性成熟前家兔血清生殖激素变化及相关受体基因在睾丸中的表达

Changes of serum reproductive hormones and expression of related receptor genes in testis of rabbits before sexual maturity

摘要

目的 探究不同日龄家兔血清生殖激素及相关激素受体基因在家兔生长发育过程中对精子生成及对睾丸功能的调节作用，为家兔初情期内分泌等生殖生理研究提供理论依据。 方法 采用酶联免疫法和荧光定量PCR法，分别对家兔血清生殖激素FSH、LH和T的含量及其受体基因FSHR、LHR和AR的表达状况进行研究分析。 结果 随家兔日龄的增加，血清中FSH含量在45日龄达到最高，且30、45、105日龄组均极显著高于其他各组（P<0.01）；LH和T含量在150日龄均达到最高，且LH含量在30、120、150日龄组均极显著高于45、60日龄组（P<0.01）；T含量在135、150日龄组均显著或极显著高于其他各日龄组（P<0.05或P<0.01）。此外，60日龄组FSHR相对表达量显著高于120、150日龄组（P<0.05），30、60、150日龄组LHR相对表达量均显著高于90日龄组（P<0.05），而AR相对表达量随日龄的增加呈递减趋势（P>0.05）。 结论 公兔初情期启动时，需要较高浓度的LH及高浓度T的作用，但FSH处在较低的水平；公兔性成熟前血清中FSH、LH浓度变化与相应受体表达趋势一致，但AR呈弱表达。

Abstract

Objective In order to provide theoretical basis for the reproductive physiology research such as endocrine mechanism of the initiation of early estrus in rabbits,the effect of serum reproductive hormones and related hormone receptor genes on spermatogenesis and the regulation of testicular function during the growth and development of rabbits at different ages were investigated. Method The content of serum reproductive hormones and the expression of their receptor genes in rabbits were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and fluorescence quantitative PCR. Result With the increase of rabbit age, the serum FSH content reached the highest at the age of 45 days, and the serum FSH content of the groups at the ages of 30, 45 and 105 days was significantly higher than that in other groups (P<0.01). The contents of LH and T were the highest at 150 days of age, and those in 30,120 and 150 days age groups were significantly higher than those in 45 and 60 days age groups (P<0.01).T contents in 135- and 150 days age groups were significantly higher than that in other groups (P<0.05 or P<0.01).In addition, the relative expression level of FSHR in 60 days age group was significantly higher than that in 120 and 150 days age group (P<0.05),the relative expression level of LHR in 30,60 and 150 days age group was significantly higher than that in 90 days age group (P<0.05), and the relative expression level of AR decreased with the increase of age (P>0.05). Conclusion The high concentration of LH and T but lower FSH were required for the initial estrus of female rabbit.Furthermore, the changes of serum FSH and LH concentrations in male rabbits before sexual maturity were consistent with the expression trend of the corresponding receptors, while AR was weakly expressed.

Graphical abstract

关键词

生殖激素 / 睾丸 / 激素受体基因 / 家兔 / 性成熟

Key words

reproductive hormone / testis / hormone receptor gene / rabbit / sexual maturity

睾丸是动物精子发生的场所，也是雄激素合成及分泌的器官。在生殖活动中睾丸依赖促性腺激素及其受体来实现雄激素的合成，从而促进精子的发生及维持雄性生殖机能的正常运转。有研究证明，生殖激素分泌后需要与相应的受体结合才能够发挥生物学效应，以调节公畜生殖系统的分化和成熟^［1］。有研究显示，睾丸内的黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）的特异性受体能够将激素信息传达至细胞内，从而促进细胞活动，如分泌性激素^［2］。促卵泡素受体（follicle stimu-lating hormone receptor，FSHR）位于睾丸的支持细胞内，受FSH刺激促进睾丸支持细胞合成和分泌雄激素，并刺激生精上皮的发育和精子发生。在次级精母细胞及其以前的阶段，FSH起重要作用，此后则由睾酮起主要作用。促黄体素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）位于睾丸内的间质细胞^［3-4］，当LH与其受体结合后，会激活腺苷酸环化酶，从而促进合成雄激素睾酮，以调节类固醇激素的分泌、精子生成过程以及睾丸的发育^［5-6］。另有研究认为，由间质细胞产生的睾酮（testosterone，T）并不直接作用于生殖细胞，而是与相应的雄激素受体（androgen receptor，AR）结合，对生殖细胞施加影响以发挥作用，从而促进生殖系统的发育，调节精子的生成^［7］。

