硒化秦巴硒菇多糖对A549细胞增殖的抑制作用

Antitumor efficacy of Se⁃Agaricus blazei Murill （Se⁃ABM） on A549 cells

摘要

目的 初步探讨硒化秦巴硒菇多糖（Se⁃ABM）对人非小细胞肺癌细胞（A549）DNA损伤及细胞周期阻滞的分子机制。 方法 体外培养人结肠癌细胞（HT29）、人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌细胞（HeLa）和非小细胞肺癌细胞（A549），用Se⁃ABM和拓扑替康处理（Topotecan）A549细胞，分别用CCK-8试验，流式细胞分析和免疫印迹试验（Western⁃blot，WB）检测Se⁃ABM对A549细胞的抗肿瘤作用。 结果 Se⁃ABM能够抑制HT29、HepG2、HeLa和A549细胞的增殖，其中对A549细胞的增殖抑制最为明显。细胞流式试验表明，Se⁃ABM在G2/M期阻滞A549细胞，并呈浓度依赖性。Western⁃blot 试验结果显示，Se⁃ABM 能够使 A549 细胞中DNA损伤相关因子毛细血管扩张性共济失调突变基因 （ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）、毛细血管扩张性共济失调相关基因 （ataxia-telangiectasia related gene，ATR）、抑癌基因（p53）、磷酸化组蛋白（γ⁃H2AX）的表达量明显升高，同时诱导细胞周期阻滞在G2/M期。此外，在A549细胞中，Se-ABM能够调控凋亡相关蛋白的表达，促使促凋亡因子（BAX）、乳腺癌1号基因（BRCA1）、抗凋亡因子（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3，Cas 3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase 9，Cas 9）的表达发生明显变化。 结论 Se-ABM在体外能够明显诱导DNA损伤，从而导致细胞凋亡，Se-ABM具有潜在的抑制A549细胞增殖的效果。

Abstract

Objective To investigate the molecular mechanism of DNA damage and cell cycle arrest of human non⁃small cell lung cancer cells (A549) by Se-Agaricus blazei Murill (Se-ABM). Method Human colon cancer cells (HT29)，human hepatoma cells (HepG2)，human cervical cancer cells (HeLa) and A549 cells were cultured in vitro，and non-small cell lung cancer cells (A549) were treated with Se-ABM and topotecan，respectively，and treated with CCK-8 experiments，flow cytometry and Western blot (WB) were used to detect the anti-tumor effect of Se-ABM on A549 cells. Result Se-ABM inhibited the proliferation of HT29，HepG2，HeLa and A549 cells，among which the proliferation inhibition of A549 cells was the most obvious.Flow cytometry showed that Se-ABM blocked A549 cells in G2/M phase in a concentration-dependent manner.The results of WB experiment showed that Se-ABM made DNA damage-related factors ataxia telangiectasia mutated gene (ATM) and ataxia-telangiectasia related gene ataxia-telangiectasia related gene (ATR) in A549 cells.Tumor suppressor gene (p53)，and phosphorylated histone (γ-H2AX) significantly increased，and cell cycle arrested in G2/M phase.In addition，Se-ABM regulated the apoptosis-related proteins in A549 cells，including pro-apoptotic factor (BAX)，BRCA1 gene (BRCA1)，anti-apoptotic factor (Bcl-2)，caspase 3 (Cas 3) and cysteine-aspartic protease 9 (Cas 9)，which were markedly changed. Conclusion Se-ABM could induce DNA damage and induction of cell apoptosis in vitro.Therefore，Se-ABM has a potential effect to inhibit the proliferation of A549 cells.

