成年鸭睾丸发育差异分析

Differential Analysis of Testicular Development in Adult Ducks

摘要

为探讨不同精液量鸭的睾丸发育差异，以成年高邮鸭为研究对象，根据个体精液量体积分为精液量多和精液量少组，分别称量2组鸭的体质量和睾丸总质量；采用ELISA法检测2组血液中的睾酮含量；对2组鸭睾丸组织石蜡切片后显微观察并测量睾丸曲精小管面积、单位面积间质细胞数量，比较2组间的差异，并进行相关性分析；最后利用荧光定量PCR技术检测2组鸭睾丸组织中FSHR、LHR、AMH、StAR的表达水平。结果表明，精液量多组的睾丸总质量、睾丸体积和睾酮含量显著高于精液量少组的睾丸总质量、睾丸体积和睾酮含量；体质量、睾丸指数、曲精小管面积和单位面积间质细胞数量在2组间无显著差异。相关性分析结果表明，精液量与睾丸体积呈显著正相关，睾酮含量与睾丸总质量和睾丸体积呈显著正相关。精液量多组中睾丸发育相关基因FSHR、LHR、AMH、StAR的mRNA表达水平均显著高于精液量少组。综上所述，公鸭的精液量多少与睾丸总质量和睾酮含量有关，而且睾丸发育相关基因FSHR、LHR、AMH、StAR在鸭睾丸发育和精子生成过程中可能发挥了重要作用。

Abstract

In order to explore the differences in testicular development in ducks with different semen volumes, in this study, adult Gaoyou ducks were taken as the research object. These ducks were divided into two groups：high semen volume and low semen volume groups. The weight and testicular weight of the two groups of ducks were measured, respectively. ELISA method was used to detect testosterone levels in the blood of the two groups. Microscopic observation and measurement of the area of the seminiferous tubules and the number of interstitial cells per unit area were performed after paraffin sectioning on the two groups of duck testicular tissue. The differences between the two groups were compared and correlation analysis was conducted. Finally, fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression levels of FSHR, LHR, AMH, and StAR in the two groups of duck testicular tissues. The results showed that the testicular weight, testicular volume, and testosterone levels in the high semen volume group were significantly higher than those in the low semen volume group. There was no significant difference in body weight, testicular index, seminiferous tubule area, and number of interstitial cells per unit field between the two groups. Correlation analysis showed that semen volume was significantly positively correlated with testicular volume. While testosterone content was significantly positively correlated with testicular weight and volume. The expression levels of testicular development related genes FSHR, LHR, AMH, and StAR. were significantly higher in the high semen volume group than those in the low semen volume group. These results indicated that the semen volume in male ducks was related to testicular weight and testosterone content. And testicular development related genes FSHR, LHR, AMH and StAR may play important roles in duck testicular development and spermatogenesis.

Graphical abstract

关键词

高邮鸭 / 睾丸 / 发育 / ELISA法 / 相关性分析

Key words

Gaoyou ducks / testis / development / ELISA method / correlation analysis

Author summay

陶志云，副研究员，博士，主要从事家禽免疫及遗传育种研究，E-mail：[e-mail]

随着人们生活水平的提高，对家禽产品（肉和蛋）的消费量逐渐增加，提高家禽亲本的生育能力以产生更多的后代，从而生产出更多的禽产品以满足消费需求是有效手段之一。家禽亲本的生育能力包括雄性和雌性的生育能力，但用于自然或人工授精的雄性数量较少，通过提高雄性家禽的精液量、精子浓度、活力等是提高雄性生育能力的有效手段。

睾丸是雄性动物的生殖器官，具有产生雄激素和雄性生殖细胞的功能，同时具有产生精子、储存精子的重要作用^[2]。研究表明，绝大多数哺乳动物的睾丸大小与繁殖能力密切相关，繁殖能力差常常与睾丸小有关^[3]。模式动物粪蝇上的一项研究表明，睾丸较大组的精子竞争能力明显高于小睾丸组^[4]。因此，动物睾丸大小的研究对于发育生物学和繁殖学有重要意义。

研究表明，采用组织学观察不同发育时期的绍兴麻鸭睾丸形态，绍兴麻鸭睾丸及曲细精管的发育具有阶段性^[5]。利用形态学和组织学的方法，初步探讨了连城白鸭睾丸胚后发育和性成熟特点，结果表明，睾丸大小、质量、睾丸指数及睾丸曲精小管组织结构均呈明显的日龄变化^[6]。在鸭的生产过程中，发现不同成年鸭的精液量差异较大，推测这可能与睾丸的大小有关。江苏省家禽科学研究所水禽育种与生产研究组前期在苏邮1号蛋鸭中的研究也表明，睾丸重量与精液量呈极显著正相关^[7]。

