N、P、K平衡施肥对金银花产量和品质及相关基因表达的影响

Effects of the balanced fertilization of N，P and K on the yield，quality and related gene expression in Lonicera japonica

摘要

目的 通过N、P、K平衡施肥提高金银花产量和品质，分析其促进绿原酸和木犀草苷积累的机制。 方法 以金银花“北花一号”3 a生植株为材料，施用4个不同比例N、P、K ［CK（1∶1∶1）（对照）、T₁（1∶2∶1）、T₂（2∶1∶1）和T₃（1∶1∶2）］，测定二白期花蕾产量和品质及相关基因表达水平。 结果 N、P、K平衡施肥可显著促进植株的生长发育（如着花节数、花朵鲜重和花蕾数），提高花蕾产量、主要活性物质（绿原酸、木犀草甘、可溶性糖、总黄酮类和总酚类化合物）含量、抗氧化能力，诱导绿原酸和木犀草苷生物合成途径中7个关键酶基因（PAL3、C4H2、4CL1、HQT1、CHS2、CHI2和FNS1）的表达；其中，以T₂平衡施肥效果最佳，相比CK、T₁和T₃，产量分别提高1.98、1.29和1.21倍，绿原酸、木犀草苷、可溶性糖、总黄酮、酚类化合物含量和抗氧化能力最大提高1.79、1.71、1.80、1.64、1.92和1.24倍，7个关键基因PAL3、C4H2、4CL1、HQT1、CHS2、CHI2和FNS1的表达水平最大上调7.00、7.10、3.96、4.58、2.07、1.51和3.27倍。 结论 N、P、K为2∶1∶1的平衡施肥可显著提高金银花的产量和品质，通过上调相关基因的表达可促进阿魏酸和木犀草苷的合成和积累。

Abstract

Objective The study aimed to improve the yield and quality of Lonicera japonica by the balanced fertilization of N，P and K，and to explore the mechanism of chlorogenic acid and galuteolin accumulation in L.japonica. Method The 3-year-old plants of L.japonica Beihua No.1 were employed and four fertilization treatments of different ratio of N，P and K were performed,i.e.,CK (1∶1∶1)，T₁(1∶2∶1)，T₂(2∶1∶1) and T₃(1∶1∶2), followed by measuring the yield and quality of flower buds and by analyzing related genes expression at the two-white flowering stage. Result The balanced fertilization of N，P and K significantly enhanced plant growth and development (e.g.,the number of knots with buds，fresh weight of flower buds，and flower bud number), improved flower bud yield and the content of main bioactive compounds (e.g.，chlorogenic acid，cynaroside，soluble sugar，total flavonoids，and total phenols)，and the antioxidant capacity. In addition, the balanced fertilization could induce the up-regulation expression of seven genes (i.e.，PAL3，C4H2，4CL1，HQT1，CHS2，CHI2 and FNS1) involved in biosynthesis of chlorogenic acid and galuteolin.Among the four treatments,the T₂ showed the best effectiveness in increasing the yield, which increased by 1.98，1.29 and 1.21 fold,respectively, compared to CK，T₁ and T₃; the levels of chlorogenic acid，galuteolin，soluble sugar，total flavonoids，total phenols and antioxidant capacity increased by 1.80，1.64，1.92，1.79，1.71and 1.24 fold, respectively; and the expression levels of PAL3，C4H2，4CL1，HQT1，CHS2，CHI2 and FNS1 were regulated up to 7.00，7.10，3.96，4.58，2.07，1.51 and 3.27 fold,respectively. Conclusion The balanced fertilization of N，P and K with the ratio of 2∶1∶1 could significantly improve the yield and quality of L. japonica, and could enhance the accumulation of chlorogenic acid and galuteolin by up-regulating related gene expression. These findings could be used as scientific reference to the rational fertilization in production of L.japonica.

