瘦素对牦牛MEC中SOCS2 mRNA及蛋白水平的表达影响

Effect of leptin on SOCS2 mRNA and protein expression in MEC of yak

摘要

目的 了解瘦素对牦牛乳腺上皮细胞（mammary epithelial cells，MEC）中SOCS2表达的作用特点及催乳素对瘦素功能发挥可能产生的影响。 方法 选取无催乳素及有催乳素（500 ng/mL）刺激时，不同质量浓度瘦素（0、50、100、200、400、800 ng/mL）作用牦牛MEC 48 h，采用RT-qPCR及Western blot技术检测SOCS2在mRNA及蛋白水平的相对表达情况。 结果 无论有无催乳素诱导，SOCS2 mRNA的相对表达水平均随瘦素质量浓度的增大而呈现出先升高后降低的趋势，均在瘦素质量浓度为100 ng/mL时表现出最高的相对表达水平（P<0.05），且催乳素可显著提高其表达水平（P<0.05）；而SOCS2蛋白在无催乳素时，除800 ng/mL瘦素显著抑制了其表达水平外（P<0.05），其他质量浓度瘦素下的SOCS2蛋白表达水平均无显著性变化（P>0.05）；有催乳素时，其蛋白表达水平则随瘦素质量浓度的增大而先升高后降低，200 ng/mL瘦素时表达量最高（P<0.05）。 结论 瘦素在有无催乳素参与下，对SOCS2 mRNA和蛋白水平表达情况的影响不同，表现为SOCS2在催乳素和瘦素功能发挥时参与影响了不同水平的信号通路机制及不同水平上功能性发挥的差异；并且发现瘦素质量浓度为100 ng/mL时对SOCS2 mRNA的表达量有显著促进作用；200 ng/mL瘦素对SOCS2蛋白表达量提升明显，但高质量浓度瘦素会抑制SOCS2蛋白表达。

Abstract

Objective The study aimed to clarify the characteristics of leptin affecting SOCS2 expression in yak mammary epithelial cells and the possible effect of prolactin on leptin function. Method Yak mammatocyte epithelial cells were treated with the different concentrations of leptin (i.e., 0, 50, 100, 200,400,800 ng/mL) under the condition of without or with prolactin (500 ng/mL) for 48 h, and then the relative expression of SOCS2 in both mRNA and protein levels were detected by using RT-qPCR and Western blot. Result The results showed that the relative expression level of SOCS2 mRNA increased firstly and then decreased with increased leptin concentration, and prolactin could significantly increase its expression level (P<0.05) and the relative expression level was the highest when leptin concentration was at 100 ng/mL (P<0.05).For treatments without the prolactin, the 800 ng/mL leptin significantly inhibited SOCS2 protein expression(P<0.05), while no significant change in SOCS2 protein expression was detected at the other leptin concentrations (P>0.05). For the treatments of adding prolactin, the expression of SOCS2 protein increased firstly and then decreased with increased leptin concentration, and the expression level was the highest at 200 ng/mL leptin (P<0.05). Conclusion The effect of leptin on the expression of SOCS2 mRNA and protein levels was affected by prolactin adding, implying that SOCS2 affects different levels of signaling pathway mechanisms and functional differences at different levels when prolactin and leptin were exerted. The results suggested that the leptin concentration of 100 ng/mL significantly promoted the expression of SOCS2 mRNA, and 200 ng/mL leptin significantly increased the expression of SOCS2 protein, whereas high concentrations of leptin inhibited the expression of SOCS2 protein.

Graphical abstract

关键词

牦牛乳腺上皮细胞 / 瘦素 / SOCS2 / mRNA / 蛋白水平

Key words

yak mammary epithelial cells / leptin / SOCS2 / mRNA / protein level

牦牛（Bos grunniens）生活在青藏高原海拔3 000 m以上的地区，可适应低温、低氧、低压的高原环境，有着多种经济用途，是牧区人民重要的经济来源^［1］。牦牛乳作为一种高原特有的天然绿色资源，逐渐凭其丰富的功能性和生物活性成分进入了寻求高质量标准乳制品的消费者的视野^［2］，同时它也是婴幼儿奶粉^［3］、奶酪^［4］、酸奶及奶油^［5］等制品的优势原料乳。但由于放牧环境、饲养方式和品种特性等原因^［6-8］，牦牛乳产量相对较低^［9-10］，不仅极大限制了牦牛乳及其制品在市场上的经济地位，也在一定程度上造成了优质资源的浪费，因此深入探究影响牦牛乳腺泌乳的因子及其可能存在的相关机制在技术水平上提高牦牛乳产量具有重要意义。

