抗白粉病小偃麦1St异附加系的分子细胞遗传学鉴定

Molecular Cytogenetic Identification of Wheat-Thinopyrum ponticum 1St Disomic Addition Line with Powdery Mildew Resistance

摘要

白粉病是小麦最主要的病害之一，严重威胁小麦产量。挖掘新的抗病基因、创制并利用新的抗病种质，是提高小麦抗病性的有效途径。十倍体长穗偃麦草蕴含丰富的优良基因，是小麦遗传改良的宝贵基因库。对抗白粉病八倍体小偃麦SNTE20与普通小麦杂交选育出的小偃麦新种质SN21147白粉病抗性进行鉴定，结果显示，SN21147在苗期表现免疫，成株期表现高抗；GISH-FISH鉴定发现，SN21147在42条小麦染色体的基础上，附加了1对长穗偃麦草染色体，且在其形成过程中，6A、7A、7B、1D、2D和7D等染色体发生了明显的结构变异。利用内含子靶向（IT）分子标记对SN21147及其亲本进行扩增，获得12个外源特异标记，其中6个来自拟鹅观草St基因组的第1部分同源群。因此，SN21147为附加了1对长穗偃麦草1St染色体的双体异附加系；此外，SN21147的植株较矮（56.7 cm），与普通小麦亲本SN637相比，分蘖数和每穗粒数分别增加44.4%和4.3%。综上，SN21147可作为抗白粉病新种质应用于小麦遗传改良。

Abstract

Wheat powdery mildew, causing serious yield loss of wheat, is one of the major diseases in wheat-planting areas around the world. Mining new disease-resistant genes, creating and utilizing new disease-resistant germplasms are considered to be the most effective ways to improve the disease resistance of wheat. Thinopyrum ponticum carries many useful genes and serves as a valuable gene bank for wheat genetic improvement. In the present study, new Trititrigia germplasm SN21147 was developed by crossing wheat-Th. ponticum octoploid SNTE20 with common wheat. Disease evaluation showed that SN21147 was immune and high resistant to powdery mildew at the seedling and adult stage, respectively. Sequential GISH-FISH found that SN21147 had 42 wheat chromosomes plus a pair of Th. ponticum chromosomes. Furthermore, chromosome structural variations were also detected on the wheat chromosomes 6A, 7A, 7B, 1D, 2D, and 7D. Using IT(Intron Targeting) marker, twelve exogenous specific markers were obtained, six of which belonged to the St genome and homoeologous group one of Pseudoroegneria spicata. These results suggested that SN21147 was 1St disomic alien addition line. Besides, SN21147 had a lower plant height(56.7 cm), more tillers and grains per spike compared to its common wheat parent SN637, the two traits increased by 44.4% and 4.3%. Therefore, SN21147 could be utilized as a new germplasm with powdery mildew resistance in wheat genetic improvement.

Graphical abstract

关键词

长穗偃麦草 / 白粉病 / 原位杂交 / 分子标记

Key words

Thinopyrum ponticum / powdery mildew / in situ hybridization / molecular marker

小麦（Triticum aestivum L.，2n=6x=42，AABBDD）是世界三大粮食作物之一，全球约35%~40%的人口以小麦为主食^[1]。现代育种和栽培技术的共同进步使得小麦产量从2000年的9 963.58万t增加到2024年的13 822万t^[2]。但小麦生长过程中容易受到病虫害的威胁，其中，小麦白粉病是由布氏白粉病菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）引发的气传真菌性病害，主要侵染小麦叶片，进而影响小麦产量和品质^[3-5]。白粉病在我国小麦上每年的发生面积约为600万hm²，造成5%~20%的产量损失，并且由于新的生理小种不断出现，具有全生育期抗性的小麦品种数量急剧减少^[6]。大量理论研究和生产实践表明，培育并推广持久抗病的小麦新品种是解决上述问题最直接且经济有效的措施之一。

迄今为止，在国际上已有Pm1~Pm71等抗白粉病基因被正式命名，其中，Pm1~Pm5、Pm8、Pm12、Pm13、Pm17、Pm21、Pm36、Pm24、Pm41、Pm46、Pm55、Pm57、Pm60和Pm69等被克隆^[7-17]。在已报道的抗白粉病基因中，仅Lr34/Yr18/Sr57/Pm38、Lr34/Yr29/Sr58/Pm39和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46兼抗多种病害^[18-20]。随着新型病原菌不断出现，现有抗病基因的抗性正在逐步丧失。例如，位于黑麦1R染色体短臂上的Pm8曾被广泛应用，但现已对新的白粉病菌株丧失抗性^[21]。此外，受人工选择的影响，现代小麦育种的遗传多样性降低，遗传资源短缺，不利于持久抗病耐逆新品种的培育与推广，急需发掘新的抗病基因，拓宽小麦抗病育种资源。