Graphical abstract

关键词

金银花 / 平衡施肥 / 产量和品质 / 绿原酸 / 木犀草苷 / 基因表达

Key words

Lonicera japonica Thunb. / balanced fertilization / yield and quality / chlorogenic acid / galuteolin / gene expression

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热的功能，用于治疗热毒血痢、风热感冒、温病发热等症^［1］。现代药理学研究发现，金银花具有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、增强免疫和抗氧化等功效^［2-3］。化学分析表明，金银花富含多种类型的化合物，主要包括有机酸类（如绿原酸）、黄酮类（如木犀草苷）、挥发油类、环烯醚萜类、以及三萜和三萜皂苷类，其中，绿原酸和木犀草苷双成分已作为金银花的质量控制指标^{［1，3-4］}。

为了提高金银花产量和品质，很多学者就品种选育、生态适应性及区域规划等方面进行了大量研究^［5-7］。研究表明，土壤肥力显著影响金银花的产量和品质^［8］。通过施以合理的氮（N）、磷（P）、钾（K）可提高金银花产量和品质。翟彩霞等^［9］研究发现，N、P、K施用量分别在240~360、180~360、150~225 kg/hm²范围内，木犀草苷含量均高于《中国药典》标准的0.05%；王俊儒等^［10］研究发现，N、P配比施肥可显著提高蕾产量、绿原酸和黄酮含量；郑江娜等^［11］研究发现，N、K配比施肥可提高花蕾产量以及活性物质绿原酸、咖啡酸、木犀草苷含量。曾慧杰等^［12］通过测土配方研究表明，N、P、K 对提高花蕾产量和品质均具有显著促进作用。

到目前为止，对于N、P、K配比施肥对金银花产量和品质影响，以及施肥促进主效活性物质绿原酸和木犀草苷积累机制方面的研究甚少。因此，本研究根据前人N∶P、N∶K和测土配方^［10-12］，金银花绿原酸和木犀草苷生物合成中关键酶基因挖掘^［13-14］，以及前期针对甘肃省不同产地和品种金银花质量综合评价^［15］等研究的基础上，对不同N、P、K平衡施肥下金银花花蕾质量和品质、以及绿原酸和木犀草苷生物合成中关键基因表达量进行测定与分析，旨在找到较佳的N、P、K配比、分析其促进主效活性物质绿原酸和木犀草苷积累的机制，为金银花合理施肥提供科学依据和重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以种植3 a的金银花“北花一号”为材料，植株种植于甘肃省平凉市静宁县八里镇（海拔1 700 m；E 105^o43'04"，N 35^o31'51"）。试验点土壤为砂壤土，0~30 cm耕层含有机质16.1 g/kg、腐殖酸16.2 g/kg、全氮 1.01 g/kg、全磷 0.76 g/kg、全钾 14.3 g/kg、碱解氮 128.5 mg/kg、速效磷14.3 mg/kg、速效钾 89.9 mg/kg，质地中壤，肥力均匀，pH 8.11。2021年4月1日，将4个不同比例尿素（CH₄N₂O）、过磷酸钙（CaP₂H₄O₈）和硫酸钾（K₂SO₄） ［CK（1∶1∶1）（对照）、T₁（1∶2∶1）、T₂（2∶1∶1）和T₃（1∶1∶2）］，施肥于长势（株高和茎粗）较为一致的植株根部，施肥量0.4 kg/株，每个处理20株；6月20日，采集二白期花蕾，一部分立即冻存于液氮，用于基因表达测定；一部分带回实验室杀青烘干，用于产量和品质分析。

