除草链格孢菌HY-02的培养和发酵条件优化

Optimization of culture and fermentation conditions of Alternaria alternate HY-02

摘要

目的 明确生防菌株HY-02的除草活性，探究最优培养基成分配比及其最适发酵条件。 方法 通过7种固体培养基的筛选确定菌株HY-02的最适固体培养基，利用单因素试验优化菌株的各成分配比，筛选出菌株HY-02最佳发酵培养基；通过响应面设计筛选出最佳碳、氮源及无机盐的成分配比；对温度、转速、装液量、发酵时间及pH等条件进行筛选，得到最适培养条件。 结果 通过优化，菌株HY-02最佳碳、氮源及无机盐的成分配比为：蔗糖：79.789 g/L，NaNO₃：8.763 g/L，无机盐：5.472 g/L（其中K₂HPO₄ 3.44 2g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO₄•7H₂O 1.147 g/L、FeSO₄ 0.022 9 g/L）。最适发酵条件：装液量200 mL、发酵时间4 d、温度25 ℃、转速165 r/min和pH=7。 结论 通过优化提高了菌株HY-02的产孢量，为生防制剂的研究奠定理论基础。

Abstract

Objective In order to clarify the herbicidal activity of biocontrol strain HY-02，to explore its optimal medium composition and optimal fermentation conditions. Method The optimum solid medium of strain HY-02 was determined by screening seven kinds of solid medium.The composition ratio of strain HY-02 was optimized by single factor test，and the best fermentation medium of strain HY-02 was selected.The optimum proportion of carbon，nitrogen and inorganic salts was selected by response surface design.The optimum culture conditions were obtained by screening the conditions such as temperature，rotating speed，liquid loading，fermentation time and pH. Result The optimum composition ratio of carbon，nitrogen source and inorganic salt of strain HY-02 is as follows: sucrose: 79.789 g/L，NaNO₃: 8.763 g/L，inorganic salt: 5.472 g/L (including K₂HPO₄ 3.442 g/L，KCl 0.860 g/L，MgSO₄ • 7H₂O 1.147 g/L,FeSO₄ 0.022 9 g/L).The optimum fermentation conditions were as follows: liquid loading was 200 mL，fermentation time was 4 days，temperature was 25 ℃,rotating speed was 165 r/min and pH at 7. Conclusion The spore production of strain HY-02 was improved by optimization，which laid a theoretical foundation for the research of biocontrol agents.

Graphical abstract

关键词

菌株优化 / 生防制剂 / 除草活性 / 发酵条件 / 培养基成分配比

Key words

strain optimization / biocontrol agents / herbicidal activity / fermentation conditions / composition ratio of culture medium

农田杂草是危害农作物产量和品质的罪魁祸首之一^［1］，近年来我国农田草害发生面积约为9 246.7万hm^2［2］，大大降低了农作物的收获量。目前，杂草防除主要使用化学农药，造成了严重的环境污染，打破了生态平衡^［3］。化学农药的副作用，使得人们对开发生防制剂产生了更大的兴趣^［4］。微生物除草剂的产生，极大地改善了农田药害问题，使得生物防治成为了农田病虫草害的最佳防治技术^［5］。

前人对于微生物除草剂的报道已经有很多。例如，强胜等^［6］开发研制出的生物除草剂杀草毒素AAC-Toxin对杂草的防效两天内达100%。陈超^［7］研究发现，从特定环境中筛选出了具有生防潜力的毛壳菌，该菌可以诱导植物产生抗性。Thomas等^［8］发现了一种马缨丹柄锈菌可以防治马缨丹，尤其在热带雨林地区特别成功。从向日葵上分离的镰刀菌属（Fusarium sp.）真菌能抑制列当种子的萌发^［9］。埃及科学家筛选出的链格孢属真菌（Alternaria alternate）可有效控制水葫芦，从该菌中分离得到的毒素还可以破坏某些植物的光合作用，例如紫茎泽兰（Eupatorium edenophorum），从而对其产生毒害^［10］。

