樟子松优树群体遗传多样性评价及指纹图谱构建

Genetic diversity assessment and fingerprint construction of superior tree populations of Pinus sylvestris var.mongolica

摘要

目的 分析从内蒙古红花尔基、河北丰宁、河北围场以及辽宁章古台地区收集的樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）优树资源遗传多样性及其遗传结构差异，构建樟子松优良单株的指纹图谱，为优树资源保存和利用提供依据。 方法 利用简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）分子标记技术，根据所得结果进行遗传多样性分析，通过非加权组平均法（UPGMA）进行基于亲缘关系的聚类分析，构建99个樟子松优树指纹图谱。 结果 12对SSR引物共扩增35个等位基因，每个位点平均扩增出5.25个等位基因和3.112个有效等位基因，不同位点的PIC值在0.202~0.932之间，平均PIC值为0.558；聚类分析表明，99个樟子松优良单株中相同来源的个体并没有聚为一类，各单株的聚类与现有栽培区不存在明显的规律，樟子松优树资源遗传组成复杂；指纹图谱的构建结果表明，引物lw_isotig17679、lw_isotig21953、lw_isotig27940、lw_isotig02842、lw_isotig00080、lw_isotig05123、lw_isotig 02138进行组合，可鉴别99份樟子松优良单株材料，分辨率为100%。 结论 4个地区的樟子松优树资源遗传多样性丰富，个体和群体的遗传距离分散均匀，樟子松优良单株指纹图谱能够用于樟子松个体鉴定和亲缘关系分析。

Abstract

Objective Understand the genetic diversity and to construct the fingerprints of superior individual trees of Pinus sylvestris var.mongolica from Honghuaerji，Fengning，Weichang and Zhanggutai in order to provide a basis for the preservation and utilization of excellent tree resources. Method Genetic diversity was analyzed according to the results by simple sequence repeats molecular marker method，the unweighted group average (UPGMA) method was used for cluster analysis based on genetic relationship and construction of fingerprints of 99 superior individuals. Result Total of 35 alleles were identified using 12 pairs of SSR primers，with a mean of 5.25 alleles and 3.112 effective alleles per locus.PIC values of different loci ranged from 0.202 to 0.932，with an average of 0.558;The results of cluster analysis showed that individuals from the same origin of 99 materials were not clustered into one group according to their genetic relationship. There were not obvious correlations between grouping and current growing regions of the clones. The results of fingerprinting showed that the combination of primers lw_isotig17679，lw_isotig21953,lw_isotig27940，lw_isotig02842，lw_isotig00080，lw_isotig05123 and lw_isotig02138 could identify 99 superior materials, the resolution was 100%. Conclusion The genetic diversity of Pinus sylvestris var. mongolica in four areas is relatively high. The fingerprint of superior tree can be used to identify the individual and genetic relationship analysis.

Graphical abstract

关键词

樟子松 / SSR标记 / 指纹图谱 / 遗传多样性

Key words

Pinus sylvestris var.mongolica / SSR makers / fingerprint / genetic diversity

樟子松（Pinus sylvestris var.）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物，是我国珍贵的沙地树种^［1-2］，具有抗逆性强、生长快、成材早、耐寒性和深根性等特性^［3］。樟子松是我国北方地区重要的水土保持、防风固沙和水源涵养树种^［4］，也是东北地区主要速生用材和庭园观赏树种^［5］，被广泛的应用于三北防护林建设中^［6］，具有极高的生态效益、经济效益和社会效益^［7］。从20世纪90年代起育种工作者开展樟子松遗传多样性研究，初期主要以表型测定和地理变异研究为主，秦泅华等^［8］研究了樟子松生长性状的地理变异规律，表明樟子松纬向呈现负向渐变趋势，经向呈现明显的随机变异规律；肖杰等^［9］通过培育不同地区樟子松幼苗并统计表型变化，认为樟子松种源间种源内都存在丰富的变异。近年来，随着分子标记技术的发展，樟子松遗传多样性研究进入了分子标记时代，周志强等^［10］利用ISSR技术分析了天然樟子松林在不同海拔和群落下的遗传多样性，发现海拔和纬度差异一定程度上影响了樟子松遗传分化，而不同的群落类型对樟子松群体的遗传多样性影响较低；苗禹博等^［11］利用SSR标记技术分析不同地区樟子松育种资源的遗传多样性参数以及遗传差异，发现不同樟子松群体之间的空间分布与遗传距离呈现明显的正相关关系。目前，樟子松遗传改良正处于升级换代的关键时期，在高世代种子园营建过程中，樟子松引种信息不清楚，以半同胞子代为基础的高世代育种材料亲缘关系难鉴别，高世代育种材料偏少等问题不可避免产生，这导致出现樟子松高世代种子园近交水平显著上升，近交衰退的风险增加，樟子松高世代种子园种子的遗传多样性降低等。因此，开展樟子松遗传多样性评价，建立一套快速、准确的鉴定方法，能够为樟子松引种、营建种子园以及遗传改良提供理论依据和奠定基础。