1.2 产量指标测定

着花节数：每个处理选择20株，统计新生的第一级枝条着生花蕾的枝条节数，取平均值。

花蕾测定：每个处理选择20株，分别采摘树冠外围中上部位，顶部膨大略带乳白色、基部青绿，含苞不放的花蕾，统计花蕾数量、测量其质量，并换算为百蕾质量^［12］。

产量测定：每个处理选择20株，采摘全部二白期花蕾，计算总产量。

1.3 品质指标测定

1.3.1 提取液制备

称取1.0 g干燥花蕾粉末置于25 mL无水乙醇中，恒温震荡提取（28℃、120 r/min）24 h，室温静置2 h，收集上清液，连续提取3次，合并提取液，4℃、8 000 r/min离心10 min，上清液经减压浓缩（500 mbar、70℃、150 r/min）至小体积，用无水乙醇定容至5 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤后，用于活性物质含量和抗氧化能力测定。

1.3.2 活性物质含量和抗氧化能力测定

绿原酸和木犀草苷含量测定采用HPLC法^［16-17］；可溶性糖含量测定采用硫酸-苯酚法^［18］；总黄酮类化合物含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法^［19］；总酚类化合物含量测定采用福林酚试剂法^［20］；体外抗氧化能力测定采用DPPH和FRAP 2种方法^［21-23］。

1.4 绿原酸和木犀草苷生物合成相关基因表达的测定

样品总RNA提取采用Plant RNA Kit （R6827），利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。绿原酸和木犀草苷生物合关键基因PAL3、C4H2、4CL1、HQT1、CHS2、CHI2和FNS1以及内参基因Actin引物（表1）^［13-14］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用FastKing RT kit （KR123）合成第1链cDNA，利用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green，FP205）进行qRT-PCR测定。采用2^－△△Ct 法计算基因的相对表达水平^［24］。

1.5 统计与分析

每个测定重复3 次，采用SPSS 22.0 软件进行One-Way ANOVA Duncan 数据差异显著性分析；采用Microsoft Office Excel 2007进行制图。

2 结果与分析

2.1 不同N、P、K配比施肥对金银花产量的影响

图1结果显示，相对于对照（CK），N、P、K配比施肥对金银花着花节数、花朵鲜质量、花蕾数和产量均有所增加，其中花朵鲜质量、花蕾数和产量达到显著水平（P<0.05）。通过比较增加量发现，T₂配比下各测定指标值均高于CK、T₁和T₂，着花节数分别增加1.31、1.18和1.19倍（图1-A），花朵鲜质量分别增加1.51、1.13和1.09倍（图1-B），花蕾数分别增加1.82、1.16和1.21倍（图1-C），产量分别增加1.98、1.29和1.21倍（图1-D）。

2.2 不同N、P、K配比施肥对金银花绿原酸和木犀草苷含量的影响

图2结果显示，相对于CK，N、P、K配比施肥对绿原酸和木犀草苷含量均显著增加。其中，T₂配比最为显著，相对于CK、T₁和T₃绿原酸含量分别增加1.79、1.12和1.14倍（图2-A），木犀草苷分别增加1.71、1.13和1.31倍（图2-B）。

2.3 不同N、P、K配比施肥对金银花可溶性糖、总黄酮和酚类化合物含量的影响

图3结果显示，相对于CK，N、P、K配比施肥对可溶性糖、总黄酮和酚类化合物含量均显著增加，总体呈现T₂配比优于CK、T₁和T₂。其中，T₂配比可溶性糖含量与T₁无显著差异（P<0.05），较CK和T₃分别增加1.80和1.11倍（图3-A）；总黄酮含量较CK、T₁和T₂分别增加1.64、1.32和1.20倍（图3-B）；总酚类含量分别增加1.92、1.34和1.39倍（图3-C）。

2.4 不同N、P、K配比施肥对金银花抗氧化能力的影响

图4结果显示，相对于CK，N、P、K配比施肥对金银花提取液体外抗氧化能力均显著增加。T₂配比DPPH抑制率最为显著，相对于CK、T₁和T₃分别增加1.24、1.07和1.03倍（图4-A）；T₁和T₂配比FRAP值无显著差异，其中，T₂相对于CK和T₃分别增加1.15和1.05倍（图4-B）。。

