梭梭根际促生菌（PGPR）菌肥对番茄产量、品质和土壤特性的影响

Effects of biofertilizers with PGPR strains from rhizosphere of Haloxylon ammodendron on fruit yield， quality and soil characteristics of tomato

摘要

目的 探究梭梭根际促生菌（PGPR）菌肥对番茄生长、果实产量及根际土壤特性的影响。 方法 课题组前期从梭梭根际土壤中分离得到芽孢杆菌（Bacillus sp.）WM13-24、假单胞菌（Pseudomonas sp.）M30-35和根瘤菌（Rhizobium sp.）WMN-3 3个菌株，并结合已有的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GB03和苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）ACCC17578制备成含有5种促生菌的复合菌肥；以芽孢杆菌WM13-24制备单株菌肥；并以LB培养基和微生物肥料巧农2号作为对照进行番茄（Solanum lycopersicum）田间试验。 结果 与LB培养基对照相比，施用复合菌肥后，番茄的产量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、维生素C含量、有机酸含量、土壤过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性分别增加了73.75%、28.53%、15.73%、75.42%、15.15%、15.71%、1.8倍和26.73%。 结论 PGPR菌肥均可显著改善番茄品质，提高番茄产量。与单株菌肥相比，以梭梭根际促生菌为主要菌源制备的复合菌肥显著提高了番茄产量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、维生素C含量；且优化了番茄根际土壤特性。

Abstract

Objective To explore the effects of biofertilizers with plant growth promoting rhizobacterium (PGPR) strains from the rhizosphere of Haloxylon ammodendron on tomato growth，fruit yield and soil characteristics. Method Three strains of Bacillus sp.WM13-24，Pseudomonas sp.M30-35 and Rhizobium sp.WMN-3 were isolated from H. ammodendron rhizosphere soil, combined with Bacillus amyloliquefaciens GB03 from our laboratory and Sinorhizobium meliloti ACCC17578. The integrated biofertilizer containing five growth-promoting bacteria strains was prepared, and the field experiment of tomato was carried out.Bacillus sp.WM13-24 single biofertilizer，LB medium and microbial fertilizer Qiaonong 2 were used as controls. Result Compared with LB medium,after applying compound biofertilizer, tomato yield, soluble sugar content, soluble protein content, vitamin C content, organic acid content，soil catalase activity，urease activity and phosphatase activity were increased by 73.75%，28.53%，15.73%，75.42%，15.15%，15.71%，1.8 times and 26.73%，respectively. Conclusion PGPR from the rhizosphere of H.ammodendron can significantly improve tomato quality and increase tomato yield. Compared with the single strain bacterial fertilizer, the compound biofertilizer prepared with PGPR from the rhizosphere of H.ammodendron as the main bacterial source significantly increased tomato yield, soluble sugar content, soluble protein content,vitamin C content,and optimized the tomato rhizosphere soil characteristics.

Graphical abstract

关键词

梭梭 / 植物根际促生菌（PGPR） / 复合菌肥 / 番茄 / 土壤酶活性

Key words

Haloxylon ammodendron / plant growth promoting rhizobacteria （PGPR） / compound biofertilizer / tomato / soil enzyme activity

随着人们对植物根际土壤环境的深入研究，微生物在保障土壤和植物健康方面的作用日益受到重视^［1］。微生物肥料也称菌肥、生物肥料，其中含有活的微生物，通过微生物的生命活动，可以活化土壤中的养分，促进植物对养分的吸收；田间施用微生物肥料，可有效改良农业生态环境，提升农产品品质^［2-3］。化肥、农药的不当施用，造成地力下降、土壤养分流失，阻碍了蔬菜作物的养分吸收，限制了其生长^［4］。寻找清洁、绿色、无污染且有较强肥效的肥料对我国粮食产业的发展至关重要，经过科学家们的不断研究和探索，微生物肥料成为提高农业生产力并减少环境破坏的最佳选择^［5］。由于植物生长对营养的需求是多重的，单菌种、单功能的菌肥不能满足农业生产需求。因此，有关菌肥的研究、开发已过渡到多菌种、多功能的复合菌肥。植物根际促生菌（plant grouth promoting rhizobacteria，PGPR）是天然土壤微生物，可作为微生物肥料的重要菌种来源，因其较强的植物根部定殖能力以及具有抑制植物病原菌、促进植物生长和增强抗逆性的作用而备受关注，应用于农业和园艺以及各种作物的潜力巨大^［6-8］。