简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）分子标记具有灵敏度高、多态性好、稳定可靠等优点^［12-13］，是遗传多样性分析及群体亲缘关系区分的标记方法之一^［14］，被广泛应用于品种鉴定、多样性分析、指纹图谱的构建等研究中^［15］。指纹图谱能够利用植物某个基因型特有标记对其进行准确的鉴定，是亲本鉴定的依据，也是遗传多样性的基础^［16］，近些年在林木的应用也越来越多。刘超凡等^［17］以141份杨树无性系为材料利用筛选出的14对引物进行遗传多样性分析，构建其DNA指纹图谱；毛秀红等^［18］以49份刺槐种质为材料利用 8对核心引物进行了遗传多样性分析，并完成了DNA指纹图谱的构建；雷阿娜等^［19］利用22对多态性高的引物构建黄帝手植柏DNA指纹图谱；赵阿风等^［20］利用8对多态性较高的引物分析了120份马尾松无性系遗传多样性，成功构建其DNA指纹图谱。而目前针对樟子松研究主要集中在遗传多样性、遗传关系的分析^［21］，而利用SSR分子标记对樟子松育种资源进行指纹图谱构建鲜见报道。

本研究以红花尔基天然林和丰宁、围场、章古台人工引种林，4个地区的樟子松群体作为研究对象，利用本课题组开发的12对樟子松特异SSR分子标记^［22］，计算优树群体的遗传多样性参数，构建不同地区樟子松优树SSR指纹图谱，分析不同地区优良单株的遗传多样性差异，为樟子松的种子园营建、遗传改良等方面提供理论依据，促进SSR分子标记在樟子松育种工作中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为红花尔基 （HHEJ） 、章古台 （ZGT） 、围场 （WC） 、丰宁（FN）共4个地区的樟子松优良单株，其中章古台、围场、丰宁的种源来自红花尔基地区天然林的混杂种子，具有相同的遗传背景，人工林建成后，没有进行人为选择干预，所有引种樟子松均在自然选择的压力下生长、繁殖、筛选、淘汰。基本信息情况见表1。2019年10~11月，在材料采集地选取樟子松当年生松针8~10针，装入离心管中迅速置于液氮，做好标签，放入-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 樟子松DNA 提取与PCR 扩增

所有实验材料的针叶 DNA 均采用艾科瑞生化科技有限公司植物基因组DNA 提取试剂盒（货号AG21011） 按照说明书进行提取，-20 ℃保存备用。PCR反应体系总体积21 μL，包含1 μL基因组DNA，0.3 μL上游引物，1 μL下游引物，0.7 μL荧光引物，10 μL Mix，8 μL ddH₂O。PCR扩增反映程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，最适退火温度（55 ℃）30 s，72 ℃延伸30 s，10个循环；95 ℃ 30 s，最适退火温度降低2 ℃（53 ℃）30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。引物具体信息见表2。

1.3 数据分析

PCR 扩增产物由北京睿博兴科生物技术有限公司用毛细管电泳法检测，利用Gene marker 2.2.0软件进行峰值读取，Excel 记录整理数据；用GenALEx 6.5软件计算平均等位基因数N_a 、有效等位基因数N_e 和Shannon信息指数I；用powermakerV3.25软件计算多态性信息量PIC；利用PowerMarkerV3.25软件计算基于等位基因频率的Nei1983距离，并对Nei1983距离进行UPGMA聚类，用MEGA7.0.14查看聚类结果，根据聚类结果分析亲缘关系情况。根据每对SSR引物的带型结果，组合形成每个无性系的SSR指纹图谱，根据指纹图谱的差异，再区分樟子松优良单株。

2 结果与分析

2.1 12对引物遗传多样性分析

利用12条引物扩增的SSR位点进行计算，99个样本中共扩增出35个等位基因，其中每个位点平均扩增出5.25个等位基因，lw_isotig27940引物为最多，有15个等位基因，最少的是引物lw_isotig05123，只有2个等位基因；有效等位基因数（N_e ）为1.313～10.574，平均值为3.112；Shannon’s信息指数在0.339~2.461范围内波动，平均值为1.124；不同位点的PIC值在0.202~0.932范围之间变化波动很大，平均PIC值为0.558（表3）。根据Botstein（1980）的理论^［23］，有1个标记为低度多态位点（PIC<0.25），4个标记为中度多态位点（0.25<PIC<0.5），其他7个为高度多态位点（PIC>0.5）。以上遗传多样性参数结果均表明99份樟子松优良单株遗传多样性较高。

2.2 樟子松优树群体间的遗传关系分析

聚类分析是将育种资源根据它们综合性状之间的相近程度进行分类，以4个樟子松育种群体的遗传相似系数为依据，采用UPGMA法进行聚类分析，分别得到供试樟子松群体和个体的遗传关系聚类图。聚类结果显示4个群体被分为3大类群（图1）。其中，围场、丰宁2个群体遗传距离最近，两者聚为一类；其余2个种群各为一类，而红花尔基群体遗传距离相对较远，距离最远的群体是章古台群体，说明章谷台群体差异较大。从个体聚类图中可以发现（图2），各优株间都存在着不同程度的亲缘关系，各地区樟子松材料并没有明显被区分开，分散在每个类群中，来源地相同的个体并没有根据亲缘关系相似而聚为一类，表明聚类结果与樟子松种质的地域来源并没有显著的相关性。

