提高小麦面团特性的外源染色体及其特异分子标记开发

Development of Alien Chromosome for Improving the Characteristics of Wheat Dough and Its Specific Molecular Marker

摘要

为鉴定小麦近缘物种染色体系的面团特性，以中国春为对照，测定济麦22、济麦262以及19份中国春-近缘物种染色体附加系和易位系的面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数，利用87对第1同源群的PLUG引物对中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系及中国春进行分子标记筛选。结果表明，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系、中国春-粗穗披碱草1S^t附加系等材料的面团形成时间显著长于中国春；中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系、中国春-粗穗披碱草1H^tS附加系等材料的稳定时间显著长于中国春；中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系、中国春-希尔斯山羊草1S^s#1附加系等材料的粉质质量指数显著高于中国春，其中，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数最高，分别为8.10、10.73 min和159.7。引物TANC1089和TANC1142仅可以在中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系中扩增出长度分别为500 bp和750 bp的特异片段。综上所述，中国春-两芒山羊草1U^bi#1染色体导入小麦可显著提高小麦加工品质，建立的中国春-两芒山羊草1U^bi#1染色体分子标记TANC1089和TANC1142可用于小麦研究中两芒山羊草1U^bi#1染色质的追踪和鉴定。

Abstract

In order to identify the dough characteristics of the wheat related species chromosome lines, in this study, using Chinese Spring(CS) as the control, the dough formation time，stability time, and farinograph quality index of Jimai 22, Jimai 262, and 19 CS related species chromosome additions and translocation lines were measured, and 87 pairs of PLUG primers from the first homologous group were used to conduct molecular marker screening of the CS-Aegilops biuncialis 1U^bi#1 addition line and CS. The results showed that the dough formation time of the materials such as CS-Aegilops biuncialis 1U^bi#1 addition line, CS-Ae. geniculate 1M^g#1 addition line, and CS-Elymus trachycaulus 1S^t addition line was significantly longer than that of CS. The stability time of the materials such as the CS-Ae. biuncialis 1U^bi#1 addition line, CS-Ae. geniculate 1M^g#1 addition line, and CS-E. trachycaulus 1H^tS^{addition line was significantly longer than that of CS. The farinograph quality index of the materials such as CS-Ae. biuncialis 1Ubi#1 addition line, CS-Ae. geniculate 1Mg#1 addition line, and CS-Ae. searsii 1Ss#1 addition line was significantly higher than that of CS. Among them, the dough formation time, stability time, and farinograph quality index of CS-Ae. biuncialis 1Ubi#1 addition line were the highest, at 8.1 min, 10.73 min，and 159.7, respectively. The primers TANC1089 and TANC1142 could amplify specific fragments of 500 bp and 750 bp in the CS-Ae. biuncialis 1Ubi#1 addition line alone. In conclusion，introduction of the CS-Ae. biuncialis 1Ubi#1 chromosome into wheat could significantly improve the processing quality of wheat, and the established molecular markers TANC1089 and TANC1142 for the CS-Ae. biuncialis 1Ubi#1 chromosome could be used for 1Ubi#1 chromatin tracking and identification of Ae. biuncialis in wheat research．}

Graphical abstract

关键词

小麦近缘物种 / 面团特性 / 两芒山羊草 / 分子标记 / 染色质追踪

Key words

wheat related species / characteristics of dough / Aegilops biuncialis / molecular markers / chromatin tracking

小麦是全世界主要的粮食作物之一，也是我国北方人民的主要口粮。小麦品质是一个比较复杂的数量性状，不同因子对其影响程度不同^[1-4]。小麦加工品质主要受面粉和面团特征的影响，面团稳定时间表示面团的耐搅性和面筋筋力^[5]，面团稳定时间越长，说明小麦的韧性越好，加工品质越好，面粉的评分越高。面团的形成时间和粉质质量指数也能很好地反映小麦的物理品质，对食品品质有重要影响^[6-8]。赵振东等^[9]对34份小麦品种进行品质测定，结果显示，面团形成时间平均为3.0 min，稳定时间平均为5.2 min。孙辉等^[10]测定小麦面团稳定时间，发现谷蛋白大聚合体影响面粉的烘焙品质。张树华等^[11]研究表明，麦谷蛋白含量与面团稳定时间呈极显著正相关。曹莉等^[12]研究发现，黄淮冬麦面团稳定时间平均为3.8 min。种植在不同地域优质小麦的面团稳定时间等指标往往并不稳定，且传统培育优质强筋小麦的办法，需要对每代育种材料进行检测，不仅耗时长还效率低，给优质小麦育种和应用带来了很大挑战^[13-14]。

