添加芦荟汁对红葡萄酒发酵的影响

Effects of adding aloe juice on red wine fermentation

摘要

目的 在葡萄酒发酵中用木立芦荟（Aloe arborescens）汁（AJ）替代二氧化硫（SO₂），提高葡萄酒的饮用安全性。 方法 在赤霞珠葡萄酒自然发酵（SF）和接种发酵（IF）前，分别添加80 g/L AJ与60 mg/L SO₂。测定发酵过程中的还原糖、乙醇、乙酸、总酸、高级醇和酯类化合物含量以及发酵终点的色度、褐变度和感官质量。 结果 AJ和SO₂对SF的影响要大于对IF的影响，两者均减慢SF耗糖和产乙醇，提高SF和IF的乙醇产量、总酸度、感官质量以及IF异丁醇产量，降低SF和IF的残糖量，几乎不影响SF正丙醇和异丁醇产量以及SF和IF的正丁醇、正己醇和酯产量。与SO₂不同的是，AJ促进早期IF耗糖和产乙醇，降低SF和IF的葡萄酒色度和褐变度以及SF的异戊醇和2-苯乙醇产量，提高SF和IF的乙酸产量以及IF的正丙醇产量。 结论 添加AJ对葡萄酒发酵和质量虽然存在一些不利影响，但总效果与添加SO₂相近，在环境友好和食品安全性等方面看，AJ具有完全或部分取代SO₂的潜力。

Abstract

Objective To replace SO₂ in wine fermentation in order to improve the safety of wine. Method The 80 g/L Aloe arborescens juice (AJ) and 60 mg/L SO₂ were added before the spontaneous fermentation (SF) and the inoculated fermentation (IF) of Cabernet Sauvignon wine,respectively.The content of reducing sugars, ethanol, acetic acid, total acid, higher alcohol, ester compounds were determined in the fermentation process.The chromaticity,browning degree and sensory quality were detected at the end of fermentation. Result The adding AJ and adding SO₂ affected SF generally greater than IF.Both AJ and SO₂ slowed down sugar consumption and ethanol production of SF, increased isobutanol production of IF as well as ethanol production, total acidity and sensory quality of both SF and IF, decreased residual sugar content of both SF and IF, and hardly affected the production of n-propanol and isobutanol of SF, the production of n-butanol,n-hexanol and ester of both SF and IF.AJ promoted the early sugar consumption and ethanol production of IF, reduced the color intensity and browning degrees of wine, and the production of isoamyl alcohol and 2-phenylethanol of SF, and increased the production of n-propanol of IF and acetic acid of both SF and IF, unlike SO₂. Conclusion Adding AJ had favorable and individual unfavorable effects on the fermentation and quality of wine, but had the comprehensive effect similar with adding SO₂. Therefore, adding AJ had the potential to replace SO₂ completely or partially.

Graphical abstract

关键词

木立芦荟汁 / 二氧化硫 / 红葡萄酒发酵 / 挥发性化合物

Key words

Aloe arborescens juice / sulfur dioxide / red wine fermentation / volatile compounds

在葡萄酒生产中，SO₂能抑制不利于葡萄酒发酵的微生物生长，有助于浸提色素和稳定葡萄酒色泽，还能防止葡萄酒微生物腐败和氧化。然而，如果SO₂用量超标不仅伤害人体健康，还会给酒带来刺激性气味，因此，SO₂用量有严格限制标准^［1］。目前有关SO₂替代品的研究已有诸多报道，如：二碳酸二甲酯^［2］、胶体银^［1］、酚类物质^［3］、山梨酸钾和杨梅酮组合^［4］，以及一些天然替代品，如黑萝卜提取物^［5］、壳聚糖^［6］、那他霉素^［7］、溶菌酶^［4］和细菌素^［8］等，其中的天然替代品因环境友好和食用安全而备受关注。

芦荟具有较好的抗氧化、抗菌活性和食用安全性，它在食品和医药领域应用广泛且历史悠久^［9-10］。库拉索芦荟（Aloe vera）和木立芦荟（Aloe arborescens）的种植、研究和应用甚广。A.vera和A.arborescens的抗菌谱宽、活性高，对多种细菌、真菌及病原菌均有抑制作用，在防止果蔬采后腐烂和维持质量、抗氧化等方面表现出积极作用^［11-15］。用芦荟叶肉凝胶作为涂膜直接作用于鲜食葡萄和草莓等果蔬表面，对防止腐烂和抗真菌效果良好，且A.arborescens比A.vera效果更好^［11-15］。已有用芦荟叶加糖发酵成芦荟酒，把芦荟凝胶汁加到成品葡萄酒中制成芦荟葡萄酒等的报道^［9-10］，如马雷^［16］将20、50和80 g/L的A.arborescens汁应用于红葡萄酒发酵，发现80 g/L的芦荟汁对发酵早期的酵母和整个发酵过程的细菌和霉菌表现出较好的抑制作用，并使糖消耗最慢。这些研究主要是为了发挥芦荟活性成分的食用效果，但目前尚无在葡萄酒发酵系统中利用A.arborescens汁替代SO₂的报道。为了有效抑制不良微生物，避免发酵迟缓，本课题组尝试在葡萄酒自然发酵（SF）和接种发酵（IF）中添加80 g/L木立芦荟汁和60 mg/L SO₂进行比较研究，通过比较发酵过程中主要成分变化以及葡萄酒品质的差异，评价木立芦荟汁在葡萄酒发酵中替代SO₂的可能性。本研究对提高葡萄酒的安全性以及开辟芦荟的新应用途径具有意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

