甘肃省珍稀野生食用菌新记录种

A new record species of rare edible fungus in Gansu Province —— Tuber formosanum

摘要

目的 对采自甘肃省陇南市康县的块菌标本通过形态特征和分子标记进行物种鉴定。 方法 对块菌标本进行宏观和显微形态的研究；对其ITS序列进行扩增和测序，构建分子系统发育树，解析其系统发育位置。 结果 系统发育树显示，标本（zhu4361-1、zhu4361-2、zhu4361-3、zhu4361-4）以100%的支持率与台湾块菌的相关序列聚于一支，结合形态学研究结果，最终确定所采集块菌标本均为台湾块菌（Tuber formosanum H.T.Hu & Y.Wang.），凭证标本保存于西北师范大学生命科学学院标本室。 结论 采自甘肃省陇南市康县的块菌标本为台湾块菌，是甘肃省的新记录种。

Abstract

Objective To identify the truffle specimens collected from Kangxian Country, Longnan City, Gansu Province. Method The morphology of the truffle specimens were analyzed with macroscopic and microscopic examination, ITS sequences were obtained by PCR and sequencing, and the molecular phylogenetic tree was constructed based on ITS to clarify the phylogenetic position. Result The molecular phylogenetic tree showed that the specimens (zhu4361-1, zhu4361-2, zhu4361-3, zhu4361-4) were united with sequences of Tuber formosanum H.T.Hu&Y.Wang in a bootstrap value of 100%, and were identified as Tuber formosanum based on both morphological and molecular phylogenetic evidence. The voucher specimens were preserved in the herbarium of Northwest Normal University. Conclusion The truffle specimens collected from Kang Country, Longnan City, Gansu Province is Tuber formosanum, which is a newly recorded species in Gansu Province.

Graphical abstract

关键词

台湾块菌 / 新记录种 / 珍稀食用菌 / 形态特征 / 分子鉴定

Key words

Tuber formosanum / new record species / rare edible fungus / morphological characteristics / molecular identification

块菌属（Tuber）真菌，俗称松露，隶属于子囊菌门（Ascomycota）、盘菌纲（Pezizomycetes）、盘菌目（Pezizales）、块菌科（Tuberaceae），是一类常具有黑褐色或暗色子囊果的真菌，一般与树木共生形成外生菌根，其子囊果多生于地下^［1］，主要分布在青冈栎（Cyclobalanopsis glauca （ Thunb.） Oerst.）、油松（Pinus tabuliformis Carr.）、云南松（Pinus yunnanensis Franch.）、板栗（Castanea mollissima）、栓皮栎（Quercus variabilis）等树下土壤中^［2］。目前全球已报道的块菌属物种约150种。欧洲块菌的食用和研究历史较早，主产于法国、意大利和西班牙，其余国家也有分布^［3］，与西方相比，我国对于块菌的认识和研究起步较晚，但近几年发展迅速，大量的新种和新记录种不断被发现和报道^［4-6］，目前全国已记录有84个块菌属物种^［7］，主要分布在云南、四川等西南地区，另外在内蒙古、河北、辽宁、山西、甘肃以及北京等地也有分布^{［3，7-8］}。块菌味道鲜美，营养丰富，但产量较少，因此价格昂贵，在西方国家享有“黑钻石”“地下黄金”等美誉，形成了独特的松露文化^［9-10］。目前我国已成为世界上主要的块菌出口国之一，但过度的开采使我国的块菌生态环境遭到了极大破坏，很多块菌资源尚未成熟就被挖掘流入市场，产量急剧下降，濒危物种日益增多，资源的保护迫在眉睫。

台湾块菌（Tuber formosanum H.T.Hu&Y.Wang）最早在1992年被作为一个新种进行了描述^［11］，但由于没有指定模式标本，因此不被认为是有效发表。2009年该物种被证实确为一个独立的分类单元^［12］，并于2013年被正式发表^［13］。目前在中国的台湾、云南、四川、河北、内蒙古、北京等地均发现了台湾块菌的子实体^［2，14］，在江苏南京的林下土壤中发现了该种的ITS序列^［6］，但甘肃省尚未有台湾块菌分布的相关研究和记录。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

2021年1月，本研究组从甘肃省陇南市康县阳坝阔叶林中化香树（Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc.）下采集得到若干份块菌子实体标本。采集地为西秦岭南侧康南林区，地理坐标E 105°76′ 90.88″、N 33°1′37.4″，海拔980 m。