2.5 不同N、P、K配比施肥对绿原酸和木犀草苷生物合成关键基因表达的影响

图5结果显示，N、P、K配比施肥对金银花中绿原酸和木犀草苷生物合成关键基因表达具有不同程度的影响。总体呈现T₂处理下PAL3、C4H2、HQT1、CHS2、CHI2和FNS1 6个关键基因的表达水平显著高于CK、T₁和T₂ （P<0.05）。其中，T₂配比下PAL3表达水平较CK、T₁和T₃分别上调2.86、1.23和7.00倍，C4H2分别上调7.06、1.65和7.10倍，HQT1分别上调4.58、1.43和3.01倍，CHS2分别上调1.44、1.54和2.07倍，CHI2分别上调1.37、1.51和1.49倍，FNS1分别上调3.27、2.68和2.70倍；而T₂配比4CL1与CK和T₁无显著差异，相对于CK和T₁下调1.02和1.20倍，但相对于T₃上调3.96倍。

3 讨论

N、P、K是植物生长发育需求量最大的矿质元素，在植物生命活动中扮演重要的角色，其中N是植物细胞重要构成成分的组成元素，包括氨基酸、蛋白质和核酸；P也是植物细胞内重要化合物的组成元素，包括呼吸作用和光合作用中的糖-磷中间体以及组成植物膜的磷脂，也是能量代谢ATP和DNA与RNA的组成元素。K在调节植物细胞渗透势方面起重要作用，也能激活许多参与呼吸作用和光合作用的酶^［25］。很多研究表明，不同植物不同生长发育期、以及生产目标的差异对N、P、K的需求量不尽相同^［26-28］。本研究发现，不同N、P、K配比施肥显著影响金银花花蕾的产量（包括着花节数、花朵鲜重和花蕾数）、品质（包括绿原酸、木犀草苷、可溶性糖、总黄酮和总酚含量及抗氧化能力）、以及主效活性物质绿原酸和木犀草苷生物合成中关键酶基因的表达水平。

研究表明，施肥有助于提高金银花产量，随着施肥量的增加，单株产量也随之增加，但施肥量达到一定量后产量随即下降^［9，29］。通过对N、P和K单一试验发现，对金银花增产作用大小顺序为：N>P>K^［30-31］，其中，施用量分别以0.1、0.2、0.1 kg/株为宜^［30］。对产量研究发现，N、P、K 及复合肥均可促进金银花植株的花芽分化，与花蕾长度均呈正相关，其中N能提高叶和花的产量，P是影响花蕾重和产量的主要肥力因子，是花蕾生长发育的关键元素^{［12，31］}；对品质研究发现，金银花中绿原酸的含量与N呈负相关^［31］，而与P呈正相关^{［8-9，12，31］}；木犀草苷含量与N和土壤肥力指数呈负相关^［8］，而与P和K的协同作用呈正相关^［12］。因此，平衡施肥是提高金银花产量的重要方法之一，通过平衡施肥可显著改善金银花的生长状况，显著提高花蕾的产量和品质^［32］。通过配比施肥发现，N∶P为1∶3可显著提高绿原酸的含量^［33］；N∶P为1∶0.8不仅提高2倍以上花蕾产量，而且绿原酸和黄酮类化合物含量增加1.2倍以上^［10］；N∶K为1∶0.4可使绿原酸、木犀草苷和咖啡酸含量达到最佳^［11］。本研究结果发现，N∶P∶K为2∶1∶1（T₂处理）时效果最为显著，不仅可以显著提高花蕾产量，而且显著促进了活性物质绿原酸、木犀草苷、可溶性糖、总黄酮和总酚类化合物的积累，进而增强了花蕾提取液的抗氧化能力。