梭梭（Haloxylon ammodendron）是一种沙漠多汁的旱生灌木，其具有强大的根系，耐旱、耐盐碱和耐贫瘠性极强，因此成为我国几个沙漠地区植被恢复中首选的植物种类，其根际土壤蕴含的根际促生细菌可能在其适应极端环境过程中发挥着重要作用^［9］。课题组前期从位于中国西北部甘肃民勤腾格里沙漠的荒漠植物梭梭根际分离出了290多株细菌，部分菌株已经被鉴定为PGPR菌株，如假单胞菌属（Pseudomonas sp.）M30-35菌株和芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WM13-24菌株均显著促进了多年生黑麦草的生长^［10］。课题组前期研究表明包含假单胞菌属（Pseudomonas sp.）M30-35菌株和芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WM13-24菌株的复合菌肥促进了辣椒的生长和产量^［11］，说明以梭梭根际促生菌为原料制备的复合菌肥将为我国蔬菜作物的增产带来福音。番茄（Solanum lycopersicum）是我国南北方广泛栽培的蔬菜作物，作为番茄生产大国，我国关于番茄的研究在蔬菜科学研究中占有十分重要的地位^［12］。已有报道发现在土壤中施用微生物菌肥或菌剂后番茄生长势较强、抗病性较好、果实品质较佳^［13］。同时，接种丛枝真菌有利于提高园艺植物的产量和品质，维护根际生态平衡、优化土壤结构，促进园艺作物绿色、高效、可持续生产^［14］。探索复合菌肥对番茄生长环境的影响，增强番茄的生长性能，对蔬菜生产实践中高效种植番茄具有重要的指导意义。

本研究使用从梭梭根际中分离得到的芽孢杆菌WM13-24、假单胞菌M30-35和根瘤菌WMN-3 3个菌株，结合已有的解淀粉芽孢杆菌GB03和苜蓿中华根瘤菌ACCC17578制备成含有5种促生菌的复合菌肥，进行了番茄田间试验，并分析了复合菌肥对番茄产量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、维生素C含量、有机酸含量以及土壤过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性的影响，研究了复合菌肥对番茄的增产效益。本研究为利用梭梭根际促生菌研发复合菌肥进而促进植物生长和改善果蔬品质提供了理论依据，并为复合微生物肥料的研发和生产奠定了一定的工作基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本试验以课题组在甘肃民勤腾格里沙漠的荒漠植物梭梭（Haloxylon ammodendron）根际土壤中分离得到的假单胞菌（Pseudomonas sp.）菌株M30-35、芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌株WM13-24、根瘤菌（Rhizobium sp.）菌株WMN-3，商业化的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株GB03和苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株ACCC17578为促生菌株材料；植物材料为甘肃鸿远生物科技有限公司提供的番茄（Solanum lycopersicum）幼苗，品种为普罗旺斯。

1.2 菌肥的制备

5个菌株分别在600 mL的Luria broth （LB）液体培养基中，培养24 h，在28 ℃、180 r/min转速下生产10⁹个菌落形成单位（CFU）/mL。菌液制备完毕后，按照1∶1∶1∶1∶1的体积比混合均匀，交由甘肃鸿远生物科技有限公司生产复合菌肥。采用全部5株促生菌制备复合菌肥；采用芽孢杆菌WM13-24制备单株菌肥（后文分别简述为复合菌肥、WM13-24单株菌肥）。

采用平板计数法测定制备的微生物肥料中有效活菌的数量。在超净工作台中，吸取1 mL微生物肥料悬浮液移入9 mL无菌水中，得到10^-1的菌悬液。经连续稀释后，悬浮液稀释至10^-6时暂停稀释 （每个稀释3次重复），在LB琼脂板上分别涂布100 μL，28 ℃下孵育。待平板上长出菌斑后，记录菌落数并计算制备的微生物肥料中的活菌数。最终测得本研究制备的3种菌肥（WM13-24单株菌肥、复合菌肥和巧农2号微生物肥料）有效活菌数量分别为：5.21×10⁷、5.75×10⁷和2.81×10⁷ CFU/mL。