Graphical abstract

关键词

硒化秦巴硒菇 / 拓扑替康 / 非小细胞肺癌细胞 / 细胞周期 / 细胞凋亡 / DNA损伤

Key words

Se⁃ABM / Topotecan / human non⁃small cell lung cancer / cell cycle / cell apoptosis / DNA damage

肺癌是呼吸系统的恶性肿瘤，是全世界最致命的癌症之一。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤，据国家癌症中心最新统计，我国肺癌的发病率和病死率位居第一^［1］。肺癌按照病理分型，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中非小细胞肺癌占80%~85%，由于早期NSCLC无明显症状，大多数患者确诊时已经处于晚期或者有远处转移，5 a生存率低^［2］。目前，化疗是治疗中晚期NSCLC的常用方法，包括顺铂、依托泊苷等化疗药物^［3］，但化疗药物容易产生不同程度的胃肠道反应、白细胞减少等不良反应，严重的会造成肝肾损伤^［4］。中医认为，肺癌属于“肺积” “肺痿”范畴，多与正气虚弱、外邪犯肺、饮食不节等有关，中医因其独有的辩证治疗体系，在肺癌治疗中具有一定的治疗优势和治疗特点^［5］。目前，中药及其有效成分的抗肿瘤研究已有诸多报道，中药中的生物碱、萜类、黄酮类、植物多糖类等成分都有很好的抗肿瘤活性^［6-8］。植物多糖具有降血糖、降胆固醇、抗病毒、提高免疫力以及抗肿瘤的药理活性，其中，香菇多糖作为抗肿瘤药物辅助剂已经应用于临床^［9-10］。硒是人体健康不可或缺的微量元素，具抗氧化、排毒和免疫调节作用^［11］。研究表明硒蛋白可用作分子分型和肿瘤预后的生物标志物，含硒化合物可以抑制肿瘤生长，并能够增强抗肿瘤药物的功效^［12］。硒化秦巴硒菇多糖（Se-ABM）作为一个富含硒元素的多糖，其对人非小细胞肺癌A549细胞的治疗效果和作用机制尚不明确，本研究以潜在的抗肿瘤活性成分硒化多糖Se-ABM为研究对象，用CCK-8分析Se-ABM对A549细胞增殖抑制效果；用流式细胞分析Se-ABM对A549细胞周期影响；用蛋白免疫印迹分析Se-ABM作用于A549细胞后DNA损伤相关因子ATM、ATR、p53、γ-H2AX及细胞凋亡关键蛋白BAX、Bcl-2、BRCA1、Cas3和Cas9的表达，阐明其诱导A549细胞发生细胞损伤的作用机制，旨为临床治疗非小细胞肺癌提供辅助策略及新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

拓扑替康（Topotecan） 购自迈瑞尔化学技术有限公司 （中国上海）。Se-ABM购自甘肃中医药大学实验中心 （中国兰州）。人结肠癌细胞（HT29）、人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌细胞（HeLa）和非小细胞肺癌细胞（A549）细胞系购自中国科学院细胞库 （中国上海）。试验中Se-ABM用纯净水制备为初始浓度为100 mmol/L原液。阳性对照药物拓扑替康用DMSO溶解制成浓度为100 mmol/L的原液。ATM antibody（CST公司，美国），ATR antibody（CSTG公司，美国），p53 antibody（abcam公司，美国），γ-H2AX antibody（abcam公司，美国），BAX antibody（CST公司，美国），BRCA1 antibody（CST公司，美国），Bcl-2 antibody（abcam公司，美国），Caspase 3（Cas 3）antibody（abcam公司，美国），Caspase 9（Cas 9）antibody（abcam公司，美国），β-actin antibody （Santa Cruz公司，美国）。倒置显微镜 （Olympus公司，日本）；高速冷冻离心机、电泳仪、转膜仪、酶标仪、PCR仪、Western blot曝光仪 （Bio-Rad公司，美国）；INC153型CO₂培养箱 （Memmert公司，德国）；流式细胞仪 （BD公司，美国）；细胞超净工作台 （ESCO公司，新加坡）。