绿原酸和木犀草苷作为金银花主要的质量控制化合物，它们的生物合成主要通过苯丙氨酸代谢途径，首先，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）的作用下形成香豆酰辅酶A（p-Coumaroyl-CoA）；通过HQT（hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase）催化合成绿原酸；或者香豆酰辅酶A也可以通过查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）、黄酮合酶（flavone synthase，FNS）和一种P450酶催化合成木犀草素^{［14，34］}。有研究报道发现，外施GA₃可显著促进C4H1、C4H2、4CL1和HQT2 基因的表达，提高绿原酸、木犀草素、木犀草苷、异槲皮素和咖啡酸的生物合成和含量^［35］。本研究结果发现，通过N、P、K配比施肥可显著调控金银花花蕾期绿原酸和木犀草苷生物合成途径中7个关键基因PAL3、C4H2、4CL1、HQT1、CHS2、CHI2和FNS1的表达，其中以高比例的N处理（T₂，2∶1∶1）表达水平上调最为显著，其可以促使氨基酸（如苯丙氨酸）的生物合成，为苯丙烷类化合物生物合成提供前提物质，进而提高绿原酸和木犀草苷的合成和积累^［36］。

4 结论

通过N、P、K平衡施肥可促进金银花植株的生长发育，显著提高花蕾产量，诱导活性物质生物合成途径中关键酶基因的表达，进而促进活性物质的生物合成和积累，最终促进花蕾优良品质的形成；其中，以N∶P∶K为2∶1∶1配比施肥最佳。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］：一部.北京：中国医药科技出版社，2015．

[2] Ya S U， Pei Y， Sun W J，et al.Review of factors influencing active components of Lonicera japonica Thunb.［J］.Medicinal Plant，2019，10（4）：5-8.

[3] 高攀.金银花临床药理作用的研究进展［J］.医学信息，2018，31（23）：37-40.

[4] Qiu S， Bai M， Zhao P，et al.Phytochemical and network-based chemotaxonomic study of Lonicera japonica Thunb.［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2021，94：104210.

[5] 刘天亮，董诚明，齐大明，等.不同产地及加工方式金银花的质量评价［J］.中药材，2020，43（3）：582-586.

[6] 解世全，王帅，孟宪生，等.不同产地金银花质量评价［J］.中国实验方剂学杂志，2016，22（5）：80-83.

[7] 沈娟，崔培超，王永香，等.不同种质金银花中有机酸类及苷类成分的测定［J］.中草药，2014，45（20）：2993-2996.

[8] 陈乔乔，翁少全，程亮，等.道地金银花品质与土壤肥力关系的研究［J］.土壤，2021，53（4）： 732-738.

[9] 翟彩霞，张彦才，刘灵娣，等.氮、磷、钾肥对金银花产量及绿原酸、木犀草苷含量的影响［J］.华北农学报，2012，27（S）：328-332.

[10] 王俊儒，霍阿丽，张晓丽，等.氮磷配施对金银花产量和品质的影响［J］.土壤通报，2009，40（4）：847-851.

[11] 郑江娜，李雪娇，任士福，等.氮、钾配施追肥对金银花二、三、四茬花产量及药用成分含量的影响［J］.林业与生态科学，2021，36（3）：306-313.

[12] 曾慧杰，王晓明，乔中全，等.测土配方施肥对金银花产量和质量的影响［J］.核农学报，2017，31（12）：2443-2449.

[13] 周芸帆，文艺，高素霞，等.忍冬枝枯病对金银花绿原酸合成相关酶基因LjHQT和LjC4H₂ 转录水平的影响［J］.辽宁中医药大学学报，2019，21（11）：36-40.

[14] 秦双双，黄璐琦，袁媛.华南忍冬绿原酸和木犀草素生物合成关键酶基因表达分析［J］.中国中药杂志，2014，39（13）：2469-2472.

[15] 杨学珍，孔维三，芮仕立，等.甘肃省不同产地和品种金银花质量综合评价研究［J］.甘肃农业大学学报，2022，待刊.