小麦的野生近缘物种繁多且具有丰富的遗传多样性，目前已有20多个小麦野生近缘物种与小麦远缘杂交成功^[22]。其中，黑麦（Secale cereale L.，2n=2x=14，RR）、冰草（Agropyron cristatum L.，2n=4x=28，PPPP）、二倍体簇毛麦（Haynaldia villosa L.，2n=2x=14，VV）和偃麦草属（Thinopyrum）等多个小麦近缘种对白粉病表现出良好的抗性^[23-25]。十倍体长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum，2n=10x=70，E^eE^eE^bE^bE^xE^xStStStSt或JJJJJJJ^SJ^SJ^SJ^S）为多年生草本植物，具有抗病、耐逆、多花多实等多种优良性状，是改良小麦抗性、增强小麦环境适应性的重要基因资源。利用远缘杂交和染色体工程技术，将长穗偃麦草中的抗病基因导入小麦中，可以丰富小麦抗病育种的种质资源，进而培育出高产、抗病的小麦新品种。早在20世纪50年代，我国就开始了利用长穗偃麦草改良小麦的研究工作。李振声院士利用长穗偃麦草与普通小麦杂交，创制出一批八倍体小偃麦、异附加系、异代换系和易位系等^[26]，进而培育出以小偃6号为代表的一系列小偃麦新品种^[27]。

为发掘抗白粉病新基因、创制抗白粉病新种质，山东农业大学农学院小麦育种全国重点实验室前期利用十倍体长穗偃麦草与烟农15、山农辐63杂交、回交，创制了抗白粉病八倍体小偃麦SNTE20^[28]。本研究对八倍体小偃麦SNTE20与自育高代品系SN637杂交育成的异染色体系SN21147进行白粉病抗性鉴定、细胞遗传学鉴定、分子标记分析以及农艺性状评估，旨在为其在小麦遗传改良中的进一步研究与利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料包括十倍体长穗偃麦草、八倍体小偃麦SNTE20，普通小麦山农辐63、烟农15、SN637，小偃麦新种质SN21147，感病对照辉县红。它们均由山东农业大学小麦分子染色体工程研究团队创制或保存。白粉菌优势生理小种E09由中国农业科学院作物科学研究所李洪杰研究员惠赠。

1.2 白粉病抗性鉴定

1.2.1 白粉病苗期抗性鉴定

利用白粉菌生理小种E09对供试材料进行苗期抗病性鉴定，辉县红作为感病对照，具体操作方法参照ZHAO等^[29]的方法。将供试材料的种子种于5 cm×5 cm的塑料托盘上，每盘种植10株，于一叶一心期进行接种。当辉县红充分发病后，按0~4级记录反应型，其中，0~2级为抗病，3~4级为感病。

1.2.2 白粉病成株期抗性鉴定

将感病对照辉县红、SN21147及其亲本种植在山东农业大学农学实验站。试验采用随机区组设计，设置3次重复，每个材料按行长1.5 m、行距0.25 m播种3行，每5行种植1行感病对照辉县红，并在供试材料两侧垂直播种辉县红作为诱发行。诱发行发病后利用扫拂法接种，成株期白粉病鉴定具体操作标准参照LI等^[30]的方法。按0~4级记录反应型，其中，0~2级为抗病，3~4级为感病。

1.3 细胞学鉴定

1.3.1 根尖取样

将待鉴定的种子于室温条件下浸泡12 h后，布种于湿润的培养皿中，并转移至25 ℃培养箱恒温培养，待根伸长至2 cm时加入0.1 mmol/L甲基胺草磷溶液浸泡2 h。清水冲洗3次后，取根置于盖子打孔的离心管中，喷湿。将离心管置于一氧化二氮（N₂O）中，1.0 MPa处理2 h。处理结束后，冰上用90%冰醋酸固定8 min，转移至70%乙醇中，4 ℃存放备用。