1.2 方法

1.2.1 细胞活力的测定

人结肠癌细胞（HT29）、人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌细胞（HeLa）和人非小细胞肺癌细胞（A549）用含10%小牛血清RPMI 1640或DMEM培养基置于 37℃、5% CO₂ 条件下培养，在细胞进入对数生长期时进行传代培养。试验中用CCK-8试剂盒检测Se-ABM抑制A549细胞生长的抑制率。取对数生长期的细胞接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养。细胞贴壁培养后，在培养基中加入不同浓度的Se-ABM和Topotecan，每个浓度设置6组复孔，对照组为只加入完全培养基培养的细胞。培养72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，将细胞板在培养箱中继续孵育4 h后，用全功能多波长酶标仪测定其在450 nm处的吸光度，试验重复3次。

1.2.2 流式细胞分析

将对数生长期的细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁生长后，加入不同浓度的Se-ABM和Topotecan进行处理，对照组加入等体积的含DMSO的培养液，继续培养24 h，收集细胞，用不含EDTA的胰酶消化，离心并收集细胞，弃去培养液，并加入1 mL碘化丙啶（PI）染色液，避光孵育染色15 min后，用流式细胞仪检测。

1.2.3 免疫印迹试验

取对数生长期A549细胞，传代贴壁生长后用不同浓度的Se-ABM和Topotecan处理，阴性对照为不加任何药物处理的细胞。24 h后，弃培养液，加入裂解液低温提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白提取液加入上样缓冲液变性，以相同的总蛋白量上样，加入5%浓缩胶、10%分离胶进行SDS-Page凝胶电泳分离，转膜，封闭，加入1∶1 000一抗，4 ℃过夜，TPS洗涤，加入稀释比例为1∶10 000的二抗，室温下孵育2 h，洗涤，加ECL显色液，凝胶成像系统 （ChemDoc-It610，UVP，USA）曝光仪曝光，分析数据，试验重复3次。

1.3 统计学分析

使用SPSS 21.0软件（Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计学分析，t检验分析组间差异显著性，数据均表示为\overline{x}±s，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Se-ABM抑制肿瘤细胞增殖

如图1所示，筛选Se-ABM对肿瘤细胞增殖抑制作用，用0、50、100、200 µg/mL的Se-ABM处理HT-29细胞、HepG2细胞、A549细胞以及HeLa细胞72 h，相同浓度的Topotecan作为阳性对照，CCK法测定细胞存活率。结果发现，不同浓度的Se-ABM对包括A549细胞、HT-29细胞、HepG2细胞和HeLa细胞在内的肿瘤细胞都有抑制增殖的效果，并随着Se-ABM浓度的增加抑制效果更加的显著，其中，50、100、200 µg/mL Se-ABM抑制HT29细胞增殖作用和0 µg/mL比较均有显著差异（P<0.05）；同样地，在HepG2细胞中，50、100、200 µg/mL Se-ABM抑制HepG2细胞增殖作用和0 µg/mL比较，均有显著差异（P<0.05）；在A549细胞中，50、100、200 µg/mL Se-ABM抑制细胞增殖时更为显著，在200 µg/mL时，和0 µg/mL比较，具极显著差异性（P<0.01）；而在HeLa细胞中，Se-ABM 50 µg/mL的浓度处理细胞后，和0 µg/mL比较，差异不显著（P>0.05），100、200 µg/mL时，跟0 µg/mL比较，差异显著（P<0.05）。

2.2 Se-ABM阻滞A549细胞周期在G2/M期

用不同浓度的Se-ABM处理A549细胞24 h，收集细胞，用PI染色并用细胞流失仪分析细胞周期分布情况。结果发现，50、100、200 μg/mL Se-ABM使A549细胞G2/M期细胞增多，并呈浓度依赖性。如图2所示，Se-ABM的浓度为50 μg/mL时，阻滞在G2/M期的细胞数为8.9%；Se-ABM的浓度为100 μg/mL时，阻滞在G2/M期的细胞数为10.2%，Se-ABM的浓度为200 μg/mL时，阻滞在G2/M期的细胞数为19.3%。提示Se-ABM可能通过调控细胞周期，阻滞A549细胞周期在G2/M期，最终抑制A549细胞增殖。

