。熊丽霞^[14]研究发现，川乌、苍耳、刀豆、川楝和博落回对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒杀作用及对棉铃虫和甜菜夜蛾4龄幼虫的抑制生长作用表现出较好效果。马丽等^[10]研究也发现，苍耳乙醇提取物对棉铃虫有100%的毒杀作用。

本研究结果显示，3种不同苍耳提取物对棉铃虫幼虫触杀、拒食、胃毒和生长发育抑制方面的生物活性均表现出良好效果，其中，氯仿提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物，提取物浓度越高，效果越明显。在4种作用方式研究中，抑制效果表现最为显著，抑制中浓度（IC₅₀）为0.011 2 g/L。造成这种现象的原因可能是提取物对试虫的拒食反应，使幼虫失去味觉，影响其正常的生长发育；也可能是由于提取物破坏了试虫的中肠组织，抑制解毒酶系而影响消化吸收，干扰呼吸代谢，使正常的生理生化反应受阻，生长发育受到抑制，形成畸形虫体。这与熊丽霞等^[14]的研究结果一致。此外，对于不同作用方式的处理时间进行了系统研究。本研究发现，在相同浓度下，随处理时间延长，触杀、胃毒和生长发育抑制效果逐渐增强，而拒食活性的效果逐渐减弱，具体机制还有待进一步研究。

本研究结果为苍耳作为植物源农药的进一步开发和利用提供了实践基础^[27]。未来可以重点关注苍耳提取物的主要活性成分及其在农田环境中的长期效应，这对绿色农业发展具有深远意义。

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基金资助

青海省2023年第一批中央引导地方科技发展资金计划项目(2023ZY019)