为了进一步明确精液量与睾丸大小以及相关因素的相关性，本研究以成年高邮鸭为对象，探讨了精液量差异显著的2组鸭的睾丸质量、睾丸组织形态学、血清睾酮以及基因表达差异，旨在分析成年鸭精液量差异的相关机制。

1 材料和方法

1.1 试验动物

300日龄的高邮鸭公鸭40只，来自江苏高邮鸭发展集团有限公司。同一阶梯笼养鸭舍单个笼养，正常光照和饲养条件。

1.2 试验方法

1.2.1 分组与样品采集

通过人工按摩+诱导的方法，采集各鸭的精液于小烧杯中，测量精液量。采集所有个体的血液，分离血清，用于睾酮含量检测。经测量，精液量分布在0.023~0.672 mL，平均精液量为0.299 mL，其中，精液量在0.2 mL以下的鸭为精液量少组，0.35 mL以上的鸭为精液量多组，具体鸭的精液量分布情况见图1。每组各取10只称量体质量，采集血液，屠宰后采集睾丸并称质量，测量睾丸的横径、纵径及宽度。一侧睾丸取部分组织进行RNA提取，另一侧睾丸整个置入4%多聚甲醛中固定，用于石蜡切片。

1.2.2 睾丸体积计算

采用Lamber公式计算睾丸体积。

睾丸体积（mm³）=长度×宽度×厚度×0.71（1）

式中，0.71为矫正系数。

1.2.3 睾丸组织切片制作

2组各取5个样本进行睾丸组织切片的制作，睾丸样本经4%多聚甲醛固定，状态良好后，对组织进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片等，正置白光拍照显微镜（Nikon，Japan）拍照，Image-Pro Plus 6.0分析软件测量曲精小管面积，每个个体拍摄5张图片，每张图片测量20个曲精小管（40×），同时对每张切片的间质细胞进行计数（200×）。

1.2.4 血清睾酮含量测定

将采集的抗凝血在离心机中1 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，采用Elabscience^® QuicKey Pro鸡睾酮酶联免疫吸附测定试剂盒测定睾酮含量。

1.2.5 引物设计

以β-actin为内参，鸭FSHR、LHR、AMH、StAR以及β-actin的mRNA引物序列^[8-9]如表1所示。

1.2.6 RNA提取和反转录

采用RNA EasyFast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP451）提取RNA，RNA经质量检测合格后，用Fastking cDNA第1链试剂盒（去基因组）（KR116）将RNA反转录成cDNA。

1.2.7 荧光定量PCR检测

采用SuperReal荧光定量预混试剂（TIANGEN，FP215)，检测睾丸中FSHR、LHR、AMH及StAR的表达。反应体系为20 µL，包括2×SuperReal Color PreMix 10 µL，正反向引物共0.8 µL，cDNA模版2 µL，50×ROX Reference Dye 0.4 µL，ddH₂O 6.8 µL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，40个循环；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。

1.3 数据分析

按照2^-△△Ct的方法计算所测基因的相对表达量。所有试验数据用SPASS 20.0软件处理，进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 成年鸭睾丸发育差异

从表2可以看出，成年公鸭的睾丸质量、睾丸体积、精液量在精液量少和精液量多组间差异显著（P<0.05）；精液量多组的鸭体质量和睾丸指数均略高于精液量少组，但均无显著差异；精液量多组的血清中睾酮含量显著大于精液量少组（P<0.05）。

2.2 成年鸭睾丸组织学差异

成年鸭睾丸组织切片观察和统计发现（图2，表3），成年鸭精液量少组、精液量多组睾丸组织的曲精小管面积、单位面积间质细胞数量差异均未达显著水平。

2.3 成年鸭睾丸各指标相关性分析

对成年公鸭各指标进行相关性分析，结果如表4所示，体质量与所有指标差异均不显著；睾丸总质量与睾丸体积、睾丸指数和睾酮含量呈显著正相关（P<0.05）；睾丸体积与睾丸总质量、睾酮含量和精液体积呈显著正相关（P<0.05）；睾丸指数与睾丸总质量、曲精小管面积呈显著正相关（P<0.05）；曲精小管面积与睾丸指数呈显著正相关（P<0.05）；单位视野内间质细胞数量与所有指标均无显著相关性；精液量与睾丸体积显著相关（P<0.05）；睾酮含量与睾丸总质量、睾丸体积显著相关（P<0.05）。

