利用酵母双杂交筛选与弓形虫棒状体蛋白9相互作用的宿主蛋白

Research on screening of host proteins interacting with Toxoplasma gondii ROP9 by yeast two-hybrid system

摘要

目的 扩增弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白9（ROP9）基因，构建诱饵载体，转化Y2H Gold酵母感受态细胞，进行自激活活性检测，运用酵母双杂交系统筛选与ROP9存在相互作用的人脑组织蛋白质。 方法 运用RT-PCR扩增弓形虫RH虫株速殖子ROP9基因，构建诱饵载体pGBKT7-ROP9，转化Y2H Gold酵母感受态细胞，进行自激活活性检测，以转化诱饵载体pGBKT7-ROP9的Y2H Gold酵母菌株与人脑cDNA文库转化的Y187菌株双杂交筛选与ROP9相互作用的宿主蛋白，对阳性克隆进行测序，并用BLAST分析，筛选出与ROP9存在相互作用的人脑组织蛋白质。 结果 运用酵母双杂交系统，筛选出5个与ROP9相互作用的捕获蛋白质：内质网凝集素蛋白1（ERLEC1）、细胞色素c氧化酶铜分子伴侣（COX11）、驱动蛋白结合蛋白（KIAA1279）、GRCh38、膜联蛋白A11（ANXA11）。 结论 首次运用酵母双杂交技术筛选出与弓形虫ROP9相互作用的宿主蛋白质，为进一步研究ROP9与宿主细胞相互作用和机理奠定基础。

Abstract

Objective To amplify the rhoptry protein 9（ROP9）gene of tachyzoites of Toxoplasma gondii RH strain,construct bait vector pGBKT7-ROP9 followed by detection of autoactivation activity and to screen host proteins from human brain cDNA library interacting with ROP9 using yeast two-hybrid system. Method In our study，the gene of ROP9 was amplified from RH strain of T.gondii by RT-PCR and ROP9 was inserted into the pGBKT7 vector to construct bait vector pGBKT7-ROP9 followed by detection of autoactivation activity.Using yeast two-hybrid system,host proteins interacting with ROP9 was screened from human brain cDNA library after sequencing of positive clones and BLAST analysis. Result Five prey protein interacting with ROP9 were captured from human brain including ERLEC1、COX11、KIAA1279、GRCh38 and ANXA11. Conclusion This study firstly reported research on screening of host proteins interacting with T.gondii ROP9,which will laid a foundation for further study of interaction and mechanism between ROP9 and host proteins.

Graphical abstract

关键词

弓形虫 / 棒状体蛋白9 / 酵母双杂交 / 相互作用.

Key words

Toxoplasma gondii / ROP9 / yeast two-hybrid system / interaction

弓形虫（Toxoplasma gondii）是引起人和几乎所有温血动物一种危害十分严重的人兽共患寄生虫病的病原。家畜感染弓形虫会产生呼吸困难、发热、腹泻及中枢神经系统疾病，怀孕母畜发生流产、死胎和产弱胎。在免疫力健全的人体内，弓形虫感染没有症状，然而在免疫缺陷患者体内，如艾滋病患者、器官移植受体和孕妇，弓形虫感染可以致命^［1-2］。弓形虫的中间宿主包括了几乎所有的脊椎动物，速殖子是弓形虫引起中间宿主发生急性感染的主要组织形态^［3-5］。当中间宿主被卵囊或包囊感染时，生长缓慢的缓殖子立刻分化成生长迅速的速殖子，速殖子分裂继而裂解感染细胞，导致受感染细胞的损伤^［6-7］。

弓形虫在全世界的流行呈现基因型多样性，I型（ToxoDB#10），II型（ToxoDB#1），III型（ToxoDB#2）和12型（ToxoDB#5）是4种主要的基因型，其中，I型对小鼠的毒力最高，在所有小鼠品系中的100％致死量小至1^［8-10］。棒状体是弓形虫在入侵中间宿主阶段特有的分泌细胞器，有研究表明，弓形虫棒状体分泌的棒状体蛋白在入侵宿主过程中发挥重要作用，如参与修饰纳虫空泡膜、影响虫体分裂增殖和宿主细胞基因表达、调节宿主细胞蛋白质的翻译后修饰等^［11-15］。弓形虫棒状体蛋白9（ROP9）仅在速殖子阶段表达，在虫体入侵宿主细胞早期发挥作用，而且包含B细胞表位，能够诱导机体产生特异性的CD4⁺T细胞反应^［16-17］。本研究以弓形虫RH虫株ROP9为研究对象，构建诱饵质粒，运用酵母双杂交系统筛选与ROP9相互作用的宿主蛋白质，为进一步研究ROP9在与宿主互作过程中的功能和机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Clontech Matchmaker Gold酵母双杂系统、人脑组织cDNA文库、酵母培养基、酵母质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化公司；限制性内切酶购自New England Biolabs（北京）有限公司；DH5α感受态细胞由本实验室保存；弓形虫RH虫株由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜寄生虫病创新团队惠赠；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 弓形虫RH虫株速殖子ROP9基因的RT-PCR扩增