1.3.2 染色体制片

将处理后的根取出，ddH₂O冲洗3次，切下根尖放入1%果胶酶和4%纤维素酶的混合液中，37 ℃水浴55 min后，冰上用70%乙醇冲洗3次。碾碎、离心并倒掉上清，加入100%冰醋酸，滴片，镜检。

1.3.3 原位杂交

基因组原位杂交（GISH）参照FU等^[31]方法。以Fluorescein-12-dUTP标记的十倍体长穗偃麦草基因组DNA为探针，以烟农15基因组DNA为封阻。荧光原位杂交（FISH）参照HUANG等^[32]方法。8个寡核苷酸组成的探针套包括TAMRA（红色）修饰的AFA1-4、AFA1-6、pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6和FAM（绿色）修饰的pSc119.2-1、（GAA）₁₀，所有探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在Olympus BX60型荧光显微镜下镜检并用SPOT CCD（SPOT Cooled Color Digital Camera）拍照。

1.4 分子标记分析

利用841对IT引物（Intron targeting primers）^[33]对供试材料基因组进行PCR扩增。扩增体系为10 µL，包括40 ng基因组DNA，7.5 μL的2×Power Taq PCR MasterMix，正反向引物（2.5 μmol/L）各1 μL，ddH₂O补齐至10 μL。PCR扩增产物经8%聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳检测后银染、显色，最后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察记录，分析扩增产物的片段大小。

1.5 农艺性状调查

于2022年在山东农业大学农学实验站对供试材料进行农艺性状调查。依据《小麦种质资源描述规范和数据标准》^[34]，调查SN21147、SNTE20和SN637的株型、穗型、株高、穗长、分蘖数、小穗数等主要农艺性状，每个供试材料调查10株，3次重复。

2 结果与分析

2.1 白粉病抗性鉴定

苗期对供试材料接种白粉菌生理小种E09，当感病对照辉县红完全发病时进行调查，结果显示（图1-A、表1），十倍体长穗偃麦草、SNTE20和SN21147表现免疫（IT=0），而普通小麦亲本SN637表现中感（IT=3），烟农15和山农辐63均表现高感（IT=4）。说明SN21147的苗期白粉病抗性可能来源于十倍体长穗偃麦草。

成株期白粉病抗性鉴定结果显示，十倍体长穗偃麦草和SNTE20对白粉病表现免疫（IT=0），SN21147表现高抗（IT=1），而普通小麦亲本SN637和烟农15表现为中感（IT=3），山农辐63表现高感（IT=4）（图1-B、表1）。据此推测，SN21147的成株期白粉病抗性可能来源于十倍体长穗偃麦草。

2.2 细胞学鉴定

以荧光标记的十倍体长穗偃麦草基因组DNA为探针、烟农15基因组DNA为封阻进行基因组原位杂交鉴定，发现SN21147含有42条被DAPI复染成蓝色的普通小麦染色体和2条呈现绿色杂交信号的十倍体长穗偃麦草染色体（图2-A）。

去除GISH信号后，利用8个寡核苷酸探针进行FISH分析，发现SN21147含有小麦全套染色体（1A~7A、1B~7B、1D~7D）和2条十倍体长穗偃麦草染色体，为小偃麦异附加系（图2-B）。将SN21147的FISH带型与其亲本进行对比，发现SN21147的6A染色体短臂末端红色信号缺失，1D染色体短臂末端出现红色信号，6B染色体随体中部与SNTE20相同，但与SN637相比缺失红色信号，7A染色体短臂末端与SN637相同，但与SNTE20相比缺失绿色信号，2D与7D染色体长短臂发生易位，形成2DS·7DL、7DS·2DL相互易位染色体，表明这些染色体在异附加系形成过程中发生了染色体结构变异（图2-C）。

2.3 分子标记分析

为明确SN21147的外源染色体来源，利用841对IT标记对SN21147及其普通小麦亲本基因组进行扫描，共筛选获得12个能够在十倍体长穗偃麦草、SNTE20和SN21147中扩增出特异条带，但在普通小麦亲本SN637中无目标条带的标记（图3）。进一步分析发现，在上述12个特异标记中，源于第一部分同源群的标记有9个，且其中6个能够在十倍体长穗偃麦草的原始亲本拟鹅观草St基因组中得到特异扩增（图3、表2）。因此，推测SN21147携带的长穗偃麦草染色体为1St，即SN21147为小麦-长穗偃麦草1St双体异附加系。