小麦近缘物种有丰富的遗传资源，对其优质基因进行筛选和鉴定对小麦品质改良具有重要意义。两芒山羊草（Aegilops biuncialis，2n=4x=28，基因组UUMM）、希尔斯山羊草（Ae. searsii Feldman & Kislev ex Hammer，2n=2x=14，基因组S^sS^s）、沙融山羊草（Ae. sharonensis Eig.，2n=2x=14，基因组S^shS^sh）等是小麦的野生近缘种，具有抗病、抗旱、耐盐、加工品质好等特点^[15-17]。夏晴等^[18]研究发现，中国春-两芒山羊草2M^b二体附加系与亲本相比高抗白粉病。汪晓璐等^[19]研究发现，希尔斯山羊草4S^s#1、粗穗披碱草5H^t、纤毛披碱草3S^c、7S^c、5Y^c和7Y^c、簇毛麦2V#3、大麦4H、帝国黑麦4R、长穗偃麦草3E、5E和6E染色体导入小麦可使穗长显著变长；纤毛披碱草5Y^c染色体导入使小麦旗叶长度显著变小；纤毛披碱草7S^c和7Y^c染色体导入可使小麦千粒质量显著增加；两芒山羊草2M^bi#1染色体的导入显著降低小麦的株高、分蘖数、小穗数和千粒质量。王海燕等^[20]的研究表明，簇毛麦T4V#4S·4DL染色体导入小麦后降低了其千粒质量。郭军等^[21]在小麦中导入长穗偃麦草的1E^e染色体，发现穗长明显增长，但是旗叶长和宽显著减少。然而，这些物种染色质导入小麦是否影响小麦品质未见报道。

在目的基因向小麦转移的过程中，对被转移的基因及其外源染色体或者染色体片段进行追踪，可以提高选择的准确性，因此，开发可以检测外源染色体的特异分子标记，不仅可以缩短育种周期，还可以提高育种的效率。LIU等^[22]筛选小麦EST-STS（Expressed sequences tags-Sequence tagged sites）引物，获得了20个希尔斯山羊草3S^s染色体特异标记，其中，2个标记用于鉴定希尔斯山羊草3S^s染色体的整臂易位系，结合抗病性鉴定，将抗秆锈病基因定位在3S^sS染色体上。GONG等^[23]筛选小麦EST-STS、PLUG（PCR-based landmark unique gene）、COS（Conserved ortholog sets）引物等，建立了42个单芒山羊草染色体特异标记。曹亚萍等^[24]根据水稻和小麦的EST序列，合成了240对STS引物，开发了34个可以追踪簇毛麦1V-7V染色体的分子标记。

为了筛选含有能提高小麦品质的优异基因源，并开发特异的分子标记，本试验利用粉质仪对19份小麦-近缘物种附加系和易位系的面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数进行测定，并利用PLUG引物对筛选出的优异材料进行特异分子标记的开发，旨在为优质小麦品种的培育提供分子基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料包括24份小麦-近缘物种染色体系和3份普通小麦材料，具体见表1。其中，中国春由电子科技大学杨足君教授提供；济麦22和济麦262由山东省农业科学院作物研究所自育并保存；其余材料由美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因资源中心（WGGRC，Wheat Genetic and Genomic Resources Center）的Gill BS教授提供。

1.2 小麦加工品质的测定

利用德国Bulher公司的MLU-22型自动实验磨粉机磨粉，具体方法参照张晓等^[25]。利用德国Brabender公司的810152电子型粉质仪测定济麦22、济麦262、中国春（对照）和19份小麦-近缘物种染色体系的面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数。