将弓形虫RH虫株速殖子接种6周龄Balb/c小鼠，连续传代3代以后，收集小鼠腹水中速殖子，提取总RNA，反转录获得cDNA。设计特异性引物（RP9-F：5′-CGGAATTCATGAGTTCTTCCAA TTTTAGGGTGGG-3′，引入EcoR I酶切位点），RP9-R：5′-CGGGATCCCCTGCATGATCAACG AGGGCTTGAC-3′，引入BamH I酶切位点）以扩增弓形虫RH虫株速殖子ROP9基因^［18］。以cDNA为模板应用RT-PCR扩增ROP9基因，反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共30个循环，72 ℃ 10 min，PCR反应结束后，产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3 诱饵载体pGBK-T7-ROP9的构建

运用胶回收试剂盒回收RT-PCR反应产物，胶回收产物与pGBK-T7载体分别用EcoR I和BamH I进行双酶切，分别回收ROP9与pGBK-T7载体双酶切产物，运用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，菌液PCR和双酶切鉴定正确后送至上海生工生物公司测序，测序结果正确的阳性重组质粒命名为pGBK-T7-ROP9，用于后续试验。

1.4 诱饵载体自激活验证和毒性检测

将pGBK-T7-ROP9诱饵质粒和pGBK-T7空载体质粒分别转化至酵母菌株Y2HGold中，分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体平板培养基上，30 ℃倒置培养3~4 d，分别观察生长情况及数量。

1.5 ROP9互作蛋白的筛选

参照MatchmakerTMGold系统说明书进行酵母双杂交筛选。挑取转化pGBK-T7-ROP9质粒的Y2H Gold酵母单菌落接种于3 mL SD/-Trp液体培养基，置于200 r/min的摇床培养24 h之后，扩大培养至50 mL SD/-Trp液体培养基。监测菌液D₆₀₀值，当D₆₀₀=0.8时，离心收集酵母细胞，使用5 mL SD/-Trp液体培养基重新制成悬浮液。将悬浮液与1 mL文库混合，同时加入45 mL含有卡那霉素的2×YPDA液体培养基，置于2 L的锥形瓶中，在30 ℃摇床以50 r/min速度培养20 h。在显微镜下观察细胞形态，当大部分细胞呈三叶草型时，离心弃去上清，菌体沉淀用50 mL YPDA液体培养基重悬，再次离心弃去上清，菌体沉淀用10 mL YPDA液体培养基重悬，重悬液涂布至SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上，置于30℃恒温培养箱倒置培养3~8 d，筛选阳性菌落，初筛获得的阳性菌落重新涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上进一步筛选，以减少假阳性。

1.6 阳性酵母菌的鉴定及生物信息学分析

应用菌落PCR对重复验证的阳性菌落进行鉴定，PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序，对测序结果进行BLAST数据库比对分析，以获得外源插入片段的生物学信息。

2 结果与分析

2.1 ROP9基因扩增和诱饵载体的构建

RT-PCR扩增弓形虫RH株ROP9基因，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1 092 bp处有单一的DNA条带，与预期ROP9基因片段大小一致（图1）。诱饵质粒pGBKT7-ROP9经EcoR I和BamH I双酶切鉴定结果显示结果正确，测序结果与ROP9基因序列一致（图2）。

2.2 诱饵蛋白自激活的验证

将构建好的诱饵载体质粒pGBKT7-ROP9转化至Y2HGold酵母感受态细胞，接着分别涂布在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体平板培养基上，倒置培养3~4 d后，结果如图3所示：转化诱饵载体质粒pGBKT7-ROP9的Y2HGold酵母细胞在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-Gal培养基上均生长为白色菌落，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体平板培养基上无菌落生长。因此，诱饵载体质粒pGBKT7-ROP9无自激活活性，可以用于酵母双杂交系统筛选。