2.4 公鸭精液量多少组基因表达差异分析

公鸭精液量多组和精液量少组睾丸发育相关基因表达结果如表5所示，FSHR、LHR、AMH及StAR的表达量在精液量多组均显著高于精液量少组（P<0.05）。

3 结论与讨论

精子量的多少是评价精液质量好坏的一个重要指标。研究表明，杜洛克、长白和大白3个品种的公猪大小均与精子数和有效精子数呈正相关^[10]。本课题组在苏邮1号蛋鸭的研究表明，睾丸质量与精液量呈极显著正相关^[7]。本研究结果表明，精液量多组睾丸质量更大，体积更大，睾丸质量和睾丸体积与精液量呈正相关，与上述研究结果一致。研究表明，睾丸过小的公鸡（<6 g）基本上不产生任何精液，没有受精能力，且种公鸡的体质量与睾丸质量呈正相关^[11]。鸭的体质量在精液量多组略高于精液量少组，二者间无显著相关性，这一研究结果与鸡的研究结果略有不同，但总得来说，体质量大的鸭精液量要高于体质量小的鸭精液量，趋势基本一致。

睾酮是雄性动物体内主要的性激素，具有促进和维持雄性第二性征发育的功能。在赤鹿群中的研究表明，睾酮与精液质量之间无显著相关性，主要与精子产量有关^[12]。但最新在斑雀中的研究却表明，睾酮水平与精子速度和活动精子比例呈正相关^[13]。公猪的研究表明，睾酮含量与精液品质呈弱相关,睾酮含量与睾丸体积不相关,精液品质与睾丸体积不相关^[14]。这些研究结果表明，不同物种中的结果差异较大，这可能与品种、生殖激素睾酮的个体含量差异较大有关，也有可能与睾酮的检测方法不同等有关。因此，针对不同物种，仍需对睾酮含量与睾丸发育及精液品质的关系进行更多研究，以进一步确定三者间的关系。研究表明，公鸡生长期的睾丸迅速发育，血浆中的主要生殖激素含量增加^[15]。本研究表明，成年高邮鸭的睾酮水平高低与鸭睾丸质量呈显著正相关，说明睾酮含量可以促进睾丸发育，同时睾丸的生长也是睾酮含量升高的重要条件。

FSH（促卵泡素）和LH（促黄体素）分别通过与其受体FSHR和LHR的结合，在卵泡发育和精子发生中发挥着重要作用，早期在大鼠中的研究表明，出生后的小鼠睾丸FSHR mRNA的水平呈动态变化，在青春期和成年期均有一次分泌高峰^[16]。FSHR和LHR在不同年龄牦牛睾丸发育中呈先上升后下降的趋势，5岁时表达量最高^[17]。AMH（抗苗勒管激素）由睾丸间质细胞表达，参与睾丸的分化和发育^[18-19]。StAR类固醇激素合成急性调节蛋白，介导类固醇激素底物胆固醇从线粒体外膜转运到线粒体内膜中的限速步骤^[20]，而类固醇激素是一类重要调节分子，在肾上腺、卵巢、胎盘、大脑和皮肤的类固醇生成细胞中合成，并影响一系列发育和生理过程^[21]。StAR的表达与活化在机体生殖功能的正常维持中发挥重要调控作用，在禽类中的研究表明，StAR的转录和翻译对于排卵前血清孕酮的激增是必要的，而且StAR的表达受到FSH和LH的调控^[22]。在雄性脊椎动物中，StAR在睾丸间质细胞中表达，并发挥重要作用^[23-24]。在不同阶段樱桃谷公鸭基因表达检测中发现，从75日龄到165日龄，随着日龄的增加，FSHR、LHR、AMH及StAR等4种基因的表达也快速增加^[9]。本研究在高邮鸭公鸭中发现，FSHR、LHR、AMH及StAR的基因表达在精液量多组均显著高于精液量少组，表明其在睾丸功能的维持中也发挥重要作用。

综上所述，本研究发现不同精液量组的高邮鸭睾丸质量、睾丸体积和睾酮含量均有显著差异，而且精液量的多少与睾丸体积显著正相关，睾酮含量与睾丸质量和睾丸体积显著正相关，睾丸发育相关基因FSHR、LHR、AMH、StAR在不同精液量组间差异显著，该研究结果为鸭睾丸发育的分子机理研究奠定了理论基础。

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基金资助

“十四五”重点研发专项(2022YFD1300100)

扬州市科技计划项目(YZ2022050)

江苏省现代农业（水禽）产业技术体系(JATS［2023］365)

国家家养动物种质资源库（2024）