1.3 田间试验设计

试验地位于兰州市碧桂园（E 103.91036，N 36.103339），年平均降水量327.7 mm。测得土壤总氮为0.612 g/kg；总磷为0.27 g/kg；有机碳为33.04 g/kg；钠离子含量为0.74 g/kg，钾离子含量为0.59 g/kg，钙离子含量为3.35 g/kg；土壤pH值为8.18。

本试验共设置5个处理。以水和LB基底液作为对照，记为CK₁、CK₂；处理分别施用单株菌肥WM13-24、5株促生菌复合菌肥、巧农2号微生物肥料，记为A、B、C。各处理采用随机区组试验设计，每个处理设置3个番茄种植小区（单个小区面积为1 m×2 m=2 m²），作为3次重复。每小区种植番茄10株。

2017年4月下旬移栽番茄苗。每隔3~4 d浇一次水，每隔1~2 d除一次草，具体视环境情况而定。待番茄植株已基本定植后开始施用各处理对应菌肥。每个样方添加菌肥1 500 mL，对照组对应施用等体积的水和LB液体培养基。施用菌肥20 d后，开始测定番茄产量，植株结实期，开始测定植株根际土壤指标，果实成熟期开始测定番茄品质指标。通过对比各处理番茄产量及生理指标，分析复合菌肥对番茄的品质改良、促生增产等效果。

1.4 指标测定

1.4.1 番茄产量

待番茄成熟时，分别记录每次采摘番茄的质量，计算产量，结果换算成每平方米产量。同时记录番茄结实期所结的果实数量。

1.4.2 番茄品质

可溶性糖测定采用蒽酮比色法^［18］；可溶性蛋白测定采用Bradford和Walker的方法^［19］；维生素C含量测定采用紫外分光光度法^［20］；有机酸测定采用滴定法^［21］。

1.4.3 土壤全氮含量

使用凯氏定氮仪^［15］测定土壤全氮含量。

1.4.4 土壤全磷含量

采用钼锑抗吸光光度法^［22］测定土壤全磷含量。

1.4.5 土壤有机碳

用重铬酸钾容量法^［17］测定土壤有机碳。

1.4.6 土壤Na⁺、K⁺、Ca含量

用火焰分光光度计（2655-00 Cole-Parmer仪器有限公司，Vernon Hills，美国）进行离子分析，测定土壤钠离子、钾离子和钙离子含量。

1.4.7 土壤酶活性

土壤过氧化氢酶活性测定采用Johnson和Temple的方法^［23］；土壤脲酶活性测定采用改良的光谱法^［24］；土壤磷酸酶活性使用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒进行测定。

1.4.8 番茄根际土壤有效活菌分离鉴定

试验后期，从各处理番茄植株的根部周围采集土样100 g左右，进行土壤有效活菌数的分离鉴定。每个处理3个重复。各处理称取10 g鲜土，用0.7%的生理盐水振荡40 min后静置，将上清液分别稀释7个梯度（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7）。分别吸取稀释液和原液各100 μL均匀涂布在LB琼脂板上，进行番茄根际有效活菌的分离筛选。生长1~2 d后，每个浓度挑取不同形态的单菌落摇瓶，用通用引物F27（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和R1492（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，产物送至华大基因公司测序，将反馈回的16S rRNA基因序列与EZ-biocloud网站已记录的菌种序列进行比对，将相似度≥98%的可将其鉴定为类似菌种。同时对各处理土壤菌属数进行统计，并分析复合菌肥所用菌株在番茄根际土壤中的定殖情况及其对番茄根际微生物的影响。

1.5 数据统计与分析

每个处理设置至少3个重复，使用Excel 2010和中文版SPSS 17.0进行数据分析、作图、方差分析和样本平均数的显著性分析，用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 菌肥对番茄产量的影响