1.3 分子标记开发

选取品质好的小麦-近缘物种染色体系进行分子标记的开发。利用天根快捷型植物DNA提取系统试剂盒提取供试材料幼苗叶片的基因组DNA，具体方法参考LIU等^[26]。利用第一同源群和第二同源群的87对引物对材料DNA进行扩增，引物序列参照ISHIKAWA等^[27]，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

PCR反应体系：DNA（25 ng/μL）1.0 μL，2×PCR mix 15 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，用无菌双蒸馏水补充至30 μL。PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR扩增结束后，用Taq Ⅰ和Hae Ⅲ内切酶酶切（Thermo Scientific公司），酶切反应体系：内切酶0.2 μL，快速酶切缓冲液1 μL，无菌双蒸馏水补充反应体系至5 μL，Taq Ⅰ反应温度为65 ℃，Hae Ⅲ反应温度为37 ℃，反应时间15 min。酶切产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳后凝胶在紫外凝胶成像仪GDS-Gel Dol 2000下扫描。

1.4 数据处理

利用Excel 2010对数据进行整理，SPSS Statistics 17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 面团形成时间分析

面团形成时间测定结果显示（图1），与中国春相比，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系、中国春-粗穗披碱草1S^t附加系、中国春-粗穗披碱草1H^tS附加系和中国春-两芒山羊草5U^bi#1附加系、中国春-希尔斯山羊草1S^s#1附加系和中国春-卵穗山羊草1U^g#1附加系的面团形成时间显著长于中国春（P<0.05），而中国春-簇毛麦1DS·1VL罗伯逊易位系、中国春-沙融山羊草4S^sh#3附加系的面团形成时间显著低于对照（P<0.05），其他材料与对照间无显著差异。其中，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的形成时间最长，为8.1 min，表明两芒山羊草1U^bi#1的导入能够增加小麦的面团形成时间。

2.2 面团稳定时间分析

面团稳定时间测定结果显示（图2），与中国春相比，济麦22、中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系、中国春-粗穗披碱草1H^tS附加系、中国春-希尔斯山羊草1S^s#1附加系和中国春-两芒山羊草5U^bi#1附加系稳定时间长且差异显著（P<0.05），中国春-卵穗山羊草1U^g#1附加系稳定时间较长且差异显著（P<0.05）；而中国春-簇毛麦1DS·1VL罗伯逊易位系、中国春-沙融山羊草4S^sh#3附加系、中国春-易变山羊草1S^v#1附加系和中国春-纤毛披碱草7S^c附加系稳定时间较短且差异显著（P<0.05），其他材料与中国春相比无明显差异。其中，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的稳定时间最长，为10.73 min，表明两芒山羊草1U^bi#1的导入能够增加小麦的面团稳定时间。

2.3 粉质质量指数分析

粉质质量指数测定结果显示（图3），与中国春相比，济麦22、中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系、中国春-粗穗披碱草1H^tS附加系、中国春-粗穗披碱草1S^t附加系、中国春-希尔斯山羊草1S^s#1附加系、中国春-两芒山羊草5U^bi#1附加系和中国春-易变山羊草1U^v#1附加系粉质质量指数较高，且差异显著（P<0.05）；中国春-粗穗披碱草1H^tL附加系、中国春-粗穗披碱草1S^tL附加系、中国春-沙融山羊草4S^sh#3附加系、中国春-簇毛麦1DS·1VL罗伯逊易位系、中国春-易变山羊草1S^v#1附加系、中国春-易变山羊草5S^v#1附加系、中国春-纤毛披碱草3S^c附加系、中国春-纤毛披碱草7S^c附加系和中国春-纤毛披碱草5Y^c附加系粉质质量指数较低，且差异显著（P<0.05），剩余材料与对照间无显著差异。其中，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的粉质质量指数最高，为159.7，表明两芒山羊草1U^bi#1的导入能够提高小麦的粉质质量指数。