伊拉兔又称伊拉配套系肉兔，是法国欧洲兔业公司培育成的杂交品种，具有适应性强、繁殖力高等特点，公兔在120日龄左右出现爬跨行为，达到初情期，150~160日龄达到性成熟，但体成熟较性成熟晚，一般在性成熟后1~2个月^［8-9］。家兔为常用的试验动物，在免疫学、传染病学及遗传育种与繁殖学等领域中被广泛应用。因此，本试验以家兔为试验对象，采用酶联免疫法（ELISA）和荧光定量PCR法（qPCR）研究性成熟前不同日龄家兔血清中FSH、LH和T的含量以及FSHR、LHR和AR在睾丸组织中的表达量，分析FSH、LH和T在家兔不同发育阶段血清中的变化规律，以及相关激素受体基因在睾丸中的表达特征，以进一步了解它们在精子发生过程中的作用和对睾丸功能的调节，从而揭示性成熟前家兔睾丸生长发育的内分泌调节规律。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

从甘肃某养殖公司购买30日龄伊拉公兔45只，按照相同的饲养标准饲养于甘肃农业大学动物实训基地，按照日龄研究间隔（30、45、60、75、90、105、120、135、150日龄）分为9组，每组5只，每隔15 d进行样品采集。每次屠宰前，于上午9∶00~10∶00空腹耳缘静脉采血2~3 mL，分离血清于-20 ℃保存；同时于动物屠宰后采集睾丸，置于冻存管中，迅速投入液氮中后转至-80 ℃冰箱备用。

1.2 主要试剂

ELISA试剂盒（上海酶联）、总RNA提取试剂盒、RNase-free ddH₂O和SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ均购自Servicebio公司（武汉），Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 第一链合成试剂盒购自Thermo公司（美国）。

1.3 试验方法

1.3.1 酶联免疫法

用ELISA试剂盒测定家兔血清中生殖激素FSH、LH和T的含量，具体方法参照试剂盒说明书。

1.3.2 qPCR检测

使用总RNA提取试剂盒提取家兔睾丸的总RNA，用Nanodrop 2000检测 RNA浓度及纯度，选择完整性好的RNA将其浓度稀释为500 ng/μL，并参照两步法反转录合成第一链cDNA后置于-20 ℃冰箱备用。

1.3.3 基因相对表达量检测

根据 GenBank 公布的兔（rabbit）FSHR、LHR 和AR基因序列，在NCBI Primer-Blast上设计引物，并选用β-肌动蛋白基因（β-actin）为内参基因，所用引物均送Servicebio（武汉）公司合成，设计的具体引物序列信息见表1。反应体系为20 μL，其中2×qPCR Mix10.0 μL，基因引物 0.8 μL，反转录产物（cDNA）1.0 μL，ddH₂O 8.2 μL。反应条件为：预变性（95 ℃，2 min），变性（95 ℃，15 s），退火（60 ℃，15 s），延伸（65 ℃，15s），循环（40次），65~95 ℃制备熔解曲线，每个样品采用3个生物学重复。

1.4 数据处理

1.4.1 血清生殖激素含量计算

用标准物的浓度与OD值，计算标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算样品浓度。

1.4.2 基因相对表达量计算

根据每个样品的荧光定量Ct值，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。最后对获取的相关数据用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，通过软件Grandpad primer 8.0作图。结果用平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著，P<0.01表示差异极显著，而P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同日龄家兔血清中生殖激素的含量

