不同剂量PMSG对獭兔超数排卵效果及胚胎质量的影响

Effects of different dosages of PMSG on performance of superovulation and embryo quality in rex rabbits

摘要

目的 研究不同剂量PMSG对獭兔的超数排卵效果，并通过胚胎体外观察，探究不同剂量PMSG对獭兔超数排卵后胚胎质量的影响。 方法 选取体质量3~4 kg，7~8月龄18只健康母獭兔，随机分为3组，分别为Ⅰ组（50 IU PMSG+100IU hCG）、Ⅱ组（100 IU PMSG+100 IU hCG）和Ⅲ组（150IU PMSG+100 IU hCG），每组6只，对其进行超数排卵处理。 结果 Ⅰ组平均排卵点数、平均胚胎收集数以及平均可用胚胎数均显著于高于Ⅲ组（P<0.05）；Ⅲ组平均卵泡囊肿数显著高于Ⅰ组（P<0.05）；Ⅲ组平均充血卵泡数以及胚胎畸形率显著高于Ⅱ组，且Ⅱ组显著高于Ⅰ组（P<0.05）。 结论 用50 IU PMSG+100 IU hCG的外源激素组合处理獭兔，其超排效果较好，可在獭兔生产中参考使用。

Abstract

Objective To study the effect of different doses of PMSG on superovulation in rex rabbits，and on the quality of embryos after superovulation through in vitro observation of embryos. Method Eighteen healthy female rex rabbits weighing 3 to 4 kg and 7 to 8 months old were randomly divided into 3 groups (Group Ⅰ,50 IU PMSG+100 IU hCG); Group Ⅱ，(100 IU PMSG+100 IU hCG) and Group Ⅲ ，150 IU PMSG +100 IU hCG)，6 rats in each group，were treated with superovulation. Result The average number of ovulation points，the average number of collected embryos，and the average number of available embryos in Group Ⅰ were significantly higher than those in Group Ⅲ (P<0.05); The average number of follicular cysts in Group Ⅲ was significantly higher than that in Group Ⅰ (P<0.05); The average number of congested follicles and embryo malformation rate in Group Ⅲ were significantly higher than Group Ⅱ，and they were significantly higher than Group Ⅰ (P<0.05). Conclusion Treatment with the exogenous hormone combination of 50 IU PMSG+100 IU hCG showed a better superovulation effect，which could be used as a reference in the production of rex rabbits.

Graphical abstract

关键词

獭兔 / 超数排卵 / 胚胎发育

Key words

rex rabbit / superovulation / embryonic development

对雌性哺乳动物注射促性腺激素会使其卵巢中较多的卵泡发育并诱发排卵，此方法为超数排卵，简称超排^［1］。超数排卵是获取大量卵子或胚胎的有效途径之一，且雌性动物的超数排卵效果受到动物个体自身的遗传、体况、年龄、发情周期阶段、卵巢功能等多种因素的影响^［2］。超排技术作为快速获得卵子或胚胎的有效手段，随着科学研究和动物生产的需要逐渐被应用到更多的领域中，并且通过与胚胎移植技术的结合，对畜牧业的高效生产带来了革命性的变化。孕马血清促性腺激素（PMSG），也称为马绒毛膜促性腺激素，具有促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）的双重活性，并且有着比FSH更低的生产成本，因此常用来代替FSH作为超排常用的激素之一。但PMSG的化学结构特殊，有更长的半衰期，在动物体内代谢缓慢，特别在使用大剂量外源性PMSG进行超排处理时，会引起母畜诸多卵巢疾病，从而影响超排后的卵母细胞数量和质量^［3-5］。动物超排所用到的FSH和PMSG的处理方法已在牛、马、羊、兔、小鼠等开展了大量研究，且不同物种之间的效果差异很大。家兔作为生物学试验常用的动物，前人已经使用了不同的处理方法，对多个家兔品种的卵巢排卵点数、充血卵泡数、排卵数等的超排效果开展了研究，筛选出适合在生产中应用的超排激素剂量。但对于一些特定品种如獭兔的研究，特别是超排后胚胎质量的研究报道尚不多见。本试验对成年健康獭兔注射不同剂量PMSG进行超排处理，通过测定其平均排卵点数、充血卵泡数、胚胎收集数、胚胎畸形率等指标，比较在不同PMSG剂量下獭兔的超排效果，探讨外源生殖激素对獭兔卵巢发育及胚胎发育质量的影响，为在生产实践中制定科学的超排方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择体质量3~4 kg，7~8月龄獭兔母兔18只，以及体质量4~5 kg，9~10月龄獭兔公兔6只。所有试验动物均已达到性成熟，单笼饲养。孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）均购自宁波第二激素厂。PBS冲卵液（PBS，100 IU/mL 青霉素钠，100 IU/mL 硫酸链霉素，1％FBS）购自美国ICP公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验獭兔的分组