综上，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的面团形成时间最长，为8.1 min；其面团稳定时间最长，为10.73 min；其粉质质量指数最高，为159.7，与对照相比差异均显著（P<0.05）。中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的3个指数都高于济麦22，它的面团稳定时间更是达到了国家强筋小麦的标准和山东省中强筋小麦的标准。因此，两芒山羊草1U^bi染色体系为小麦面粉筋性最佳外源染色体来源。

2.4 小麦-近缘染色体附加系的PLUG标记的引物筛选

根据所测得的所有材料的数据可知，中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系的小麦品种显著提高了面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数，因此，对其进行分子标记的筛选。以中国春为对照，对87对第一同源群的PLUG引物进行筛选，结果表明，在87对引物中，仅有2对引物（TANC1089和TANC1142）能在中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系中扩增出多态性条带（表2、图4）。

为鉴定筛选的TANC1089和TANC1142引物的特异性，以中国春、中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系、中国春-两芒山羊草2M^bi#1附加系、中国春-两芒山羊草3M^bi#1附加系、中国春-两芒山羊草4M^bi#1单体附加系、中国春-卵穗山羊草2U^g#1附加系、中国春-卵穗山羊草5U^g#1附加系、济麦22和济麦262为模板，利用上述的2对引物进行PCR扩增。PCR扩增结束后，分别利用限制性内切酶Taq Ⅰ和Hae Ⅲ对PCR产物进行酶切，再通过凝胶电泳可以得到不同的条带，进而分析多态性。结果表明，这2对引物在除了中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系外的其他材料中均不能扩增出特异性条带（图4），由此说明TANC1089和TANC1142为两芒山羊草1U^bi的特异分子标记。

3 结论与讨论

目前，许多研究报道了将近缘物种的外源染色体导入小麦中能够影响小麦的品质^[15-17]，但是影响小麦的加工品质的研究还鲜有报道。孙彬等^[28]研究发现，欧山羊草特异高分子谷蛋白亚基导入小麦后，提高了蛋白含量和湿面筋含量。张瑞奇等^[29]研究表明，簇毛麦Glu-V1、Glu-V3和Gli-V1贮藏蛋白位点基因导入普通小麦背景中能够显著提高总蛋白质含量和面筋质量。王丛磊等^[30]利用普通小麦-簇毛麦T6VS·6AL易位系，并通过分子标记，发现了此易位系对小麦面团的稳定时间有显著的正效应。羊阳等^[31]发现卵穗山羊草的1M^g染色体能够提高普通小麦面团的形成时间和稳定时间。本研究也表明中国春-卵穗山羊草1M^g#1附加系的面团形成时间和稳定时间显著长于中国春。KUMAR等^[32]对山羊草属物种以及小麦-山羊草染色体系进行了加工品质与营养品质的研究，发现希尔斯山羊草、卵穗山羊草和高大山羊草对小麦的面包加工品质有正效应，小伞山羊草的低分子谷蛋白亚基与小麦面包加工品质相关联。董剑等^[33]对中国春-簇毛麦罗伯逊易位系T1DS·1VL、T1DL·1VS易位系和对照中国春的加工品质进行了研究，发现T1DS·1VL的Zeleny沉淀值、面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数显著降低，但T1DL·1VS的这些性状值较对照显著提高，说明T1DS·1VL易位系对小麦的面团强度有显著的负向效应，而T1DL·1VS易位系显著增强面筋强度。ZHAO等^[34]对创制的小麦-簇毛麦T1DL·1V#3S和T1DL·1V#3L易位系进行品质检测结果显示，T1DL·1V#3L易位系相比对照中国春，其形成时间和稳定时间更短，面筋强度更弱，淀粉品质指标更低。而T1DL·1V#3S易位系的上述指标显著优于中国春，可用于小麦品质改良。本研究也发现中国春-簇毛麦1DS·1VL罗伯逊易位系的面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数都显著低于中国春。中国春-两芒山羊草1U^bi#1附加系在面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数这3个指标中数值均为最高，分别为8.1 min、10.73 min和159.7，并且与对照小麦相比差异显著，显著提高了小麦的加工品质。韩冉等^[35]通过在对小麦高分子谷蛋白检测中发现两芒山羊草1U^bi染色体上存在特异高分子谷蛋白亚基，说明两芒山羊草的1U^bi染色体作为优异基因能够提高小麦品质。此外，外源染色质的导入也可能对小麦的品质造成负效应。例如，苏亚蕊等^[36]发现黑麦1RS染色体导入小麦，会导致小麦面团粘性增大、强度降低，使得小麦的加工品质显著变劣。汪晓璐等^[19]也研究了外源染色体导入对小麦主要农艺性状的影响，如希尔斯山羊草1S^s#1、两芒山羊草2M^bi#1、粗穗披碱草1H^t染色体的导入使株高显著降低；卵穗山羊草1M^g#1、两芒山羊草2M^bi#1、纤毛披碱草7S^c和5Y^c的导入使单穗粒数显著减少；希尔斯山羊草1S^s#1、两芒山羊草2M^bi#1、粗穗披碱草1H^t和纤毛披碱草5Y^c的导入使分蘖数和千粒质量显著降低，而纤毛披碱草7S^c和7Y^c的导入使千粒质量显著增加。因此，通过小麦远缘杂交把外源优良基因导入小麦进行育种时，需要综合考量其抗病性、丰产性^[37]和品质。