由图1-A可知，随家兔日龄的增加，在30~45日龄阶段血清中FSH含量升高，45日龄血清中FSH含量最高，为（7.73±0.11） mIU/mL，而45~150日龄阶段逐步下降，在150日龄达到最低，为（6.34±0.03） mIU/mL。由表2可知，30、45、105日龄组血清中FSH含量极显著高于其他各组（P<0.01），且3组间差异不显著（P>0.05），其他各日龄组之间血清中FSH含量差异也不显著（P>0.05）。

由图1-B可知，在30~60日龄阶段血清中LH含量不断下降，60日龄LH含量最低，为（31.02±0.98） mIU/mL，60~105、120~150日龄阶段，随日龄增加LH含量不断增加，在150日龄达到峰值（41.14±2.98） mIU/mL。由表2可知，105、150日龄组LH含量均极显著高于45、60日龄组（P<0.01），150日龄组LH含量显著高于30、75、120日龄组（P<0.05），90、105、135日龄组LH含量均显著高于45、60日龄组（P<0.05），其他各组之间差异不显著（P>0.05）。

由图1-C可知，血清中T含量随日龄增加不断升高，60~105日龄阶段血清中T含量增长趋于平稳，30~60、105~150日龄阶段血清中T含量增长最快。由表2可知，135、150日龄组血清中T含量均极显著高于30、45日龄组（P<0.01），显著高于60、75、90、105、120日龄组（P<0.05），150日龄组血清中T含量最高，为（249.42±4.75）pg/mL。

2.2 不同日龄家兔睾丸组织中FSHR、LHR和AR mRNA的表达量

根据qPCR研究结果（图2），发现随着日龄的增加，60日龄组FSHR相对表达量显著高于120、150日龄组（P<0.05），其他各组之间差异不显著（P>0.05）；30、60、150日龄组LHR相对表达量显著高于90日龄组（P<0.05），其他各组之间差异不显著（P>0.05）；AR相对表达量随日龄的增加呈递减趋势，各组之间差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 不同日龄家兔血清中生殖激素的变化规律

脑垂体分泌的促性腺激素FSH和LH以及睾丸间质细胞分泌的T，通过不同的效应途径对精子的发生和成熟产生影响，同时各激素指标之间又存在相互促进或抑制的关联^［10-11］。小鼠刚出生时血液中FSH的含量很低，之后随着年龄的增长而缓慢上升，初情前期腺垂体中FSH的浓度较高，但血液中FSH的浓度较低，到初情开始后，垂体大量分泌并释放FSH，使血液中FSH的浓度大幅度升高^［12］。本研究显示，随日龄的增加，家兔血清中FSH含量在45日龄达到最高峰值，这可能是家兔自身垂体性腺轴的进一步发育完善，垂体对FSH分泌量增加使血清中FSH含量不断上升，之后开始缓慢下降。有研究表明，随日龄的增长，睾丸不断发育，睾丸支持细胞在初情期前不断增殖，而在初情期之后达到相对稳定，FSH与睾丸支持细胞上FSH受体结合，刺激睾丸支持细胞分泌抑制素B，使抑制素B含量不断上升，负反馈抑制FSH分泌，导致FSH含量不断下降^［13］；有研究发现，睾丸支持细胞分泌的抑制素B对FSH抑制作用最强，是FSH分泌的主要反馈调节物，而T也有较轻微的抑制FSH作用^［14］。性发育接近成熟时FSH有所下降可能是由于睾丸发育成熟，产生T含量增加，从而对下丘脑反馈性抑制增强的结果^［15］。本试验显示，在接近性成熟的150日龄组，家兔血清T的含量是最高的，而在150日龄时血清中FSH含量则是最低的，即说明高浓度的T间接作用导致了FSH含量的下降。