将獭兔随机分为3组，分别为Ⅰ组（50 IU PMSG+100 IU hCG）、Ⅱ组（100 IU PMSG+100 IU hCG）和Ⅲ组（150 IU PMSG+100 IU hCG），每组6只母兔。

1.2.2 超数排卵处理方法

用1 mL注射器吸取相应剂量的PMSG，在獭兔大腿内侧肌注，72 h后同法注射100 IU hCG，随后与公兔1∶1合笼，自然交配，诱导其排卵及受精。

1.2.3 卵泡发育及胚胎的采集观察

交配24 h后的母兔用耳缘静脉注射空气法处死，实验室解剖后取出输卵管和卵巢。首先观察卵巢发育状况，记录卵巢上的排卵点数、卵泡囊肿数以及充血卵泡数。剥离卵巢与输卵管连接处，将提前制备好的冲卵针从宫管结合处靠近子宫角方向约1 cm处刺入，将针头预埋在输卵管中，并用止血钳固定好针头。手持输卵管，在输卵管伞部下放置60 mm规格的一次性无菌培养皿，缓慢推入PBS冲卵液冲卵。将盛有培养液的培养皿置于体视显微镜下观察，按照胚胎形态学评级方法^［6］，记录优质胚胎与劣级胚胎数。

1.3 数据处理

试验数据用Excel 2010进行整理，然后采用SPSS 22.0统计软件中的ANOVA进行单因素方差分析，差异显著时用LSD法进行多重比较，P<0.05为差异显著判断标准。数据结果用\overline{x}\pm s标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 不同剂量的PMSG对獭兔超数排卵的影响

由表1可知，Ⅰ组平均排卵点数和平均胚胎收集数均高于Ⅲ组（P<0.05）；Ⅲ组平均卵泡囊肿数显著高于Ⅰ组（P <0.05）；Ⅲ组平均充血卵泡数显著高于Ⅱ组，且Ⅱ组显著高于Ⅰ组（P <0.05）。

2.2 不同剂量的PMSG对獭兔早期胚胎质量的影响

由表2和图1可知，Ⅰ组平均可用胚胎数显著高于Ⅱ组和Ⅲ组 （P<0.05），Ⅲ组胚胎畸形率显著高于Ⅱ组，且Ⅱ组显著高于Ⅰ组（P<0.05）。由图2可知，A~C组分别为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组獭兔超数排卵处理下获得的优质胚胎，D~F组为劣质胚胎。由A~C图可见，Ⅰ组冲得的胚胎结构完整清晰，层黏蛋白颜色通透，且随着PMSG剂量的增加，胚胎结构有畸形改变的趋势。D~F组胚胎结构模糊不规则，细胞核随着PMSG剂量的上升均出现不同程度的碎裂变形。

3 讨论

不同剂量外源激素对獭兔的超数排卵效果具有一定的影响。Kennelly^［7］指出，高剂量外源激素导致的卵子减少是因为仍有部分卵子残留在卵泡当中。王田娟等^［8］研究发现，用FSH、HMG（人绝经尿促性素）和PMSG分别与hCG组合对家兔进行超数排卵对比后发现，PMSG试验组出现大量充血卵泡和囊肿，而同剂量的FSH组和HMG组较少。本试验结果也显示，Ⅱ组和Ⅲ组的平均充血卵泡数和平均卵泡囊肿数显著高于Ⅰ组，可能是由于PMSG半衰期长，在动物体内长时间残留难以代谢出去，大剂量使用后会产生不良效应，这与李存欣^［9］等在用PMSG对獭兔超数排卵后的结果一致，超排处理后的獭兔充血卵泡数显著增加。