2.3 Se-ABM诱导A549细胞 DNA损伤

用50，100，200 µg/mL的Se-ABM处理A549细胞24 h后，免疫印迹试验结果显示，DNA损伤相关因子ATM、ATR、p53和γ-H2AX的表达量明显升高 （图3）。随着Se-ABM浓度的增加，损伤因子的变化呈浓度依赖性，和阴性对照组比较，Se-ABM在 50 µg/mL时就能够诱导A549细胞损伤因子ATM、ATR、p53和γ-H2AX表达增多，和阳性对照组拓扑替康比较，在50 µg/mL时，诱导A549细胞损伤的效果显著，由此可以看出，Se-ABM能够诱导A549 细胞发生DNA损伤，进而引起组蛋白发生应激变化，最终导致A549细胞的增殖被抑制。

2.4 Se-ABM诱导A549细胞凋亡

肿瘤细胞在受到辐射或者抗肿瘤药物作用后会诱导细胞发生损伤，细胞中存在的损伤修复机制不能修复损伤后，细胞会发生凋亡，BAX是主要的细胞凋亡因子，Bcl-2是主要的抗细胞凋亡因子，而BRCA1、Cas3以及Cas9是下游主要的凋亡因子，其中BAX和Bcl-2的相对改变是细胞凋亡的显著特征。用50，100，200 µg/mL的Se-ABM处理A549细胞24 h后，免疫印迹试验结果显示，与对照组（Control）相比，试验组细胞凋亡蛋白因子BAX，BRCA1，Cas3和Cas 9的表达量明显上升，而Bcl-2蛋白的表达随给药浓度的增加而减少 （图4）。由此可以看出，在A549细胞中，Se-ABM能诱导A549细胞发生细胞损伤最终导致细胞凋亡。

3 讨论

近几年，非小细胞肺癌患病率逐年攀升，但化疗缓解率较低且毒副反应严重，尤其影响肝功能、造血功能和机体免疫力^［13］。此外，化疗药物的长期使用极易发生耐药性，比如鬼臼毒素衍生物拓扑替康 ^［16］，这就需要开发新的治疗方法以获得更有效地治疗效果。中医药以辩证施治为原则，对疾病的治疗强调“阴阳调和”，通过提高机体自身的免疫力，增加肿瘤治疗的效果^［14-15］。天然产物药用资源由于含有活性次生代谢产物，已在抗肿瘤治疗中获得应用^［17-18］。现代药理研究表明，秦巴硒菇多糖（Se-ABM）不仅有抗氧化、免疫调节、降血糖、降血压、降胆固醇等作用，同时也具有抗肿瘤活性^［19］。课题组前期研究发现，秦巴硒菇多糖提取物能抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡^［20］。但Se-ABM对其他肿瘤的抑制作用及机制还未见报道，故本文初步研究了Se-ABM对HT29、HepG2、HeLa和A549细胞的抗肿瘤活性，发现Se-ABM对以上细胞均有抑制作用并呈浓度依赖性，其中，对非小细胞肺癌细胞增殖抑制更明显，故选择A549细胞展开了更进一步的研究。