随着发酵技术的日趋优化和成熟，优化工艺配方为微生物除草剂的生产提供了技术支持，是微生物除草剂实现产业化生产的关键，为生物农药提供了前所未有的发展契机^［11］。梁玎玎^［12］研究发现草茎点霉（Phoma herbrum）SYAU-06菌株经过发酵优化制成水乳剂对盆栽鸭跖草（Commelina communis）的防治效果达到51.36%。Li等^［13-14］利用固体发酵方式对毛壳霉属和曲霉属真菌进行发酵，从其代谢产物中分离得到了抗肿瘤物质。王国平等^［15］为了提高木霉菌素的产量，通过优化得到了最佳培养基配方。朱海霞等^［16］利用正交设计法对极细链格孢的最适碳氮源、初始含水量、接种量等优化获得了菌株发酵所需的最佳条件。

除草活性链格孢（Alternaria alternate）真菌HY-02菌株是从青海省湟源县波航乡采样，由自然感病的巴天酸模（Rumex patientia L.）叶片分离得到，经过前期致病性和作物安全性研究发现，该菌株对恶性阔叶杂草藜（Chenopodium album）、猪殃殃（Galium spurium）、萹蓄（Polygonum aviculare）、酸模叶蓼（ Polygonum lapathifolium）、冬葵（Malva verticillata）、密花香薷（Elsholtzia densa）均具有不同程度的致病性，对禾本科作物小麦 、青稞表现安全。为了明确该菌株发酵所需的培养基配方和发酵工艺，本研究通过对HY-02菌株进行发酵条件优化，旨在探究该菌株的最佳产孢量以及最佳发酵条件，为探究其除草活性组分奠定基础，为下一步将其制成生防除草剂提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株HY-02从自然感病的巴天酸模分离得到，此菌株被鉴定为链格孢（Alternaria alternate）真菌，将菌株培养于PDA斜面上，保存于青海省农科院植保所有害生物综合防治实验室。

1.2 菌株培养

取斜面上培养的菌丝于PDA培养基上培养5 d，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 固体培养基的筛选

选择7种不同的固体培养基（表1），将培养好的菌株打菌饼（Φ=8 mm），接于7种培养基平板中央，放在25 ℃培养箱中培养7 d，每天观察并测量其菌落直径及菌落形态，重复3次，选择长势（菌落直径和菌丝形态）最好的培养基为固体基础培养基。

1.3.2 培养基的优化

以察氏培养基为基础培养基，对培养基各成分进行单因素试验。将活化的培养基中打菌饼（Φ=8 mm）接于装有基础培养液的三角瓶（250 mL）中，于25 ℃、180 r/min条件下摇床培养7 d，测定最大吸收波长λ=640 nm的D值，重复3次。培养基各成分及水平选择如表2所示。

1.3.3 成分及配比优化

根据中心组合设计原理，对碳、氮源及无机盐进行成分配比优化，以单因素结果为中心点，菌株HY-02的D（D=600 nm）值为响应值（Y），设计3因素3水平的响应面（RSM）试验，其因素及水平如表3所示。

1.3.4 发酵条件优化

以优化的培养基为发酵培养基，分别测定不同培养温度（22、25、28、31和34 ℃）、摇床转速（150、165、180、195和210 r/min）、初始发酵时间（1、2、3、4、5、6和7 d）、pH（5、6、7、8和9）和装液量（75、100、125、150、175、200和225 mL/瓶）对菌株HY-02的OD值的影响，每处理重复3次。

1.4 统计分析

采用DPS 9.0、Design Expert 12和Excel对试验数据进行统计分析，采用新复极差法比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 培养基的筛选

7 d后，菌株HY-02在7种培养基上的形态如图1所示，在PDA培养基上，菌落呈灰色，气生菌丝不发达，边缘不整齐，菌丝呈絮状；在PSA培养基上，菌落呈灰黑色，菌落边缘整齐，气生菌丝发达，菌丝呈絮状；在NB 培养基上，菌落呈黄褐色，气生菌丝发达，菌丝呈绒毛状；在察氏培养基上，菌落白色，呈绒毛状，长至后期颜色变为粉红色，菌落边缘整齐，气生菌丝发达；在孟加拉红培养基上，前期菌落表面呈白色，后期呈黄色，菌丝呈绒毛状边缘整齐，气生菌丝不发达，菌落不扩大生长；在培养基Ⅰ上，菌落呈白色，菌丝呈雪花状，边缘不整齐，后期菌丝体退化；在培养基Ⅱ上，菌落呈灰白色，边缘不整齐，菌丝呈絮状，气生菌丝不发达，生长后期凹凸不平。

