辣木籽油对人小脑颗粒细胞氯离子通道的影响

Efffect of Moringa oleifera seed oil on chloride channels in human cerebellar granulosa cells

摘要

目的 探究辣木籽油对人小脑颗粒细胞γ-氨基丁酸受体（GABA_A）细胞膜氯离子通道的影响。 方法 首先利用冷榨法制得辣木籽油，通过连续培养人小脑颗粒细胞（human cerebellar granule cells，HCGC），采用CCK8法检测辣木籽油对细胞活力的影响，14 d后表达功能性GABA_A受体，经不同剂量（2、4、8 μg/mL）辣木籽油、油酸、β-谷甾醇、豆甾醇处理，空白组给予生理盐水，阳性药给予戊巴比妥钠（10 mmol/L），最后采用N，N二甲基二吖啶硝酸盐（MQAE）荧光探针检测小脑颗粒细胞内的氯离子浓度。 结果 辣木籽油等样品在10 μg/mL浓度以下对细胞活力没有任何影响；与空白组相比，辣木籽油（4、8 μg/mL）、油酸（4、8 μg/mL）、豆甾醇（4、8 μg /mL）及β-谷甾醇（8 μg/mL）对HCGC细胞以剂量依赖方式激活氯离子通道，且具有统计学差异（P<0.05）。此外，阳性药戊巴比妥钠（10 mmol/L）亦可激活HCGC细胞的氯离子通道，并具有统计学差异（P<0.01）。 结论 证明辣木籽油体外抑制神经元兴奋与GABA神经系统有关。

Abstract

Objective To explore the effect of Moringa oleifera seeds oil (MOO) on chloride ion flow of GABA_A receptors in human cerebellar granule cells (HCGC). Method The MOO was obtained by the cold pressed method. The HCGC cells were cultured 14 d successively. The CCK8 assay was used to determine cell viability, then the functional GABAA receptor was expressed. The cells were treated withMOO, oleic acid,β-sitosterol and stigmasterol at different concentrations i.e. 2, 4, 8 μg/mL. The blank control group was given normal saline; the positive group was treated with pentobarbital sodium solution at the concentration of 10 mmol/L.MQAE fluorescence probe was used to detect chloride ion concentration of HCGC cells. Result The cytotoxicity assay showed that all treatments at the concentration of 10 μg/mL had noncytotoxic to the cells.Compared with blank control group, the treatments of MOO (4, 8 μg/mL), oleic acid (4, 8 μg/mL), stigmasterol (4, 8 μg/mL) and β-sitosterol (8 μg/mL) significantly activated chloride channel of HCGC cells in dose-dependent manner (P<0.05).Moreover,the positive group was dramatically activated the chloride channel (P<0.01). Conclusion It is suggested that MOO inhibited neuron excitation is related with GABA nervous system.

Graphical abstract

关键词

辣木籽油 / 冷榨法 / 人小脑颗粒细胞 / γ-氨基丁酸受体 / 氯离子通道

Key words

Moringa oleifera seed oil / cold pressed method / human cerebellar granulosa cells / GABAA receptor / chloride channels

辣木（Moringa oleifera Lam.，MO）又名“鼓槌树”，为辣木科辣木属多年生落叶乔木，高达7~15 m，直径约为20~40 cm，起源于喜马拉雅山脉周边国家地区如巴基斯坦、孟加拉国等，属于耐干旱、抗逆性强的速生物种^［1］。MO于1960s初引种中国云南，主要为PKM1和PKM2两个改良品种，随着研究的不断深入，国家“大健康产业”的发展，我国热带和亚热带地区如广东、广西、海南、福建等地亦相继建立有大规模的种植基地^［2］。早在古罗马时期就有应用辣木的记载，且它还是一种重要的油料作物，大量研究表明，MO“浑身是宝”，其根皮、花、叶、茎和种子等部位均富含优质蛋白质、油脂，高膳食纤维，高矿物质元素（Ca、K、Mg等），维生素（A、E等）及类胡萝卜素等营养元素，具有调节血糖、神经保护、提高免疫及克服失眠等保健功效^［3］。

基于MO（叶和种子）丰富的营养功能成分，不仅可作为发达国家素食者们理想食物，还是一些发展中国家妇女、儿童对抗营养不良的绝佳食物资源^［4］。除作为食材外，MO民间用于治疗风湿病、麻痹瘫痪性癫痫、羊癫疯、腹水等病症^［5］。因此，多年来，MO被西方学者们誉为上帝赐予人类的珍贵礼物，又称其为“奇迹之树”^［6］。辣木籽呈球形，为辣木的种子，富含油脂、蛋白质、维生素、矿物质元素、膳食纤维等营养要素。辣木籽种仁含油率高达39%，含有生育酚、黄酮、维生素A、异硫氰酸酯等活性物质，具有抗氧化、提高免疫、抗菌、降血脂、降血糖等生物活性^［7-8］。