动物的性活动主要受垂体的控制，通过人工注射外源性激素弥补了母畜内源性激素分泌量的不足，从而达到超数排卵的目的。本研究中Ⅰ组母兔的排卵点数显著高于Ⅱ组和Ⅲ组，说明低剂量的外源激素能够在一定程度上减少卵巢中同一时期的卵泡闭锁现象，促使卵巢内的更多卵泡发育并排卵，这与林峰^［10］等用PMSG对母兔进行超数排卵处理后的结果一致。但随着激素剂量的不断增加，卵巢出现了不同程度的“过刺激炎症反应”，具体表现在Ⅱ组、Ⅲ组充血卵泡数和卵泡囊肿数明显高于Ⅰ组。毛冠平等^［11］分别用50 IU和100 IU 2种剂量对成年哈白兔进行超数排卵后发现，充血卵泡和囊肿卵泡液都逐渐增多。出现这种现象的原因可能是接受了外源性激素处理的母兔卵巢，由于过高的激素水平使得卵巢上大量卵泡生长发育，卵巢上的血管增生，基质增加，卵巢体积逐渐增大^［8］。且PMSG的LH作用使卵巢上卵泡血管扩张，内压升高，毛细血管破裂，导致内膜、颗粒膜破裂，血液流入管腔，形成大量充血卵泡。因此本研究结果也佐证了相关报道^［12-13］。除此之外，为保证超数排卵效果，也需要注意激素之外的其他影响因素。例如，根据母兔的发情鉴定标准，需确保在注射hCG前母兔处于发情期。因母兔繁殖特点的特殊性，为确保母兔能够成功排卵并受精，且胚胎的质量不受精液品质的影响，与母兔同笼交配的公兔需选取成年健壮、爬跨反应较好者。同时也要考虑输卵管冲胚操作的影响，胚胎离开母体生理环境后较为脆弱，因此对外界环境的要求较高，PBS冲卵液只能提供胚胎临时的营养供给，为避免人为因素和环境的变化对胚胎造成畸形，应在体视显微镜下迅速对含有胚胎的冲卵液进行挑选评级。

在相同激素水平下，注射剂量较低时不足以引起卵泡发育而排卵，当增加激素剂量，排卵率会随着剂量的上升而呈现增加的趋势，但过高的激素水平又会导致卵巢变态发育，卵泡无法排卵，导致超数排卵效果较差^［14］。张金友等^［15］用4种不同剂量PMSG对日本大耳超排后发现，随着激素剂量的上升，充血卵泡中的颗粒细胞层数和直径明显增加。因此，要想获得较好超数排卵效果，必须综合考虑影响超数排卵的因素，选择适宜的激素剂量^［16-18］。本试验结果证明，Ⅰ组超数排卵效果较好，可能是该剂量在獭兔超数排卵的适宜剂量范围之内，促使更多的卵泡启动发育，在卵泡能够成熟排卵的同时，减弱了PMSG对卵巢的副作用。另外通过本研究可知，经过超数排卵后的胚胎细胞会出现畸形的情况，但PMSG剂量的不同，畸形的程度也不同。曹君君^［19］同剂量的PMSG对日本大耳兔进行超排后发现，超排获得的胚胎质量参差不齐，在交配后72 h所获得的胚胎透明带明显弯曲变形，胚胎形状不规则，且占所收集胚胎的30%以上。陈现伟等^［20］应用FSH+LH组合对家兔超数排卵处理，在配种后32～40 h采卵并选择发育良好的胚胎进行移植，发现胚胎移植成功率为58.02%，且所产仔兔体征健康。吴海凤等^［21］用PMSG对6周龄的羔羊超数排卵后发现，PMSG对早期胚胎的体外发育能力影响较大，但仍有11.4%的受精卵可发育至2细胞胚胎期。此外，相关研究报道^［22］指出，对母畜进行超数排卵处理后获得的胚胎或卵子质量，会出现不同程度的畸形发育，且畸形率随剂量的增大而增加，在PMSG、FSH和HMG 3种激素的处理下，PMSG处理后的胚胎畸形率最高，胚胎移植后妊娠率最低，且伴随着高剂量外源激素的超数排卵处理，对受体母畜的移植效果都不理想。排除受体母畜的饲养管理或遗传因素，分析可能的原因，是由于PMSG在母畜体内的半衰期较长，后效应严重，高剂量的外源激素使卵巢的“过刺激炎症反应”加剧，卵子发育环境的变化导致排出卵子的结构被破坏。