菌株HY-02在7种培养基上菌落直径大小比较如图2和表4所示，5 d后，察氏培养基中菌落直径最大，为5.70 cm；孟加拉红培养基中直径最小，为3.03 cm；7种培养基菌落直径之间差异显著。7 d后，7种培养基菌落直径相比较差异显著，察氏培养基中菌落直径最大，为7.50 cm；菌丝体发达如图1所示。

2.2 培养基单因素优化

2.2.1 蔗糖

由图3-A可知，随着蔗糖含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，当蔗糖的含量是70 g/L时，D值最大，之后随蔗糖含量增加，D值减小。说明70 g/L的蔗糖为菌株HY-02发酵的最适碳源量。

2.2.2 硝酸钠

由图3-B可知，随着硝酸钠含量增加，菌株HY-02的D值先增加后降低，当硝酸钠含量为12 g/L时，D值最大，之后随硝酸钠含量增加，D值减小。说明12 g/L的硝酸钠为菌株HY-02发酵的最适氮源量。

2.2.3 K₂HPO₄

由图4-A可知，随着无机盐K₂HPO₄含量的增加，菌株HY-02的D值先增加后降低，当K₂HPO₄含量为6 g/L时，D值最大，之后随K₂HPO₄含量增加，D值减小。说明6 g/L的K₂HPO₄为菌株HY-02发酵的最适含量。

2.2.4 KCl

由图4-B可知，随着KCl含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，当KCl为1.5 g/L时，D值最大，之后随KCl含量增加，菌株HY-02D的D值先降低再增加又降低。说明1.5 g/L的KCl为菌株HY-02发酵的最适含量。

2.2.5 MgSO₄·7H₂O

由图5-A可知，随着MgSO₄·7H₂O含量增加，菌株HY-02的D值先降低后增加，当MgSO₄·7H₂O含量为2.0 g/L时，D值最大，之后随着MgSO₄·7H₂O含量增加，D值先增加后减小。说明2.0 g/L的MgSO₄·7H₂O为菌株HY-02发酵的最适含量。

2.2.6 FeSO₄

由图5-B可知，随着FeSO₄含量增加，菌株HY-02的D值呈增加趋势，当FeSO₄含量为0.04 g/L时，D值最大，之后随FeSO₄含量增加，D值先减小后增加。说明0.04 g/L的FeSO₄为菌株HY-02发酵的最适含量。

2.3 成分配比及优化

根据单因素优化结果，对菌株HY-02的液体培养条件，利用中心组合试验设计3因素3水平试验，结果如表5所示。

以菌株HY-02发酵液的D值（Y）为响应值，根据中心组合的试验结果（表6）进行分析得到D值与蔗糖（A）、NaNO₃（B）、无机盐（C）的二次多项回归方程：

Y=0.665 2+0.008 1A+0.059 8B-0.001 4C-0.071 3AB+0.071 5AC-0.038 7BC-0.109 1A²-0.142 9B²-0.173 6C²。

通过方差分析上述回归模型可知（表6），回归模型的P=0.001 5，失拟项的P值0.099 4>0.05，模型回归检验极显著，失拟检验不显著，说明未知因素对试验的干扰很小，模型稳定，回归方程的决定系数为94.23%，说明该方程与实际情况符合，反映了菌株HY-02的D值与碳源、氮源和无机盐之间的关系，该模型能够对菌株HY-02的D值进行分析和模拟。

模型数据显示，一次项B及交互项AB、AC及二次项A²、B²、C²影响显著，各因子的影响主次顺序：C²> B²> A²> B >AB> AC > BC >A> C。

根据试验因素间交互效应三维立体响应面和等高线图（图6~8），在确定一个因素的情况下，观察其他两个因素对OD值的影响，蔗糖、硝酸钠、无机盐三者交互作用响应面为开口向下的凸形曲面，且交互效应的等高线形状为圆形，说明两两之间的交互作用效果较显著。利用回归方程得到菌株HY-02液体发酵培养基产孢量的培养基条件为：蔗糖79.789 g/L，硝酸钠8.763 g/L，无机盐5.472 g/L（其中K₂HPO₄ 3.442 g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO₄•7H₂O 1.147 g/L、FeSO₄ 0.0229 g/L）。