2.4 农艺性状分析

对SN21147及其亲本SNTE20和SN637的农艺性状进行调查（图4、表3）发现，SN21147的抽穗期和开花期与SN637相当，均早于八倍体小偃麦SNTE20。SN21147和SN637株型为中间，不同于松散型的SNTE20。SN21147株高为56.7 cm，明显矮于其亲本SNTE20（113.3 cm）和SN637（68.9 cm）。SN21147穗长（8.6 cm）均短于SNTE20（14.8 cm）和SN637（9.1 cm）。SN21147的每穗小穗数为21.0个，介于SNTE20（20.8个）和SN637（22.1个）之间。SN21147的分蘖数（11.7个）较SNTE20增加13.6%，较SN637增加44.4%。在每穗粒数方面，SN21147为67.5粒，较SNTE20和SN637分别增加7.0%和4.3%。上述结果表明，长穗偃麦草1St染色体不携带明显的遗传累赘。

3 结论与讨论

种质资源是小麦育种的基石，也是保障粮食^[35]安全的基础。截至目前，在长穗偃麦草发现并正式命名的11个抗病基因中，来自第2部分同源群的有抗白粉病基因Pm51^[36]、抗小麦条纹病毒基因Cmc2^[37]和抗条锈病基因Yr69^[38]；来自第3部分同源群的抗叶锈病基因Lr24^[39]和抗秆锈病基因Sr24^[40]；来自第6部分同源群的抗锈病基因Sr26和Sr61^[41]；来自第7部分同源群的抗叶锈病基因Lr19和Lr29^[42]、抗秆锈病基因Sr43^[43]和抗赤霉病基因Fhb7^[44]，尚无源于第1、第4和第5部分同源群的抗病基因被正式命名。WANG等^[45]创制了小麦-长穗偃麦草1J^S（1D）异代换系CH10A5，LI等^[46]创制了小麦-长穗偃麦草1J^S（1B）异代换系SN19647，尽管2个代换系中的1J^S染色体不同，但均对白粉病具有良好抗性。本研究中，SN21147是利用八倍体小偃麦SNTE20与普通小麦杂交创制的1St双体异附加系，苗期和成株期均对白粉病具有抗性，依据分子标记扩增结果推断，其抗性可能源于十倍体长穗偃麦草1St染色体。与CH7086^[36]、CH10A5^[45]、SN19647^[46]相比，SN21147携带的白粉病抗性与其所属染色体组或部分同源群不同，说明长穗偃麦草1St染色体可能携带新的抗白粉病基因。

与普通小麦亲本相比，SN21147还表现出矮秆、分蘖多、穗粒数多等优良特性，说明除抗白粉病基因外，1St染色体还可能携带产量相关性状优异基因。KRUPPA等^[47]将十倍体长穗偃麦草与中间偃麦草（Th. intermedium，2n=6x=42，J^rJ^rJ^vsJ^vsStSt或JJJ^SJ^SStSt）的杂种F₁与普通小麦杂交、回交，获得了一对具有4StS·1J^vsS罗伯逊易位染色体的异附加系GLA7，不仅对干旱和盐胁迫表现出较高耐性，还高抗小麦叶锈病。此外，ZHU等^[48]创制的小麦-长穗偃麦草7St（7B）异代换系CH1113-B13在成株期对叶锈病表现免疫。SN21147中的1St染色体是否具有抗旱、耐盐、抗锈病等其他优异性状，有待于进一步研究。

长穗偃麦草与普通小麦杂交可创制八倍体小偃麦、异附加系、异代换系、易位系和渐渗系等。其中，八倍体小偃麦一般含有14条外源染色体，综合农艺性状较差，通常作为桥梁亲本向小麦转移抗病、耐逆基因。异附加系与异代换系均携带整条外源染色体，将抗病等优异性状赋予小麦的同时，也可能因连锁累赘带来许多不利基因。创制仅含有目标基因的小片段易位系或渐渗系是提高异附加系和异代换系应用价值的有效途径。由于异附加系含有小麦全套染色体，在创制易位系或渐渗系的过程中，小麦原有优异基因丢失的概率较低。因此，与异代换系相比，更适合用于小片段易位系或渐渗系创制。目前，本课题组正在利用辐射诱变、中国春ph1b突变体诱导等方法，创制SN21147的1St小片段易位系和渐渗系，以期选育出农艺性状更好的抗病新种质。

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基金资助

山东省重点研发计划（重大科技创新工程）(2021LZGC009)