辣木籽油（MO oil，MOO）又称为“ben oil”，可作为色拉油或烹饪油食用，也可用作灯油、高级润滑油或航空用油，是一种颜色鲜亮，淡黄色透明液体，含有大量不饱和脂肪酸（约占82%），其中油酸（oleic acid，OA）含量约占70%^［1］。这与本实验室之前研究报道辣木籽油化学组成一致。有文献表明，油脂中OA含量越高标志着其稳定性越强、氧化诱导期越久、不易氧化酸败，且OA是膳食单不饱和脂肪酸的优良来源，在慢性病、心血管疾病的预防和治疗中发挥着至关重要的作用，这使得使MOO跻身于优质保健食用油行列，与橄榄油和山茶油一起誉为“高档健康食用油三姐妹”^［9］。有报道指出一些植物油如米糠油、酸枣仁油、天冬种子油具有改善睡眠作用且与其所含活性成分如生育酚、不饱和脂肪酸（油酸）、黄酮、甾醇类物质有关^［10-12］。所在实验室前期体内动物试验研究表明，辣木籽油富含油酸（>76%）、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等活性成分，并通过γ-氨基丁酸能神经系统（gamma aminobutyric acid-ergic nervous system，GABA-ergic）发挥改善睡眠作用^［13］。

GABA_A受体属于半胱氨酸环配体门控通道超家族成员，介导哺乳动物大脑中大多数突触抑制，当该受体与其激动剂或GABA结合后，氯离子通道开放，膜外高浓度的氯离子内流，细胞膜电位产生超极化，神经元的兴奋性降低^［14］。研究表明，小脑颗粒细胞神经元对GABA_A受体的种类和数量高表达，一些研究者采用MQAE［N-（Ethoxycarbonylmethyl）-6-methoxyquinolinium bromide］荧光探针检测化合物对氯离子流动的影响，进而反映化合物与GABA_A受体相互作用，来阐释化合物的镇静催眠或抗癫痫作用机制^［15］。基于前期研究基础，此次吖试验主要以MOO为研究材料，结合体外建立的人小脑颗粒细胞（human cerebellar granule cells，HCGC）模型，通过MQAE荧光探针法评价MOO对HCGC神经元细胞氯离子通道的影响，从体外初步探究其改善睡眠的作用机制，为功能性食品及药品研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品与试剂

干燥辣木籽（PKM2），购于云南天佑科技开发有限公司；HCGC细胞株（ATCC，Manassas，VA，USA），购于北纳生物科技有限公司；戊巴比妥钠（Pentobarbital sodium，PENT），Sigma；油酸（纯度>99%），β-谷甾醇（纯度>95%），豆甾醇（纯度>95%），均购于上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清（FBS），完全培养基（DMEM），双抗（青霉素和链霉素），均购于Sigma；CCK8细胞增殖检测试剂盒，江苏凯基生物科技有限公司；MQAE［N⁃（Ethoxycarbonylmethyl）⁃6⁃methoxyquinolinium bro mide］荧光探针试剂盒，Invitrogen；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器和设备

ZYJ-9018-2小型榨油机（广东省江门市贝尔斯顿电器有限公司）；BPN-80CWCO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SAFIREII多功能酶标分析仪（TECAN）；MF53倒置荧光显微镜（广州市明美光电有限公司）；CP153电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；Vi-CELL XR自动细胞计数仪（Invitrogen）。

1.2 试验方法

1.2.1 辣木籽油的制备

参考实验室之前的榨油方法及相应文献并改进^{［13，16］}，将自然晾干的辣木籽进行脱壳预处理得到奶白色籽仁，然后用电子称精密称取1 kg，榨油机设定好程序参数（最佳下料速度：100颗辣木籽仁/min，出油温度：56 °C，出油速度：67.5 mL/h）进行预热15 min后，将1 kg辣木籽仁分批投入榨油机中，冷法压榨得到新鲜淡黄色鲜明透亮的辣木籽油，用无菌离心管将所得辣木籽油进行分装并冷冻保存于-20 ℃冰箱中供后期试验用。

出油率（%）=\frac{\mathrm{所投}\mathrm{辣木}\mathrm{籽仁}\mathrm{质量}-\mathrm{榨油}\mathrm{后剩}\mathrm{余料}\mathrm{渣质}\mathrm{量}}{\mathrm{所投}\mathrm{辣木}\mathrm{籽仁}\mathrm{质量}}×100%