与水（CK₁）和LB液体培养基（CK₂）两个对照相比，施用WM13-24单株菌肥（A）、复合菌肥（B）和巧农2号微生物肥料（C）后，番茄产量分别显著提高了39.76%、73.75%和54.33%（P<0.05，图1）。

2.2 菌肥对番茄品质的影响

施用WM13-24单株菌肥（A）、复合菌肥（B）和巧农2号微生物肥料（C）后，番茄品质相关生理指标发生了不同程度的变化。与LB液体培养基（CK₂）对照相比，施用WM13-24单株菌肥（A）的番茄可溶性蛋白、维生素C和有机酸含量分别显著增加6.11%、77.09%和22.29%（P<0.05）。施用复合菌肥（B）的番茄可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C和有机酸含量分别显著提高了28.53%、15.73%、75.42%和15.15%（P < 0.05）。施用巧农2号微生物肥料（C）的番茄可溶性蛋白和有机酸含量分别增加了4.54%和10.67%（P < 0.05）（图2）。

2.3 菌肥对番茄根际土壤理化性质的影响

2.3.1 菌肥对番茄根际土壤全磷、全氮的影响

施肥后，番茄根系土壤全氮含量显著上升。施用WM13-24单株菌肥（A）、复合菌肥（B）和巧农2号微生物肥料（C）后的根际土壤全氮含量较水（CK₁）对照分别显著上升67.31%、80.51%和75.03%（P<0.05），与LB液体培养基（CK₂）对照相比，分别显著增加46.87%、58.42%和53.61%（P < 0.05）。施用复合菌肥（B）后番茄根际土壤全氮含量提高最多（图3）。

5个处理的全磷含量较水（CK₁）整体呈显著下降趋势。施用WM13-24单株菌肥（A）、复合菌肥（B）和巧农2号微生物肥料（C）后的根际土壤全磷含量显著下降了69.81%、60.91%和61.57% （P <0.05）。施用WM13-24单株菌肥（A）的下降最多。与LB液体培养基对照（CK₂）相比，各施肥处理对全磷含量的影响均不显著（图3）。

2.3.2 菌肥对番茄根际土壤酶活性的影响

施肥40 d后，施用复合菌肥后的番茄根际土壤过氧化氢酶活性显著提高了15.71%，脲酶活性显著增长了1.81倍，碱性磷酸酶活性显著降低了26.73%（P<0.05）。施用巧农2号微生物肥料后的土壤过氧化氢酶活性显著降低了9.22%（图4）。

2.3.3 菌肥对番茄根际土壤活菌菌属的影响

施用菌肥后，番茄根际土壤菌属数有一定的增加，其中施用复合菌肥的土壤菌属数多于其他处理（表1）。

2.4 番茄根际土壤存活细菌的分离验证

施用复合菌肥后，从番茄根际土壤分离出解淀粉芽孢杆菌GB03的类似菌株：贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensi） CR-520（T）、特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis） KCTC 13622（T）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） KCTC 13429（T） （表2）；芽孢杆菌WM13-24的类似菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） KCTC 13429（T）、蜜蜂类芽孢杆菌（Bacillus nakamural） NRRL B-41091（T）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCIB 3610（T） （表3）；假单胞菌M30-35的类似菌株：假单胞菌属菌株 KMM 3042（T）、CIP 108523（T）、KMM 9500（T）和IPL-1（T） （表4）。施用WM13-24单株菌肥后，从番茄根际土壤分离出芽孢杆菌WM13-24的类似菌株：特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis） KCTC 13622（T）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） KCTC 13429（T）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） ATCC 25096（T） （表5）。

3 讨论

3.1 菌肥可促进番茄生长并提高产量和品质

研究表明，PGPR能够诱导番茄的生长，提高番茄对黄瓜花叶病毒（CMV）感染的抗性^［25］；接种芽孢杆菌促进了黄瓜^［26］和油菜^［27］的生长、增加了番茄^［28］和苹果^［29］的产量；在植物中接种假单胞菌同样具有类似的促生效果^［30］。本试验使用的芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WM13-24是从荒漠植物梭梭根际中分离出的促生菌菌株，试验结果显示其具有良好的促生效果，与前人研究结果一致。此外，本试验研究结果发现施用复合菌肥、WM13-24单株菌肥、巧农2号微生物肥料后，番茄产量均有显著性提高，其中以复合菌肥效果最佳。