外源激素的正确使用是实现超数排卵技术的根本，但激素含量也决定着母体整个生殖活动的调控。本试验对獭兔注射50 IU PMSG和100 IU hCG的组合虽然能获得大量优质胚胎，但也无法避免畸形胚胎的产生。有研究表明^［23］，是由于外源激素的刺激使得卵子发育环境异常所致。PMSG所具有的LH效应也会影响卵子的质量，最终导致精卵结合后胚胎发育的异常。对于畸形胚胎结构异常的变化程度是否和外源激素的剂量有关，还需进一步研究探讨。

4 结论

在獭兔超数排卵处理中，高剂量的PMSG会使卵巢出现过刺激炎症反应，降低超数排卵效果并导致胚胎畸形率增高，从而影响胚胎质量。在生产实践中，建议使用50 IU PMSG+100 IU hCG的超排处理组合，可取得较好效果。

参考文献

[1] 廉莉.哺乳动物超数排卵和卵母细胞的生发泡互换研究［D］.北京：中国农业大学，2002.

[2] 金虎.家兔超数排卵影响因素的研究［D］.延边：延边大学，2006.

[3] 杨春荣，马霄飞，李吉霞，等.PMSG不同剂量对小鼠超排效果的影响［J］.畜牧兽医杂志，2001，20（6）：18-19.

[4] 贺文杰，田金如.FSH与PMSG对家兔超排及移植的效果［J］.河南农业科学，1990（6）：31-32.

[5] 林峰，陈玉霞，史明艳，等.不同处理方法对家兔超数排卵效果的影响［J］.中国农学通报，2006，22（8）：44-46.

[6] 巢时斌，李建春，黄筱金，等.胚胎早期形态学参数与胚胎植入关系分析［J］.实用临床医学，2008（9）：1-2，6.

[7] Kennelly J J， Foote R H.Superovulatory response of pre-and post-puberatl rabbits to comercially available conadotrophins［J］.Journal of Reproduction & Fertility，1965，9（2）：177.

[8] 王田娟，章志国，邢琼，等.不同超排方法对家兔超数排卵效果的影响［J］.安徽医科大学学报，2011，46（4）：355-357，399.

[9] 李寸欣，刘立文，田淑飞，等.不同剂量的PMSG对獭兔超数排卵效果的影响［J］.中国养兔，2013（1）：8-9，21.

[10] 林峰，李明，高腾云，等.不同处理方法对家兔超数排卵效果研究［C］∥中国畜牧业协会.第八届（2018）兔业发展大会论文集，2018.

[11] 毛冠平，张金友，刘云波，等.PMSG对兔超数排卵的影响及卵巢组织学观察［J］.中国养兔，2004（06）：17-22.

[12] Sakuma Y， Endo T， Kanayama K.Superovulation in rabbits by intravenous injection of PMSG［C］∥The Fifth World Conference on Animal Production，1983.

[13] Pintado B， Gutiérrez-Adán A， Llano B P.Superovulatory response of Murciana goats to treatments based on PMSG/Anti-PMSG or combined FSH/PMSG administration.［J］.Theriogenology，1998，50（3）：357.

[14] 贺文杰，田金如，邓瑞广，等.FSH与PMSG对家兔超排及移植的效果［J］.河南农业科学，1990（6）：31-32.

[15] 张金友，田亚光，黄贺，等.兔超数排卵效果及早期胚胎体外发育的研究［J］.中国畜牧杂志，2007（1）：17-19.

[16] 王海龙，田志国，张贵学.PMSG对母兔卵巢机能的影响［J］.中国养兔，2001（3）：18-20.

[17] 杨立国.动物繁殖学［M］.北京：中国农业出版社，2003：72-73

[18] 范必勤，熊慧卿，邵春荣.家兔超数排卵和胚胎移植的研究［J］.江苏农业科学，1985（5）：34-35. （下转第24页）

基金资助

甘肃农业大学特色学科建设基金项目(GAU-XKJS-2018-037)