2.3 酵母双杂交系统筛选与ROP9互作的蛋白质

将酵母双杂交产物涂布于150 mm的SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA二缺培养基上，培养1周后菌落直径较大的转化子共有65个。初筛获得的阳性菌落涂布在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA四缺培养基上，最终筛选出7个阳性克隆。提取7个阳性克隆对应的捕获质粒，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，以捕获质粒为模板，PCR扩增捕获质粒插入序列，结果如图4。

2.4 阳性克隆的测序

将阳性克隆的PCR产物测序，运用NCBI的BLAST软件分析阳性克隆序列，发现这7个阳性克隆序列与5个已知基因的部分序列高度同源（表1）。

3 讨论

棒状体蛋白是一类参与弓形虫入侵和生长的重要毒力因子，许多棒状体蛋白能够与宿主细胞蛋白质产生相互作用，如ROP16^{［14，19］}，ROP18^［20］，ROP21^［12］，ROP32^［11］，Toxofilin^［21］等。弓形虫ROP9氨基酸序列包含2个疏水性序列，其中一个疏水性序列位于氨基端附近，并且包含一个预测的信号肽序列，另一个疏水性序列是位于羧基端的短疏水性序列^［16］。研究表明，ROP9、MIC3、SAG2三者在入侵宿主细胞的RH虫株速殖子的转录和翻译水平高于未入侵宿主细胞的RH虫株速殖子，况且ROP9、MIC3、SAG2三者均表现出与肝素和宿主细胞表面的结合活性，说明ROP9不但是弓形虫的肝素结合蛋白，而且参与弓形虫感染宿主细胞的黏附和入侵过程^［22］。此外，与野生RH虫株速殖子相比，ROP9基因敲除的RH虫株速殖子入侵宿主细胞比例和增殖比例分别降低约28%和35%，ROP9基因敲除的RH虫株速殖子感染细胞逸出的时间也比野生RH虫株速殖子延长，而且小鼠感染ROP9基因敲除的RH虫株速殖子的存活时间相比于野生RH虫株速殖子也延长，这表明ROP9在弓形虫体外和体内感染中都发挥作用^［23］。

酵母双杂交系统是大规模筛选诱饵蛋白相互作用候选蛋白的有效方法^［24］，本研究通过RT-PCR克隆弓形虫RH虫株ROP9基因，构建诱饵载体pGBKT7-ROP9，将其转染至Y2H Gold酵母感受态细胞中，自激活活性试验表明构建的重组载体在Y2H Gold酵母感受态细胞中无自激活活性，通过酵母双杂交实验筛选出5个与人脑组织蛋白。ERLEC1是细胞内质网中的蛋白质，其包含2个甘露糖磷酸受体同源亚基，在N-糖链和内质网相关降解中发挥作用^［25］。Cox11是细胞色素c氧化酶复合体组装必需的跨膜蛋白之一，其通过一个跨膜螺旋锚定于线粒体内膜上^［26］。KIAA1279是宿主细胞的驱动蛋白结合蛋白之一，是驱动蛋白组合体组装的调节者，在骨发育过程中发挥重要作用^［27］。Anxa11在多种类型的细胞中均有表达，是钙离子调节磷脂依赖和细胞膜结合活性的膜联蛋白多基因家族成员，其在细胞分化、钙离子信号、囊泡转运和细胞凋亡中发挥重要作用，Anxa11的缺失和突变与系统性自身免疫性疾病、结节病以及癌症的发展、耐药性和复发有关^［28］。ROP9与这些宿主蛋白质相互作用方式还需要进一步的验证，深入研究ROP9与它们的相互作用及生理功能将为明确ROP9与宿主之间的相互作用机制鉴定基础。

4 结论

本研究运用RT-PCR扩增弓形虫RH虫株速殖子ROP9基因，构建诱饵载体pGBKT7-ROP9，转化Y2H Gold酵母感受态细胞，运用酵母双杂交系统，以转化诱饵载体pGBKT7-ROP9的Y2H Gold酵母菌株与人脑cDNA文库转化的Y187菌株双杂交筛选与ROP9相互作用的宿主蛋白，筛选出5个与ROP9相互作用的捕获蛋白质：内质网凝集素蛋白1（ERLEC1）、细胞色素c氧化酶铜分子伴侣（COX11）、驱动蛋白结合蛋白（KIAA1279）、GRCh38、膜联蛋白A11（ANXA11）。

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基金资助

家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金项目(SKLVEB2019KFKT005)

国家自然科学基金项目(32160843)

甘肃省重点研发计划-社会发展类项目(18YF1FA080)