1.2 试验方法

对所采集标本的宏观特征进行观察和记录，包括颜色、大小和形状等；利用光学显微镜观察记录显微结构特征，包括子囊的形状和大小、孢子的形状大小等。

采用CTAB法对所采集的块菌子实体进行总DNA的提取，PCR扩增其ITS序列，引物ITS5和ITS4^［15］，扩增体系为：2× F8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 μL（0.2 U/μL）（北京艾德莱生物科技有限公司），ddH₂O 8.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，DNA 模板3 μL；扩增条件为94 ℃预变性2.5 min，随后进入38个循环：95 ℃变性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s；循环结束后72 ℃延伸4 min。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰的样品依托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

将自测序列与GenBank数据库中获得的相关序列联合建立矩阵，基于最大似然法，利用RAxML v.7.0.4 manual软件^［16］构建系统发育树，相关序列的选择和外类群的设置，参考范黎等^［6］的研究结果。

2 结果与分析

2. 1 形态学特征

子囊果直径1.3～3 cm，球形、椭球形或不规则块状，黑褐色，外部具不规则多角形瘤突，顶端尖或平，厚且硬，较难剖开。包被厚150~250 μm，包被细胞短柱状，直径5~15 μm，细胞呈深红褐色，向内颜色变浅。产孢组织黑褐色，有大理石花纹状脉络。子囊（70~95）μm×（60~90）μm，近球形，内含1~4个孢子（多为4个）。子囊孢子［（23.0）34.5~38.6（50.0）］μm×［（20.0）25.0~28.2（40.0）］μm，Q=（1.15）1.34~1.42（1.60），Q_m =1.38±0.11，椭球形，褐色至黑褐色，具刺突，刺长可达8 μm（图1）。

2.2 分子系统学研究结果

自测的ITS序列已上传至GenBank数据库，标本及其对应序列的登录号见表1。

基于ITS用最大似然法构建的系统发育树（图2）显示，所研究标本的序列与台湾块菌的相关序列聚为一支，靴带值为100%，应属同一物种。

3 讨论

在系统发育树的台湾块菌分支上，有些序列如FJ748907，被定为印度块菌（Tuber indicum Cooke & Massee.），应该是标本的错误鉴定所致，类似这样被错定为印度块菌的序列，在GenBank中还有很多，在使用时需要进行甄别。

该支系上还有部分序列，如AB553388、AB553 393等，被定为喜马拉雅块菌（Tuber himalayense B C Zhang & Minter.），这是由于目前学界对台湾块菌和喜马拉雅块菌的关系仍然存在争议，有学者认为台湾块菌是喜马拉雅块菌的异名^［17-18］。虽然喜马拉雅块菌发表更早，但迄今为止尚未见有来自于其模式标本或模式产地标本的序列，本文采信范黎等^{［2，19-20］}的观点，为该物种为台湾块菌^［13-14］。

块菌之所以成为世界上著名的顶级食材，除了味道独特、营养丰富外，还因稀少难觅。西方国家对于块菌采集有严格的限制，且通常用经过训练的母猪或者松露犬来协助寻找，而我国的块菌采集目前主要是盲目地大范围挖掘来寻找，对森林生态环境会造成很大程度的破坏^［21］。野生块菌资源被发现后，要避免被掠夺式采挖，应该积极普及相关科学知识，建议在合适的时间和地点采集，使野生资源实现可持续利用。

目前，台湾块菌在我国已知的分布地有台湾、四川、云南、江苏、河北和内蒙古宁城，甘肃陇南是该物种新发现的分布区。块菌属部分物种在欧洲等地已可进行半人工栽培，我国学者通过10余年的研究，利用菌根合成技术，已合成了台湾块菌、印度块菌、中华夏块菌（Tuber sinoaestivum J.O.Zhang & P.G.）、欧洲夏块菌（Tuber aestivum Vittad.）、攀枝花白块菌（Tuber panzhihuanese X.J.Deng & Y.Wang）以及法国黑孢块菌（Tuber melanosporum Vittad.）的菌根树苗，并成功收获了子囊果，为块菌资源的可持续利用提供了技术支持^［22-23］。此次台湾块菌标本在甘肃陇南的获得，证实该区域的环境和气候条件适合该物种的生长，为甘肃省保护和进一步开展这一珍稀食用菌的人工仿生栽培工作提供了科学依据。

4 结论

本研究所构建的系统发育树显示，采自陇南的块菌标本与台湾块菌的相关序列以高支持率聚为一支，宏观和显微形态特征也与台湾块菌的相关描述相吻合，因此台湾块菌，是该物种在甘肃省的首次发现。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31770588)