泌乳期乳腺组织内腺泡的数目及组织结构尤其影响泌乳量，而泌乳的发动、维持及乳汁的合成及分泌主要受激素水平的影响。其中瘦素（leptin，LEP）为16 kU非糖基化多肽类激素，大部分由机体内脂肪组织产生并分泌，是食物摄入、造血、炎症、免疫、细胞增殖和分化的多向调节分子，也是乳腺发育、泌乳和退化的局部调节因子^［11］，可通过激活Janus激酶/信号转导子和转录激活子（JAK-STATs）和JAK- MAPK/ERK信号转导途径促进乳腺的腺泡成熟、导管发育与乳蛋白基因的表达等，而STATs则可诱导SOCSs的基因转录，从而在负反馈回路中严格调控自身的激活途径^［12］。

而信号因子转导抑制因子2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）是SOCS家族成员，其作为细胞因子和激素诱导的细胞内蛋白具有复杂的生物学功能，SOCS2缺乏可改变能量代谢、影响脂肪组织重塑、减少瘦素释放等^［13］。在整个乳腺个体发育过程中，SOCS2在妊娠及泌乳期牦牛乳腺上皮细胞（mammary epithelial cells，MEC）中可强烈表达，纯合子零突变的SOCS2可挽救PRLR杂合小鼠泌乳失败和乳腺STAT5磷酸化的减少，这一发现强调了SOCS2在生长调节之外的作用^［14］。

催乳素（prolactin，PRL）是高水平牛奶蛋白表达所必需的，已有研究表明PRL和LEP均可诱导STAT5的激活^［15-17］，而且目前鉴定出的18个催乳素应答基因中也包括SOCS2^［18］，而SOCS2又是已知的STAT5招募调节因子，是JAK/STAT途径的负反馈调节器^［19］，但瘦素与SOCS2之间的直接作用关系报道较少。因此，本试验以牦牛乳腺上皮细胞为载体，在有无催乳素的前提下，通过RT-qPCR及Western blot技术研究SOCS2在不同质量浓度瘦素作用下的相对表达情况及特点，以期为探究瘦素与SOCS2之间可能存在的相关作用机制提供一定的参考资料，也为实际生产中提高牦牛乳产量提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞来源

本实验室经胰酶/Ⅰ型胶原酶组合分段消化法分离纯化后的第5代牦牛MEC。

1.1.2 主要试剂

胰岛素-转铁蛋白-硒（Invitrogen，美国）、氢化可的松（Sigma，美国）、表皮生长因子（Sigma，美国）、催乳素（Sigma，美国）；总RNA提取试剂盒（离心柱型）（TIANGEN，北京）、Super Real荧光定量预混试剂-增强版试剂盒（TIANGEN，北京）；全蛋白提取试剂盒（凯基，江苏）、SOCS2兔抗多克隆抗体（Bioss，北京）、HRP-羊抗兔IgG（Bioss，北京）、β-actin鼠抗单克隆抗体（Bioss，北京）、HRP-羊抗鼠IgG（Bioss，北京）。

1.1.3 主要仪器

CO₂培养箱（Thermo Fisher，311）；PCR仪（Eppendorf，6331）、核酸蛋白浓度测定仪（Implen，NP480）、水平核酸电泳系统（北京凯元，CAVOY）、荧光定量PCR仪（Roche，LightCyler 480 II）；酶标仪（Thermo Fisher，Varioskan LUX）、电泳仪（北京凯元，PowerPac）、化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad，Fluorchem R 0211）。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制

参考文献^［20］，将本试验所使用PRL质量浓度统一设定为500 ng/mL。

传代培养液：DMEM/F12基础培养液、2%双抗、15%FBS、1 μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒、200 ng/mL氢化可的松、10 ng/mL表皮生长因子。

LEP/PRL（-）培养液：LEP（0、50、100、200、400、800 ng/mL）、传代培养液。

LEP/PRL（+）培养液：LEP（0、50、100、200、400、800 ng/mL）、传代培养液、PRL。

1.2.2 样品处理及试验设计

将第4代处于对数生长期的牦牛MEC消化并收集离心，统一细胞浓度后等量接种于细胞培养瓶中并作好标记，待细胞密度达到80%左右时，弃去培养液，PBS润洗2~3遍，于各个培养瓶中加入对应处理组的培养液，每个瘦素处理质量浓度均设置3个重复，并以0 ng/mL处理组作为对照，于培养箱内培养48 h后一部分细胞进行总RNA的提取并进行实时荧光定量PCR以检测mRNA的表达；一部分细胞提取总蛋白并进行Western blot试验以检测蛋白的表达。

1.2.3 总RNA提取及cDNA合成

根据总RNA提取试剂盒操作说明提取细胞总RNA，利用蛋白核酸测定仪测定RNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后按一步法反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成，产物置于-20 ℃保存备用。