DNA损伤后，细胞在损伤累计的情况下会发生细胞周期阻滞以促进DNA的修复，或发生凋亡等途径清除未能修复的细胞^［21］，在肿瘤细胞中，H2AX 蛋白属于组蛋白家族成员，其主要在肿瘤细胞DNA双链损伤应答中起作用，H2AX的磷酸化（γH2AX）在大量细胞核损伤事件中均有参与^［22-24］，相关文献报道A549细胞受到辐射或者其他因素的影响后，细胞内DNA双链结构发生断裂且断裂位置附近的H2AX会发生磷酸化修饰，引起无法逆转的细胞损伤，导致细胞周期阻滞，最终诱导细胞凋亡^［25］。另外p53 作为抑癌基因之一，在正常状态下呈低水平表达，当细胞在各种应激包括 DNA 损伤时，p53可以被上游蛋白如ATM和ATR等激活，其中ATM 和 ATR 属于三磷酸肌醇激酶家族的成员，分别感应不同形式的 DNA 损伤，激活的p53进一步增强其下游多种基因的转录引起细胞周期阻滞及凋亡等^［26-29］。Se-ABM能够调控A549细胞周期，使细胞周期阻滞在G2/M期，并且免疫印迹结果显示DNA损伤相关因子γH2AX、P53、ATM及ATR的表达随着Se-ABM浓度的增加逐渐升高。在细胞凋亡中BAX是主要的促凋亡因子，Bcl-2是主要的抗凋亡因子，两者活性的改变调控下游主要凋亡因子BRCA1、Cas3以及Cas9的表达。因此，BAX和Bcl-2的相对改变是肿瘤细胞发生凋亡的显著特征。研究发现Se-ABM作用于A549细胞后，试验组的BAX、BRCA1、Cas3和Cas9的表达和对照组比较明显增加，同时，Bcl-2在实验组中的表达明显下降。

Se-ABM能够使A549细胞的DNA双链发生断裂，使H2AX磷酸化增加，γ-H2AX快速传导DNA损伤信号，同时激活了包括p53在内的关键信号分子，导致相关信号通路被激活，进一步引发一系列生物级联反应和细胞学反应，调控细胞周期，使肿瘤细胞发生凋亡并趋于死亡。而Se-ABM通过DNA损伤调控A549细胞周期阻滞在G2/M期的具体机制还需要进一步的研究和探讨。综上，本论文研究结果为Se-ABM作为潜在抗肿瘤辅助因子提供了参考和依据。

参考文献

[1] 赫捷，李霓，陈万青，等.中国肺癌筛查与早诊早治指南［J］.中国肿瘤，2021，30（02）：81-111.

[2] Bade B C， Dela Cruz C S.Lung Cancer 2020： Epidemiology，Etiology，and Prevention［J］.Clin Chest Med，2020，41 （1）：1-24.

[3] Duma N， Santana-Davila R， Molina J R.Non-Small Cell Lung Cancer： Epidemiology，Screening，Diagnosis，and Treatment ［J］.Mayo Clin Proc，2019，94（8）：1623-1640.

[4] 魏海梁，李京涛，闫曙光，等.八珍汤治疗恶性肿瘤化疗后白细胞减少症临床研究［J］.陕西中医，2018，39（11）：1508 -1510.

[5] 李明珠，陈启亮，陈谦峰，等.基于证素辨证原理的微观指标中医辨证意义探究策略［J］.华中医药杂志，2021，36（11）：6285-6288.

[6] 张琳，邓贵华，杨亮，等.苦木碱F通过miR-331-3p调控宫颈癌 HeLa细胞增殖及凋亡的机制研究［J］.陕西中医，2022，43（01）：17-22.

[7] 袁会成.紫花地丁多糖的提取及抗肿瘤活性初步研究［D］.武威：甘肃省武威肿瘤医院，2020.

[8] 程继，王志刚，付国，等.姜黄素@普朗尼克纳米胶束抑制前列腺癌PC-3细胞生长实验研究［J］.陕西医学杂志，2021，50（11）：1340-1344.

[9] 胡慧.中药注射液调节肿瘤化疗患者免疫功能的临床研究进展［J］.陕西中医，2018，39（4）：3.

[10] 李晓利，牛敏，张铭，等.香菇多糖注射液联合化疗对晚期胃癌患者免疫功能和临床疗效的影响［J］.陕西医学杂志，2015，44（12）：1624-1626.

[11] El-Boshy M E， Risha E F， Abdelhamid F M，et al.Protective effects of selenium against cadmium induced hematological disturbances，immune- osuppressive，oxidative stress and hepatorenal damage in rats ［J］.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，2015，29（1）：104-110.