1.2.2 人小脑颗粒细胞（HCGC）的培养

1.2.2.1 HCGC细胞的冻存

在正常的细胞消化步骤后，将消化离心后的细胞，弃去上清，用已经配制好的冻存液（92%完全培养基+8%DMSO）轻轻重悬细胞，尽快加入已经标记好的冻存管中；将冻存管以此在4 °C温度下10 min，-20°C温度下2 h，-80 °C过夜后液氮保存。

1.2.2.2 HCGC细胞的复苏

将有细胞的冻存管从液氮罐中取出，然后将冻存管放入37 ℃水浴中快速解冻；利用5 mL移液管将冻存管中的细胞吸出，然后将细胞迅速转移到细胞培养瓶中，为避免污染整个操作在超净工作台中完成；做好标记，放入CO₂培养箱中，次日换液。

1.2.2.3 HCGC细胞的换液及传代

复苏完成后的HCGC细胞首先放于CO₂培养箱（5% CO₂，37 ℃）中培养过夜，接着将过夜培养的细胞放置于倒置显微镜下观察细胞状态，根据细胞状态进行后续操作，若细胞状态良好可以继续培养，由于刚复苏的细胞生长较为缓慢且数目不多，所以开始几天可以2 d左右更换一次完全培养基，完全培养基为在DMEM高糖培养基中加入10%灭活FBS和1%比例100×青链霉素混合液配制而成；当培养皿中的细胞铺满整个培养皿时，弃去细胞培养上清液，用1×PBS清洗2次，加入0.25%的胰酶（含0.02% EDTA）消化，待细胞变圆加入培养基终止消化并收集细胞悬液至10 mL离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃去上清液加入培养基重悬细胞；将细胞悬液按照1∶3的比例分配至准备好的培养皿中，做好标记，将细胞置于培养箱中。

1.2.3 HCGC细胞活力的检测

1.2.3.1 细胞分组及处理

试验分为空白组（生理盐水组）及各受试样品4个不同浓度组（2、4、8、10 μg/mL）铺板（每个剂量设置5个平行孔）：

根据试验需要对细胞铺96孔板，与细胞传代方法相同，将细胞根据试验需要进行稀释，使用血球计数板计数，每孔约2×10⁴个细胞，均匀的铺到细胞培养板中，做好标记，放置培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，换液为含有不同药物的培养基，24 h后进行CCK8检测细胞存活率。

1.2.3.2 CCK8检测

将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100 μL；每孔加入10 μL CCK8试剂，置于培养箱中孵育2 h；酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光值。

按照下列公式计算细胞存活率^［12］：

细胞存活率（%）=\frac{\mathrm{试验}\mathrm{组细}\mathrm{胞吸}\mathrm{光值}}{\mathrm{对照}\mathrm{组细}\mathrm{胞吸}\mathrm{光值}}×100%

1.2.4 HCGC细胞氯离子通道的检测

1.2.4.1 细胞分组及处理

试验分为空白组（生理盐水组）、阳性药组（戊巴比妥钠，10 mmol/L）及各受试样品3个不同浓度组（2、4、8 μg/mL）；根据实验需要对细胞铺96孔板，与细胞传代方法相同，将细胞根据实验需要进行稀释，每皿约1.5×10⁴个细胞，均匀的铺到细胞培养板中，做好标记，放置培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，孵育探针，过夜，次日进行氯离子通道检测。

1.2.4.2 氯离子通道的测定

根据West和Molloy的试验方法^［17］，用MQAE荧光探针的方法检测HCGC细胞内氯离子内流。细胞用含有MQAE（终浓度为10 mmol/L）的培养液中在37 ℃水浴中孵育过夜，孵育过程轻轻振摇。孵育完成后将细胞用含或不含氯离子的缓冲液清洗3次，再用细胞计数器计数，细胞密度约为1.5×10⁴个细胞/mL；细胞经过各受试样品不同药物浓度处理5 min后取20 μL于96孔荧光酶标板中，而后加入180 μL含或不含氯离子的缓冲液，在激发波长320 nm和发射波长460 nm的条件下检测荧光值，用相对荧光值（relative fluorescence，F₀/F）进行统计学分析，其中F₀为不含氯离子条件下测量的荧光值，F为待测品测量的荧光值。

1.3 数据处理

所有数据均用SPSS 18统计软件进行统计，所得数据以\overline{x}±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示组间差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 辣木籽油化学组成

段琼芬等采用超临界萃取法制得的辣木籽油得率为36.1%，采用GC-MS鉴定辣木籽油中油酸含量达65.63%^［18］。刘阳等人采用石油醚浸提法制得辣木籽油，出油率为33.75%，其中GC-MS鉴定发现油酸含量高达89.08%^［19］。本试验采用冷法压榨制得的辣木籽油得率为28%，与已发表的文献相比含量略低，油酸含量较为接近，这可能与所用提取方法、辣木籽的品种、产地不同而产生的差异。后期会收集不同产地的辣木籽，采用不同的提取方法对所制得的辣木籽油化学组成进行系统的研究。