1.2.4 实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

根据NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）公布的牦牛SOCS2（XM_005889065）及内参β-actin（XM_005887322.2）的基因序列，利用Primer Premier 5.0设计引物，并应用NCBI 的 BLAST功能对序列进行同源性分析以保证引物专一性，引物序列见表1，送由华大基因合成。SOCS2和β-actin基因在61 ℃退火温度下进行普通 PCR 扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，发现其扩增产物条带单一，产物大小与预期相符后，以反转录获得的cDNA为模板，β-actin为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测SOCS2在mRNA水平上的相对表达量，反应体系为20 μL，其中10 μL2×SuperRealPreMixPlux，各0.6 μL上、下游引物，1 μLcDNA，7.8 μLddH₂O；反应条件为：94 ℃ ，5 s预变性；（95 ℃，5 s；61 ℃，30 s；72 ℃，30 s）×40；95 ℃，5 s；70 ℃，1 min。各处理组样品均做3次组内重复。反应结束后观察溶解曲线，采用2^-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达量。

1.2.5 蛋白质免疫印迹（Western blot）试验

根据全蛋白提取试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒操作说明进行细胞全蛋白的提取及浓度的测定，统一蛋白浓度后，以细胞全蛋白∶4×蛋白上样缓冲液=3∶1制备预混液，100 ℃ 5 min，4 ℃条件下进行蛋白变性；内参β-actin和SOCS2的分子量分别为42 kU和23 kU，所以选择制备12%的分离胶及5%的浓缩胶（内参与目的蛋白均在同一张胶上）；电泳条件为：浓缩胶恒压80 V 30 min；分离胶恒压120 V 80 min，转膜前PVDF膜于甲醇内浸泡激活3 min，后放置于转膜液中平衡10 min以上，在200 mA 120 min条件下进行转膜，后1×TBST洗膜15 min，换液2次；PVDF膜放入1×TBST配制的5%脱脂乳中，37 ℃摇床内80 r/min，封闭2 h后直接放入一抗（均1∶1 000稀释）内4 ℃孵育过夜；1×TBST洗膜90 min，换液6~9次，后于25 ℃摇床内90 r/min，孵育二抗（均1∶5 000稀释）120 min，1×TBST洗膜90 min，换液6~9次，ECL试剂曝光，利用化学发光凝胶成像系统拍照记录；AIC.AlphaView软件检测目的蛋白及β-actin蛋白条带的灰度值。

1.3 数据处理

以β-actin为内参，0 ng/mL瘦素处理组为对照，利用Excel 2010、IBM SPSS Statistics23和Origin 8.0进行SOCS2基因与蛋白的相对表达水平的单因素方差分析及结果图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度瘦素下牦牛MEC SOCS2 mRNA水平表达

经检测，不同质量浓度瘦素作用下的细胞总RNA纯度均较高，A260/A280为1.9~2.1，电泳结果清晰可见3条带，且28S约为18S亮度的2倍（图 1），说明所提取的RNA可用于后续操作；溶解曲线（图2）显示：SOCS2和β-actin的T_m值均一且无杂峰，说明引物特异性良好，所收集的荧光强度均来自特异性的扩增产物。

RT-qPCR结果分析发现，无论有无催乳素刺激，不同质量浓度瘦素作用下的SOCS2 mRNA表达水平均明显不同，总体都表现为先升高后降低的趋势，且均在瘦素质量浓度为100 ng/mL时表现出最高的表达水平（P<0.05）（图3）；在100 ng/mL瘦素处理下，有无催乳素的刺激对SOCS2 mRNA的相对表达水平影响较大，而且在其他质量浓度瘦素作用下其表达量也有明显升高，但添加PRL之后其表达量较未添加PRL时更高，表明催乳素可以协同瘦素显著促进SOCS2在mRNA水平的表达（P<0.05）（图4）。

2.2 不同质量浓度瘦素下牦牛MEC SOCS2 蛋白水平的表达

Western⁃blot结果显示，无催乳素刺激时，除了800 ng/mL的瘦素显著抑制了牦牛MEC中SOCS2的蛋白表达之外，其他质量浓度作用瘦素对其均无显著性影响（P>0.05）（图5⁃A、5⁃B）；而当有催乳素存在时，牦牛乳腺上皮细胞中SOCS2蛋白相对表达量则均有升高并随瘦素质量浓度的增大而呈现出先升高后降低的趋势，于瘦素质量浓度为200 ng/mL时达到最高水平（图5⁃A、5-C）。表明催乳素在瘦素影响SOCS2蛋白表达水平上具有重要的作用。