LH是由垂体前叶分泌的促性腺激素，在睾丸中LH的主要作用是促进间质细胞合成和分泌T，既可以维持血浆T水平，又可以维持外周循环约高100倍的睾丸内T浓度，睾丸内T以旁分泌方式作用于支持细胞和管周样细胞，是正常精子发生所必需的；以自分泌方式作用于间质细胞本身，维持间质细胞的数量和功能^［16］。随着日龄的增长，在30~60日龄阶段血清中LH含量不断下降，60日龄LH含量最低，而T的含量在该阶段则不断升高。有研究证明，T同其代谢产物共同行使负反馈作用，T升高可通过负反馈机制抑制LH分泌，降低LH峰的频率，同时改变LH峰的幅度^［17］。另有研究表明，当睾丸内T水平过高时，T反作用于下丘脑，促使GnRH释放，影响LH和FSH分泌；一方面，LH直接作用于间质细胞，减少T的生成；另一方面，FSH促使支持细胞释放雄激素结合蛋白，雄激素结合蛋白与T结合，减弱T的活性，从而达到控制局部T水平的作用^［18］。本研究发现，在60~120日龄阶段，血清中LH含量不断升高，T含量趋于平稳，LH与间质细胞中的受体LHR结合，减少T的分泌，所以在此阶段T含量保持平稳，LH不断升高。

3.2 不同日龄家兔睾丸组织中FSHR、LHR和AR mRNA的表达特征

在雄性生殖系统方面，FSH主要是促进生精上皮的发育，并在T的协调作用下促进精子的形成，而 FSH的生理功能是通过分布于性腺的特异性受体FSHR所介导的^［19］。随日龄的增长，FSHR在60日龄表达量最高，90日龄开始下降，在120日龄下降到最低。有研究表明，FSHR基因在公鸡睾丸中的表达量出雏时最高，4周龄缓慢下降，16周龄下降到最低，呈先高后低持续下降的趋势^［20］。有研究表明FSHR在梅山猪睾丸中的表达量也呈先升高后降低的趋势^［21］，与本试验结果相一致。Warren 等^［23］研究发现，发育至17.5日龄雄性大鼠胎儿睾丸中就可以检测到FSHR，但在19.5日龄之前FSHR处于很低的水平，直到20.5日龄后FSHR水平急剧上升。大鼠出生2日龄后，睾丸FSHR随日龄增加而增加，在出生后60日龄达到最高水平^［22］。有体内试验证明，FSH促进新生仔猪睾丸支持细胞的增殖，促使初情期前后睾丸支持细胞发生分化^［24-25］，当支持细胞分化形成后，FSHR主要在睾丸支持细胞表达，随日龄增长，曲细精管中有精子细胞生成，与支持细胞上结合，导致FSHR表达量下降^［26-27］。

睾丸组织激素受体表达变化直接影响睾丸组织的生理功能，进而引起生物体个体行为的变化。LH由垂体前叶分泌，是调控哺乳动物生殖的重要激素，其生理功能由其受体LHR介导^［29］。有研究证实，LHR与LH特异性结合，使腺苷酸环化酶活化，促进胆固醇进入线粒体内膜，影响睾酮的合成^［30］。睾酮是促进精子生成及成熟的一种雄激素，对引起动物的性欲和性行为有着重要的作用^［29］。本研究中，随日龄增加，LHR的表达量在150日龄达到最大。有研究表明，LHR表达量在性成熟期达到最大值，表明LHR在性成熟期对睾酮的合成有显著的作用，进而影响精子生成及成熟。已有研究表明，试验性或内源性LH水平升高，可使LHR下调和对激素信号的脱敏作用；相反，对未成熟的睾丸或胎儿睾丸用LH处理能使LHR上调且对脱敏作用无影响^［28］。幼年期到性成熟期牦牛睾丸LHR表达量呈上升趋势，并无产生脱敏作用，而性成熟期到成年期受到脱敏作用的影响，导致LHR有所下调^［31］；本试验中LHR相对表达量随LH含量升高不断增加，并无脱敏现象，在性成熟之前家兔上得到验证。