2.2 辣木籽油对HCGC细胞活力的影响

如图1所示：与空白对照组（生理盐水）比较，各受试样品处理组对细胞存活率均无明显影响（P>0.05）。即各受试样品在10 μg/mL浓度以下对细胞安全无毒害作用。

2.3 辣木籽油对HCGC细胞氯离子通道的影响

如图2所示：与空白对照组（生理盐水）比较，辣木籽油（4、8 μg/mL）、油酸（4、8 μg/mL）、β-谷甾醇（8 μg/mL）及豆甾醇（4、8 μg/mL）对HCGC细胞以剂量依赖方式激活氯离子通道，且具有统计学差异（P<0.05）。此外，阳性药PENT（10 mmol/L）亦可激活HCGC细胞的氯离子通道，并具有统计学差异（P<0.01）。Yan等^［20］通过从7 d SD大鼠小脑中分离获取小脑颗粒细胞并进行原代培养，而后采用MQAE荧光探针检测荷叶生物碱（0.05、0.1、0.2 g/mL）对小脑颗粒细胞氯离子通道的影响，发现荷叶生物碱以剂量依赖型的方式开放小脑颗粒细胞的氯离子通道，5 mmol/L PENT亦能激活氯离子通道。Kwon等^［21］通过从8 d SD大鼠小脑中分离获取小脑颗粒细胞并进行原代培养，而后采用MQAE荧光探针检测紫苏乙醇提取物（0.1、1、10 μg/mL），发现紫苏乙醇提取物以剂量依赖型的方式开放小脑颗粒细胞的氯离子通道，10 μmol/L （μmol/L） PENT同样能激活氯离子通道。

本试验表明，辣木籽油及其主要活性成分通过激活人小脑颗粒细胞膜上GABA_A受体氯离子通道，且呈现剂量依赖关系，与其他相关文献比较，结果略有差异，这可能与所选取的小脑颗粒细胞种属和培养方式有关。

3 讨论

GABA_A受体作为中枢神经系统中主要的抑制性受体，其受体上分布有很多药物结合位点，其中GABA位点激动剂如GABA、THIP与GABA_A受体结合后，氯离子通道的开放次数和时间增加，进而产生中枢抑制作用。反之，GABA_A受体拮抗剂能够关闭氯离子通道而阻断GABA_A受体作用^［22］。

目前，检测GABA_A受体氯离子通道开放的方法主要有：同位素标记的³⁶Cl^-离子、膜片钳技术检测法、荧光探针检测法。然而，³⁶Cl^-离子为低比度放射性元素会破坏环境且敏感性低；膜片钳技术是离子通道检测的金标准，这种技术相当耗费人力、需要高技能专业人员操作且需要体积大的细胞^［23］。相比以上两种方法，氯离子荧光探针（MQAE）具有敏感性较强、对细胞选择性没有限制、成本较低及数据通量高等优点。因此，本试验选择用MQAE荧光探针指示剂检测氯离子流动情况。相关文献表明，一些植物提取物可通过调节GABA_A受体氯离子通道发挥镇静催眠作用^［24-25］。

有文献报道指出^［26］，同市售常见食用油（花生油、棕榈油、葵花籽、油芝麻油、黄豆油等）相比，辣木籽油所含的脂肪酸主要以不饱和脂肪酸为主，且比它们含量高。此外，辣木籽油中还含有植物固醇物质如β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等，其含量不亚于橄榄油^［26］。本次研究发现，辣木籽油等各受试样品在10 μg/mL浓度以下对细胞安全无毒害作用，且可以通过激活GABA_A受体细胞膜氯离子通道，进而发挥发挥中枢抑制作用，这可能与其所含的一些单体活性物质如β-谷甾醇、豆甾醇及油酸等有一定关系，后期会对辣木籽油及其主要活性成分联合GABA_A受体拮抗剂和GABA_A受体拮抗剂对氯离子通道的影响进行体外改善睡眠机制的更深入探究。

4 结论

综上所述，本试验以冷榨法制得的辣木籽油为试验材料，通过建立GABA_A受体的种类和数量高表达的人小脑颗粒细胞神经元模型，利用MQAE荧光探针法检测氯离子流动情况，结果发现辣木籽油及其主要活性成分能够激活人小脑颗粒细胞神经元GABA_A受体细胞膜氯离子通道，与阳性药PENT作用效果一致，体外初步阐明了辣木籽油改善睡眠的作用机制，其可以作为一种膳食补充剂在改善睡眠功能食品开发方面具有较好的前景。

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基金资助

云南省省校教育合作共建重点项目（曲靖师范学院-中国农业大学云南高原特色水果深加工新产品研发与成果转化平台建设）