[12] Wang T， Xuan X Y， Li M.Astragalus saponins affect proliferation，invasion and apoptosis of gastric cancer BGC -823 cells ［J］.Diagnostic Pathology，2013，8（1）：179-184.

[13] Ettinger D S， Wood D E，et al.Non⁃small cell lung cancer，version 6.2015 ［J］.Journal of the National Com- prehensive Cancer Network，2015，13（5）：515-524..

[14] 马胜辉，蔡淑云，杨强，等.参芪复原汤联合化疗对胃肠恶性肿瘤术后患者预后的影响［J］.陕西中医，2016，37（10）：2.

[15] 贺凡，王雄文.论“治病求本”对肿瘤综合治疗的指导作用［J］.陕西中医，2016，（6）：2.

[16] Lei Z N， Teng Q X， Zhang W，et al.Establishment and Characterization of a Topotecan Resistant Non-small Cell Lung Cancer NCI-H460/TPT10 Cell Line ［J］.Front Cell Dev Biol，2020，（8）：607275.

[17] 刘爱平，曾峰.黄芪多糖对人肺癌A549细胞增殖的作用及其机制的实验研究［J］.肿瘤药学，2011，1（6）：499-501，507.

[18] 董娅，赵钰玲，范亚莉，等.红花多糖对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响［J］.临床肺科杂志，2017，22（11）：2045-2048.

[19] 孟敏.富硒秦巴硒菇抗氧化活性成分筛选及药效学初探［D］.兰州：甘肃省人民医院，2020.

[20] 程明霞，韩彩文，董莉，等.姬松茸提取物对人白血病K562细胞Wnt/β-catenin信号通路及BCL-2、Bax的影响［J］.时珍国医国药，2020，31（1）：12-16.

[21] Roos W P， Thomas A D， Kaina B.DNA damage and the balance between survival and death in cancer biology ［J］.Nat Rev Cancer，2016，16（1）：20-33.

[22] Plappert H U， Libertini S， Frieauff W，et al.Gamma-H2AX immunofluorescence for the detection of tissue-specific genotoxicity in vivo ［J］.Environ Mol Mutagen，2019，60（1）：4-16.

[23] Johansson P， Fasth A， Ek T， Hammarsten O.Validation of a flow cytometry-based detection of γ-H2AX，to measure DNA damage for clinical applications［J］.Cytometry B Clin Cytom，2017，92（6）： 534-540.

[24] Dobersch S， Rubio K， Singh I，et al.Positioning of nucleosomes containing γ-H2AX precedes active DNA demethylation and transcription initia-tion ［J］.Nat Commun，2021，12（1）：1072.

[25] Lu C， Min X， Luo Y，et al.Genome-wide transcriptional analysis of apoptosisrelated genes and pathways regulated by H2AX in lung cancer A549 cells［J］.Apoptosis，2013，18（9）：1039-1047.

[26] Fernandez-Diaz L C， Laurent A，et al.The absence of Prep1 causes p53 depe- ndent apoptosis of mouse pluripotent epiblast cells［J］.Development，2018，137（20）：3393-3403.

[27] 孙 鹏，赵云富.p53基因相关的细胞非经典死亡［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26（005）： 577-582.

[28] Groh I， Esselen M.Methyleugenol and selected oxidative metabolites affect DNA damage signalling pathways and induce apoptosis in human colon tumour HT29 cells［J］.Food & Chemical Toxicology，2018，115：413.

[29] Kostyusheva A， Brezgin S， Bayurova E，et al.ATM and ATR expression potentiates HBV replication and contributes to reactivation of HBV infection upon DNA damage［J］.Viruses，2019，11（11）：997.

基金资助

甘肃省科技计划项目(20JR10RA370)

甘肃省卫生行业科研计划资助项目(GSWSKY-2019-23)