2.3 樟子松优树指纹图谱构建

构建种质DNA指纹数据库，最有效便捷是分子标记引物组合法^［24］。所有樟子松个体并未有明显特征谱带，无法通过1对引物将其全部区分开，因此需要利用引物组合进行区分（图3~6）。结果发现，发现引物lw_isotig27940和lw_isotig21953组合的分辨率最高，能够鉴别40份樟子松优良单株材料，分辨率为40.4%；使用引物lw_isotig17679、lw_isotig27940和lw_isotig21953组合，能够区分58份樟子松优良单株，分辨率为58.5%，使用引物lw_isotig17679、lw_isotig27940、lw_isotig21953和lw_isotig00080组合，能够区分72份樟子松优株，分辨率为72.7%。最终选取7对多态性信息含量高的引物lw_isotig17679、lw_isotig21953、lw_isotig27940、lw_isotig04306、lw_isotig00080、lw_isotig20215、lw_isotig11166进行组合用来构建樟子松SSR指纹图谱，分辨率为100%。7对引物构建樟子松优株的唯一的指纹图谱。

3 讨论

种群的遗传多样性决定了一个种群是否能够适应复杂的环境，遗传多样性越高种群对不同环境的适应性越强，就越能抵抗环境变化所产生的冲击^［25］。而亲本的遗传多样性会直接影响无性系造林、母树林、采穗圃以及种子园营建等方面。本研究利用12对SSR引物对4个群体共99份樟子松优良单株材料进行遗传多样性分析，共检测到35个等位基因，平均每个位点扩增出5.25个等位基因和3.112个有效等位基因，与王思琪^［26］在红花尔基地区挑选的3个群体（平均等位基因数分别为1.154、1.202和1.196）相比，各群体的遗传组成更复杂，遗传多样性更高，也高于苗禹博^［11］利用SSR标记得到的4个樟子松群体结果（平均等位基因数分别为1.852 4、1.849 8、1.999 8和2.110 5）。99份材料不同位点的Shannon’s信息指数为1.124，PIC值变化差异较大，在0.202~0.932之间，平均PIC值为0.558，也证明不同单株材料间具有较高的遗传多样性，具备一定的遗传改良育种潜力，可为营建高世代种子园提供优良丰富的原材料。同一地区的种群内变异大，说明种群内杂交程度较高，河北丰宁、河北围场以及辽宁章古台地区的人工林中林分仍有进一步选择疏伐的空间，人工引种林应采取多无性系间隔搭配以及适宜的栽培管理措施，与内蒙古红花尔基天然林内的自然杂交程度相接近。同时本研究所使用的引物从分子水平上为樟子松群体遗传多样性分析提供了参考价值，也可以为其他针叶树多样性研究提供可靠的引物资源和理论依据。

UPGMA聚类分析结果显示，4个群体被分为3大类群。其中，河北围场和丰宁2个群体聚成一类，遗传距离相对较近；内蒙古红花尔基群体和辽宁章古台群体各自为一类，与河北围场和丰宁遗传距离相对较远。分析结果符合地区相近遗传关系较近的规律，由于地理距离差异会存在基因交流的限制，不同种群在不同生境的长期适应最终导致各地区种群间差异大、种群间遗传分化强烈。个体聚类结果则显示各地区99份樟子松材料并没有明显被区分开，来源地相同的个体并没有根据亲缘关系相似而聚为一类。这可能由于个体间发生的遗传变异在4个地区群体中均存在或存在相似遗传变异，总体遗传变异的比例、模式相近，所以在聚类过程中不同群体内的个体并不会因为地区差异而聚成一类。

4 结论

SSR分子标记特异性强、谱带清晰、数据准确，适合大量资源的指纹图谱构建工作^［27］。本研究利用12对SSR引物对4个地区种群的99份樟子松优良单株分别构建指纹图谱，由于樟子松优良单株的多态性位点丰富，1条引物无法对不同个体进行鉴别。利用2对引物以上组合可以将4个种群的个体鉴定出来，不同引物组合在鉴定不同种群时有不同的分辨率，利用lw_isotig17679、lw_isotig21953、lw_isotig27940、lw_isotig02842、lw_isotig00080、lw_isotig05123、lw_isotig02138进行组合可以将99份材料鉴定出来，分辨率为100%。樟子松指纹图谱能够使每份优良单株具有唯一的一套DNA指纹，这可为樟子松种质资源鉴定、管理与保护奠定基础和提供技术支撑，为樟子松的引种、种子园营建和遗传改良提供科学的理论依据。

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基金资助

国家林草局生物安全与遗传资源管理项目(KJZXSA202030)

国家自然科学基金项目(31770713)