3 讨论

瘦素被认为是一种生长因子^［21］，在乳腺肌上皮细胞和分泌上皮细胞中均可见瘦素的阳性表达，其中，乳腺分泌上皮细胞不仅可合成瘦素，还可能从血液中转移瘦素^［22］，且添加瘦素刺激时，可促进细胞的自我更新，在与催乳素协同作用时，可提高奶牛MEC酪蛋白的分泌并促进其增殖^［23-24］，表明瘦素在乳腺泌乳功能中的重要作用。乳腺发育及乳蛋白基因的转录和翻译都必须依赖相关信号通路的激活，Janus激酶（JAKs）与信号转导和转录激活因子（STATs）已被证明在乳腺发育和分泌功能中所需的几种肽激素和细胞因子的下游发挥作用^［25］，即其主要细胞程序都依赖于一个或多个JAK/STAT信号级联。作为负反馈调节因子，SOCSs通过结合细胞因子受体或JAK来抑制STAT酪氨酸磷酸化，从而抑制细胞因子信号通过JAK/STAT信号通路的传导，从而在负反馈回路中严格调控自身的激活途径^［12］。

Highchi 等^［26］认为，瘦素可诱导小鼠下丘脑内SOCS2 mRNA水平的表达；Zhang 等^［27］研究表明，体外注射瘦素可提高小鼠脂肪组织内SOCS2 mRNA表达，本试验发现，在牦牛MEC培养体系内添加不同质量浓度的瘦素后，无论质量浓度高低或有无催乳素诱导，与空白组对照组相比，瘦素均可促进SOCS2 mRNA水平的表达，并且100 ng/mL的LEP质量浓度下SOCS2 mRNA表达量较其他质量浓度有明显提升，说明SOCS2也是瘦素下游的关键调节因子，在未受刺激的细胞中，SOCS mRNA维持在较低水平，一旦受到细胞因子刺激，SOCS表达量迅速上升从而发挥对该细胞因子信号通路的负反馈作用；SOCS2 mRNA的表达随着瘦素质量浓度的升高而总体表现为先升高后降低的趋势则可能是由于高质量浓度瘦素对细胞具有一定的功能性抑制作用^［23］。另我们发现在添加PRL后牦牛MEC中SOCS2 mRNA的表达量较未添加PRL时有显著提升，这可能是由于PRL主要介导激活JAK2-STATs信号转导通路，当PRL与PRLR结合时，JAK2自激活，并在位置保守的酪氨酸残基上磷酸化STAT5a和STAT5b^［28］，协同瘦素加强JAK/STAT信号，进而促进了负反馈调节因子SOCS2的表达。

而SOCS2蛋白水平的表达主要受PRL的影响。本研究发现，在无催乳素刺激时，除800 ng/mL瘦素下SOCS2蛋白表达被显著抑制外，其他质量浓度瘦素下的表达水平均无明显变化，可能是因为高质量浓度时，SOCS2负反馈作用增强，利用SH2结构域与JAK2结合，抑制STAT磷酸化，阻止JAK2与底物结合，从而抑制SOCS2通过JAK/STAT信号通路的传导，进而使其表达降低；但当有催乳素刺激时，不同质量浓度瘦素下的SOCS2蛋白水平存在显著性差异，表达量均比对照组高，总体表现出先升高后降低的趋势，且其与SOCS2在mRNA水平的表达趋势上存在一致性，说明催乳素对SOCS2蛋白与mRNA水平上的表达及其功能的发挥具有重要意义。综上，在反应体系中共同添加LEP与PRL较只添加LEP时SOCS2 mRNA及蛋白水平的表达显著升高，说明PRL可以协同LEP共同促进SOCS2的表达。李胜^［29］研究发现，在水牛乳腺上皮细胞中，SOCS2是STAT5a和STAT5b的下游靶基因之一，催乳素可诱导SOCS2的表达显著上调，进而调控乳腺细胞增殖及泌乳，该结果与本研究结果一致。由此推测，在瘦素或瘦素与催乳素协同刺激下，SOCS2基因在牦牛乳腺上皮细胞中有其自身的转录表达模式，经翻译后其作用方式发生一定程度上的变化，进而在细胞中发挥其功能。

4 结论

1） 没有PRL刺激时，100 ng/mL LEP对SOCS2 mRNA有显著促进作用；800 ng/mL LEP对SOCS2蛋白表达有明显的抑制作用。

2） 有PRL刺激时，100 ng/mL LEP对SOCS2 mRNA促进作用较其他质量浓度显著，且其较未添加PRL时显著升高；而SOCS2蛋白水平的表达量在200 ng/mL LEP作用下达到最高水平。

3） 在有无催乳素参与的情况下，瘦素对SOCS2 mRNA和蛋白水平表达情况的影响不同，可能说明SOCS2在催乳素和瘦素发挥各自的功能时，参与并影响了不同的信号途径，功能性的发挥在mRNA及蛋白水平上可能存在不同。

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基金资助

青海省科学技术厅应用基础研究项目(2019-ZJ-7025)