睾丸间质细胞是分泌雄激素的重要内分泌细胞，其分泌功能主要受LH调节。但LH并不是唯一的调节因素。许多学者运用多种方法证实睾丸间质细胞内具有AR表达^［32-33］。本研究显示，随日龄的增长，AR的表达量呈递减趋势，说明随日龄增加，LH刺激睾丸间质细胞分泌睾酮，使睾酮含量不断升高，反馈抑制AR的表达。有研究结果表明：在出生后1月龄大鼠进入初情期时睾丸间质细胞AR阳性表达最强，从出生后2月龄大鼠接近性成熟，睾酮分泌能力较强时，AR阳性表达明显减弱。此后AR阳性表达有增强趋势^［34-35］。Shan等^［34］利用免疫印迹及RAN印迹法对出生后21、35、90 d大鼠睾丸间质细胞内AR及其mRNA水平进行了研究。结果表明：出生后35 d睾丸间质细胞内AR蛋白及其mRNA表达最强，其次是出生后21 d，出生后90 d表达最弱。有研究结果还证实：大鼠在接近性成熟，T分泌能力较强时睾丸间质细胞内AR水平较低^［35］；本试验在家兔上的研究也验证了这一点。

4 结论

研究表明，在120日龄公兔初情期启动时，需要较高浓度的LH及高浓度T的作用，但由于反馈抑制，此时血清中FSH处在较低的水平。另外在90日龄后至性成熟前，公兔血清中FSH、LH浓度变化与相应受体表达趋势一致，但AR由于负反馈作用，在性成熟前呈弱表达。说明公兔的初情期、性成熟受到FSH、LH、T及其受体基因的协同调节。

参考文献

[1] 鹿碧波，周永蔚，谢秀祯.家禽睾丸主要生殖激素受体的研究进展［J］.家畜生态学报，2016，37（12）：6-12.

[2] Jin J M， Wang W X.Molecular regulation of hypothalamus- pituitary-gonads axis in males［J］.Gene，2014，551（1）：15-25.

[3] Menon K， Menon B.Structure，function and regulatio n of gonadotropin receptors-A perspective［J］.Molecular & Cellular Endocrinology，2012，356（1/2）：88-97.

[4] 李亚超，马云云，陶金忠，等.LHR在不同繁殖期牦牛睾丸组织的表达比较［J］.甘肃农业大学学报，2019，54（3）：9-14.

[5] 朱士恩.家畜繁殖学［M］.北京：中国农业出版社，2009：39-42.

[6] Millar R P.GnRHs and GnRH receptors［J］.Animal Reproduction Science，2005，88（1/2）：5-28.

[7] 袁丽芳，安 娜，王善林，等.睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用［J］.生命科学研究，2015，19（1）：6-12．

[8] 赵全树.如何提高伊拉兔的繁殖力［J］.中国草食动物，2007（1）：64-65.

[9] 薛玉霞.家兔的科学繁殖［J］.当代畜禽养殖业，2011（2）：2.

[10] Paradisi R， Natali F， Fabbri R，et al.Evidence for a stimulatory role of high doses of recombinant human follicle-stimulating hormone in the treatment of male-factor infertility［J］.Andrologia，2014，46 （9）：1067-1072.

[11] Trabado S， Lamothe S， Maione L，et al.Congenital hypogonadotropic hypogonadism and Kallmann syndrome as models for studying hormonal regulation of human testicular endocrine functions［J］.Ann Endocrinol，2014，75（2）：79-87.

[12] 任春明，字向东，张重庆，等.卵泡刺激素（FSH）的研究进展［J］.畜禽业，2006（20）：10-13.

[13] 董志英，孙辉臣.血清抑制素B与睾丸生精功能关系的研究进展［J］.华北国防医学，2004，16（6）：403- 406.

[14] 母义明.性激素对下丘脑-垂体的反馈调节作用［J］.国外医学：内分泌学分册，1991（1）：15-17.

[15] 关明杰，徐能义.血清T，FSH对男性青春期生长发育和性发育的影响［J］.中国学校卫生，1995，16（3）：162-164.

[16] 李江源.精子发生的内分泌激素调节［J］.生殖医学杂志，2014，23（9）：697-702.