可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C和有机酸等碳水化合物是反映植物果实产量的重要指标。在植物中接种根际促生菌将有效增强植物体内碳水化合物的含量，进而提高果实品质。研究发现，接种芽孢杆菌后，增加了砂质土壤中番茄的产量和果实品质，提高了其养分吸收效率^［31］。本试验研究结果显示，施用3种菌肥均可显著提高番茄可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C和有机酸的含量。其中，复合菌肥对维生素C、可溶性糖含量的提高有显著效果。此外，WM13-24单株菌肥对维生素C含量的提高也有良好效果。巧农2号微生物肥料对可溶性糖、维生素C含量提高的效果不显著。

3.2 菌肥可改善番茄根际土壤环境

土壤全氮、全磷含量是衡量土壤肥力水平的重要指标。植物根际促生菌（PGPR）可以提高氮肥的利用效率，促进植物在缺氮土壤中的生长。有报道指出，在钙质土壤中生长的玉米上接种产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、芽孢杆菌（Bacillus）后，玉米芽与根的 N、P 含量与对照相比显著提高^［32］；生物炭结合PGPR可以改善土壤微生物群落结构，提高番茄的氮素利用效率（NUE）^［33］。同时，有研究发现接种PGPR后，杂交番茄的磷吸收量增加了10%^［34］。本试验研究发现，施用3种菌肥后，土壤中的全氮含量呈增加趋势，且均达显著水平。对于全磷含量，施用WM13-24单株菌肥较LB液体培养基对照显著降低，施用复合菌肥和巧农2号微生物肥料后，全磷含量略有上升，但效果不显著。

土壤全氮含量上升可能是植物根际促生菌固氮作用所固定氮的量超过了植物生长所需的量。全磷含量下降可能是由于施加菌肥后，随着土壤微生物数量及活性的增加，降低了土壤对磷的固定；另外，所施菌肥中菌株具有一定的溶磷作用，使土壤磷酸酶活性增强，加快了有机磷转化为无机磷的过程，产生的无机磷被植物大量吸收，导致土壤全磷含量下降。施用复合菌肥后全磷含量较LB液体培养基对照组高可能是多种菌株之间的相互作用，促进了植物对磷的利用率，降低了植株对土壤磷的吸收量。

土壤酶活性常被作为判定土壤质量的重要指标。研究显示生物菌肥冲施黄瓜，促进了黄瓜的生长，增加了土壤中淀粉酶、蛋白酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、以及蔗糖酶的活性^［35］；施用菌肥显著增加了高寒地区紫花苜蓿根际土壤的脲酶、蔗糖酶、蛋白酶活性，其中不同比例的磷肥与混合菌肥配施后的脲酶活性高于单施磷肥或混合菌肥后的酶活性^［36］。本试验研究结果显示，复合菌肥对提高土壤过氧化氢酶和脲酶活性，降低磷酸酶活性的效果显著。巧农2号微生物肥料降低过氧化氢酶活性达到显著水平，碱性磷酸酶的活性下降显著。从施用复合菌肥的番茄根际土壤分离出解淀粉芽孢杆菌GB03、芽孢杆菌WM13-24和假单胞菌M30-35的类似菌株；从施用WM13-24单株菌肥的土壤中分离出芽孢杆菌WM13-24的类似菌株。施入菌肥后，施用复合菌肥和WM13-24单株菌肥的土壤中，可培养活菌数显著增加。在菌属多样性方面，施用复合菌肥的土壤菌属多样性略有增加。

4 结论

梭梭PGPR菌肥可显著改善番茄品质，提高番茄产量，其中以复合菌肥的效果最佳。本试验证明与单株菌肥相比，以梭梭根际促生菌为主要菌源制备的复合菌肥显著提高了番茄产量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、维生素C含量等；且优化了番茄根际的土壤特性。本研究为利用荒漠植物根际促生菌研发复合菌肥进而促进植物生长和改善果实品质提供了理论依据，并为将来大规模应用荒漠植物根际促生菌研发和生产多种复合菌肥奠定了一定的工作基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31222053)