[16] 张元元，李进，陈涛，等.高效液相色谱法同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量［J］.天津中医药大学学报，2011，30（2）：107-109.

[17] 辛华，丰杰，程若敏，等.HPLC测定不同产地金银花中绿原酸和木犀草苷［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（2）：60-63.

[18] Dubois M， Gilles K A， Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[19] Lay M A， Karsani S A， Mohajer S，et al.Phytochemical constituents，nutritional values，phenolics，flavonols，flavonoids，antioxidant and cytotoxicity studies on Phaleria macrocarpa （Scheff.） Boerl fruits［J］.BMC Complementary and Alternative Medicine，2014，14：152.

[20] Beato V M， Orgaz F， Mansilla F，et al.Changes in phenolic compounds in garlic （Allium sativum L.） owing to the cultivar and location of growth［J］.Plant Foods for Human Nutrition，2011，66（3）：218-223.

[21] Nencini C， Menchiari A， Franchi G G，et al.In vitro antioxidant activity of aged extracts of some Italian Allium species［J］.Plant Foods for Human Nutrition，2011，66（1）：11-16.

[22] Benzie I F， Strain J J.The ferric reducing ability of plasma （FRAP） as a measure of “antioxidant power”：the FRAP assay［J］.Analytical Biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[23] 张真，蔺海明，杜弢，等.寒旱区不同生态型艾活性物质含量_抗氧化能力及挥发性组分比较分析［J］.甘肃农业大学学报，2020，55（3）：78-89.

[24] Willems E， Leyns L， Vandesompele J.Standardization of real-time PCR gene expression data from independent biological replicates［J］.Analytical Biochemistry，2008，379（1）：127-129.

[25] 宋纯鹏，王学路.植物生理学［M］.第四版 译著.北京： 科学出版社，2009.

[26] 王姗，鲍华鹏，王全智，等.N、P、K对铁兰属植物Tillandsia stricta生长与开花的影响［J］.中国农学通报，2014，30（16）： 221-225.

[27] 陆秀君，葛根塔娜，梅梅，等.N、P、K配比施肥对美国红枫幼苗生长及叶色变化的影响［J］.中南林业科技大学学报，2015，35（5）： 9-15.

[28] 白艳荣，蒋亚莲.不同施肥方式与N、P、K配比对洋桔梗切花生长发育及品质的影响［J］.西南农业学报，2019，32（8）：1860-1863.

[29] 李琳，韩烈刚，李卫东，等.移栽施肥量对京郊金银花产量和质量的影响［J］.中国中药杂志，2012，37（4）：450-452.

[30] 李永欣，王晓明，曾慧杰，等.金银花优良品种‘舜帝1号’施肥技术研究［J］.湖南林业科技，2015，42（2）：19-22.

[31] 朱小强，游玮，房堂来.施肥对金银花生长开花影响的试验研究［J］.陕西林业科技，2008，4：42-44.

[32] 吴朝峰，马雪梅.不同平衡施肥方式对金银花叶片的生理指标、产量及品质的影响［J］.中国园艺文摘，2018，3： 32-34.

[33] 张晓丽.氮磷不同配方及用量对金银花中绿原酸含量的影响研究［J］.杨凌职业技术学院学报，2018，17（2）：41-42.

[34] Yuan Y， Wang Z Y， Jiang C，et al.Exploiting genes and functional diversity of chlorogenic acid and luteolin biosyntheses in Lonicera japonica and their substitutes［J］.Gene，2014，534（2）：408-416.

[35] 朱艳霞，秦双双，蒋超，等.GA₃和DPC对金银花活性成分的影响及其作用机制研究［J］.中国中药杂志，2018，43（24）：4817-4823.

[36] 王莉，史玲玲，张艳霞，等.植物次生代谢物途径及其研究进展［J］.武汉植物学研究，2007，25（5）：500-508.

基金资助

甘肃省重点人才项目(2020RCXM103)

道地药材生态种植与质量保障项目(202103003)