[17] Bridges N A， Hindmarsh P C， Pringle P J，et al.The relationship between endogenous testosterone and gonadotrophin secretion［J］.Clinical Endocrinology，2010，38（4）：373-378.

[18] 张阳海，李永，曹迪，等.睾酮对动物生殖和生长发育影响的研究进展［J］.家畜生态学报，2018，39（1）：7.

[19] Warren D W， Huhtaniemi I T， Juha T，et al.Ontogeny of gonadotropin receptors in the fetal and neonatal rat testis.［J］.Endocrinology，1984（2）：470-476.

[20] 陈兰，王亚男，张涛，等.京海黄鸡FSHR基因组织表达谱及表达规律的研究［J］.扬州大学学报（农业与生命科学版），2019，40（3）：5.

[21] 产舒恒，陈子璇，张戌园，等.FSH和LH及其受体基因在梅山猪公猪HPT轴的表达［J］.江苏农业科学，2018，46（1）：23-26.

[22] Williams K， Saunders P， Atanassova N，et al.Induction of progesterone receptor immunoexpression in stromal tissue throughout the male reproductive tract after neonatal oestrogen treatment of rats［J］.Molecular & Cellular Endocrinology，2000，164（1-2）：117-131.

[23] J.-M K， Hetzel W D， Sherins R J，et al.Developmental changes in testicular gonadotropin receptors： plasma gonadotropins and plasma testosterone in the rat［J］.Endocrinology，1978（1）：212-222.

[24] Mccoard S A， Lunstra D D， Wish T H，et al.Specific staining of sertoli cell nuclei and evalution of sertoli cell number and proliferative activity in Meis-han and white Composite boars during the neonatal period［J］.Biology of Reproduction，2001，64（2）： 689-695.

[25] Heather J， Baker P J， Margaret A，et al.Regulation of Sertoli cell number and activity by follicle-stimulating hormone and androgen during postnatal development in the mouse［J］.Endocrinology，2004（1）：318-329.

[26] Godmann M， Kosan C， Behr R.Kruppel-like factor 4 is widely expressed in the mouse male and female reproductive tract and responds as an immediate early gene to activation of the protein kinase A in TM4 Sertoli cells［J］.Reproduction，2010，139（4）：771-782.

[27] Crépieux P， Marion S， Martinat N，et al.The ERK-dependent signalling is stage-specifically modulated by FSH，during primary Sertoli cell maturation［J］.Oncogene，2001，20（34）：4696-4709.

[28] 牛淑玲，丰培金，周虚.促黄体素受体研究进展［J］.动物医学进展，2003，24（5）：4.

[29] 邵康，周杰，吴小雪，等.2011.猪睾丸中脂联素受体与LHR、CYP 11A1、StAR基因表达的发育变化及其相关性研究［J］.畜牧兽医学报，42（12）：1680-1685.

[30] Stocco D.Recent advances in the role of StAR［J］.Reviews of Reproduction，1998，3（2）：82.

[31] 马富龙，褚敏，常永芳，等.LHR，PRLR基因在不同发育阶段牦牛睾丸中的表达与定位［J］.农业生物技术学报，2020，28（4）：9.

[32] Namiki M， Yokokawa K， Okuyama A，et al.Evidence for the presence of androgen receptors in human Leydig cells［J］.Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology，1991，38（1）：79-82.

[33] Koh E.Biochemical，molecular biological and immunohistochemical studies on androgen receptors in human Leydig cells［J］.Nippon Hinyōkika Gakkai zasshi.The Japanese Journal of Urology，1990，81（11）：1618-1625.

[34] Shan L X.Quantitative analysis of androgen receptor messenger ribonucleic acid in developing Leydig cells and Sertoli cells by in situ hybridization［J］.Endocrinology，1995，136（9）：3856-3862.

[35] 王晓云，张健，李健，等.大鼠睾丸雄激素受体表达的增龄变化［J］.动物学报，2003（4）：481-487.

基金资助

甘肃农业大学特色学科开放基金项目(GAU-XKJS-2018-037)