筛选能提高小麦品质的外源染色体并开发其特异分子标记，能够为优质小麦分子育种提供检测手段。染色体C分带和基因组原位杂交都已被应用于小麦背景中外源染色体的鉴定工作，但是2种试验方法较为复杂。近年来，成本低、操作简便的分子标记技术现已被广泛应用于小麦近源植物染色体特异标记建立。SCHNEIDER等^[38]以小麦-两芒山羊草附加系等为材料筛选出108对SSR（Simple sequence repeat）引物，建立了两芒山羊草2M^b和3M^b染色体特异标记。李东海^[39]筛选了145对PLUG引物，并对小麦-多年生四倍体簇毛麦5AS·5VL易位系进行了鉴定。付必胜等^[40]通过流式细胞染色体分离技术和二代测序结合的方法，获得了簇毛麦5VS的基因组序列信息，开发了簇毛麦5VS染色体臂特异分子标记。刘晓明等^[41]开发了高大山羊草1S^l染色体特异分子标记，可以应用于杂交群体的筛选、鉴定以及辅助选育籽粒Fe和Zn元素含量高的高品质小麦。GONG等^[42]通过SCAR（Sequence charactered amplified region）标记开发了偃麦草E基因组的特异分子标记，可以用来检测小麦背景中的E染色体。姚彩红^[43]发现欧山羊草1U^b染色体中的谷蛋白亚基能够通过提高面粉的面筋强度，并从48对PLUG引物中筛选获得了5对1U^b染色体特异的PLUG引物。ZHOU等^[44]筛选了48对小麦-两芒山羊草1U^b附加系上的特异PLUG标记，并且每对引物只能在Hae Ⅲ或Taq Ⅰ酶切下得到一条特异性条带。与上述研究相同，本研究通过筛选小麦第一同源群染色体的PLUG引物，建立了两芒山羊草1U^bi#1染色体特异标记TANC1089和TANC1142，分别只能在Taq Ⅰ或Hae Ⅲ酶切下得到1U^bi的特异条带，为追踪小麦背景中两芒山羊草1U^bi染色质提供了检测方法。然而，目前建立的标记都是1U^bi长臂标记，后续将加强1U^bi短臂标记的筛选和建立工作。

两芒山羊草1U^bi#1染色体导入小麦可显著提高小麦加工品质。本研究建立的两芒山羊草1U^bi#1染色体分子标记TANC1089和TANC1142可用于小麦背景中两芒山羊草1U^bi#1染色质追踪和鉴定。

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基金资助

山东省自然科学基金(ZR2021QC198)

山东省重点研发计划(2021LZGC025)

山东省重点研发计划(2022LZG002-4)

山东省小麦产业技术体系(SDAIT-01-01)

济南市“新高校20条”(202228067)