2.4 发酵条件优化

2.4.1 发酵温度

由图9-A可知，随着发酵温度的升高，菌株HY-02的D值呈增加趋势，当温度为25 ℃时，D值最大，之后随温度的升高，D值减小，说明25 ℃为最佳发酵温度。

2.4.2 转速

由图9-B可知，随着转速的增加，菌株HY-02的D值也随之升高，当转速达到165 r/min时，菌株HY-02的D值达到最大，之后随转速增加，D值逐渐减小。故菌株HY-02的最适转速为165 r/min。

2.4.3 装液量

根据锥形瓶容量的不同分别设置不同梯度的装液量，由图10-A可知，随着装液量的增加，菌株HY-02发酵液的D值先增加后减小，当装液量为200 mL/瓶时，菌株HY-02的D 值最大，之后随装液量增加，D减小。说明最适装液量为200 mL/瓶。

2.4.4 发酵时间

分别于不同发酵时间测定菌株HY-02的OD值。由图10-B可知，在发酵时间为1~3 d，菌株HY-02的D值先减小后变大，当菌株发酵到第4天时，菌株的D值达到最大值，之后随时间变长，D值先减小后增加，但第7天测得的D值较最大值略小，所以，选择发酵时间为4 d作为菌株HY-02的最适发酵时间。

2.4.5 pH

分别设置不同的pH梯度测定菌株HY-02的D值。由图11可知，随pH值增加，菌株D值呈增加趋势，当pH=7时，菌株D值最大，之后菌株D值也变小。故选择pH=7为该菌株最适pH。

3 讨论与结论

微生物除草剂不仅可以消除化学农药的抗药性、残留等缺点，而且可以弥补菌株退化、货架期短等的不足，为农业生产带来很多便利。微生物的发酵会受到碳氮源、基质含水量、发酵温度、发酵时间、转速、pH等发酵条件的影响，不同因素对菌体生长和产物合成产生不同的影响差异 ^［17-18］。通过微生物发酵条件优化，既能提高菌剂的防效，又能促进活性物质的产生^［19-20］。

前人利用固体和液体发酵方式获得活性物质，例如Abouzied等^［21］利用大米为基础培养基对不同镰刀菌进行发酵优化，并分离出了化合物。Ahsan等^［22］筛选了链霉菌（Streptomyces sp.）TA 1123菌株，并对其进行发酵条件的优化，提高了菌株TA 1123的抗生素产量和质量。在本研究中，菌株HY-02的最适碳源为蔗糖，这与杜艳丽等^［23］的研究结果一致。尹艳楠等^［24］对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） NJSZ-13菌株进行优化，其用pH=7的条件发酵菌株，使菌株产孢量增加，与本研究结果相似。朱海霞等^［25］通过对具有除草活性的生防菌株HZ-31进行发酵条件优化，选择无机氮源作为发酵优化的最适氮源与本研究结果一致，能够增加菌株HY-02的产孢量。杨莹等^［26］利用中心组合优化PA-2菌株所用的无机盐，与本研究中所采用的无机盐的作用相似，均能起到调节作用，能促进菌株产孢。本研究利用7种不同固体培养基筛选得到最适培养基为察氏培养基，以察氏培养基为基础，对各组分进行优化得到最佳配比（蔗糖：79.789 g/L，NaNO₃：8.763 g/L，无机盐：5.472 g/L），为除草活性物质的分离和纯化奠定了基础。

本研究对菌株HY-02发酵条件进行优化，得到最佳碳、氮源及无机盐的成分配比为：蔗糖：79.789 g/L，NaNO₃：8.763 g/L，无机盐：5.472 g/L（其中K₂HPO₄ 3.442 g/L、KCl 0.860 g/L、MgSO₄•7H₂O 1.147 g/L、FeSO₄0.022 9 g/L）。最适发酵条件为：温度25 ℃，转速165 r/min，装液量200 mL，发酵时间4 d、pH=7。菌株HY-02的液体发酵优化，为菌株的液体发酵提供了最优配方和条件，但未对固态发酵条件探索，是否满足工业生产和田间防除杂草还需要更多的发酵数据去验证。下一步将对该菌株的剂型、田间药效、除草机理等进行系统研究，为该菌的剂型研究以及以后菌剂的规模化生产提供技术参考，为菌株HY-02开发出新型生物除草剂奠定基础。

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基金资助

青海省中央引导地方科技发展资金项目“复合微生物除草剂的开发及利用”(2022ZY034)