葡萄：河北昌黎采摘的赤霞珠葡萄；木立芦荟：本实验室盆栽约5 a的木立芦荟；活性干酵母：Zymaflore ST，法国J.lafford & Cie产品。试验用化学试剂分别为化学纯、分析纯及色谱纯化学试剂。

1.2 试验仪器

精密pH计（PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司，中国）；分光光度计（722S型，上海精密科学仪器有限公司，中国）；静态顶空气相色谱仪（Agilent6850 HS-GC，安捷伦科技有限公司，美国）；顶空取样注射器（安捷伦7697A，安捷伦科技有限公司，美国），色谱柱（DB-FFAP，30 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷伦科技有限公司，美国）；离心机（HITACHI CR21 GⅢ，日本日立工机株式会社，日本）；生化培养箱（SHP-350，上海精宏实验设备有限公司，中国）。

1.3 发酵

1.3.1 木立芦荟汁制备

将新鲜芦荟叶片用自来水冲洗，于室温自然晾干。用刀划开绿色外皮，分离出内部无色的软细胞组织，并经组织捣碎机捣碎成芦荟汁（AJ）。

1.3.2 活性干酵母活化

将2 g活性干酵母溶解在10 mL无菌水中，于40 °C保温15 min，每5 min温和搅拌一次。在其中补加10 mL葡萄汁，于25 °C再保温1 h，每30 min温和搅拌一次，即得活性酵母培养物。

1.3.3 葡萄酒发酵

将完好的鲜葡萄去梗破碎后，均匀分装于1 000 mL锥形瓶，每瓶装450 mL葡萄浆。发酵分为不接种的自发发酵（SF）和添加2 mL/L活性酵母培养物的接种发酵（IF）。两组发酵分别添加亚硫酸、AJ和无菌水（对照），3种添加的总体积相等，使SO₂终浓度为60 mg/L 和AJ终浓度80 g/L。用棉塞封口，在15~18 °C静态发酵，发酵48 h后换成发酵栓，期间每天两次手动摇匀30 s，定期混匀取样测量^［16］。

1.4 测定方法

将发酵样品在4 ℃、11 000 g离心10 min，得到的上清液用去离子水稀释后用于理化分析。

总酸度（以酒石酸计）用滴定法测定^［16］；pH值用pH计测定^［16］；还原糖采用3，5-二硝基水杨酸法检测^［17］。将用去离子水稀释10倍的样品在1 cm比色皿中于420、520和620 nm波长测定的吸光度A_420nm、A_520nm和A_620nm^［18］，A_420nm为褐变度^［19］。

采用气相色谱外标法测定样品的挥发性成分，以含量较高的乙酸乙酯、乙醇、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、正丁醇、戊醇、已酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、乙酸和2-苯基乙醇（按色谱出峰顺序）为被测目标化合物。将2 μL固相微萃取的样品注入250 °C的进样室。FID检测器温度250 °C。N₂为载气，柱压0.05 MPa，流量10 mL/min，空气流量为300 mL/min，H₂为30 mL/min。分流比为10∶1。色谱柱在40 °C维持5 min，以5 °C/min升到190 °C，保温1 min，再以20 °C/min升温至230 °C，维持2 min^［17］。

1.5 感官品评

由受过培训的8 人对发酵结束后的葡萄酒进行初步感官品评，品评标准见表1，各项得分之和为感官评价总分。

1.6 统计分析

所有的发酵和测量都平行试验3次，测定结果为3个独立试验的平均值±标准差。采用IBM SPSS17.0统计软件，通过方差分析（ANOVA）确定数据差异显著性，显著水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 添加芦荟汁对葡萄酒发酵过程中还原糖含量的影响

由表2可见，IF比SF过程的还原糖含量下降快且终残糖含量高。SF组添加AJ和添SO₂的还原糖含量下降比对照慢，IF组添加AJ比添加SO₂和对照下降更快，最终残留还原糖含量呈对照、添加AJ和添加SO₂顺序降低。IF组比SF组添加AJ和添加SO₂的残留还原糖含量差异更显著。结果表明，接种酵母虽然促进早期耗糖，但并不增加总耗糖量。添加SO₂减缓SF和IF初期耗糖，添加AJ对减缓SF耗糖和促进IF耗糖都比添加SO₂强。添加AJ和添加SO₂促进后期耗糖。

2.2 添加芦荟汁对葡萄酒发酵过程中乙醇含量的影响

由图1可见，在整个发酵过程中，IF普遍比SF的乙醇含量高，添加AJ的SF早期以及添加SO₂的SF和IF的早期乙醇含量都较低。SF组对照、添加AJ、添加SO₂的最终乙醇含量分别为（107.00±0.03）、（115.57±0.12）、（109.00±0.05）g/L，IF组相应的最终乙醇含量分别为（108.00±0.43）、（118.00±0.12）、（110.00±0.07）g/L，差异显著。结果表明，添加AJ显著抑制SF早期产乙醇，促进SF后期和几乎IF整个过程产乙醇；而添加SO₂显著抑制SF和IF早期产乙醇，促进后期产乙醇。接种酵母显著促进整个发酵过程产乙醇，比添加AJ和添加SO₂的促进作用大。此外，添加AJ比添加SO₂能更大地提高乙醇产量。

2.3 添加芦荟汁对葡萄酒发酵过程中乙酸含量的影响

如图2所示，在IF和SF过程中，添加AJ普遍比对照的乙酸含量高，而添加SO₂普遍比对照的醋酸含量低，IF比SF对应组的乙酸含量低。发酵结束的葡萄酒挥发酸含量也有相似规律，SF显著高于IF的对应组，添加AJ均显著高于添加SO₂和对照。结果表明，接种酵母菌和添加SO₂能降低乙酸产量和挥发酸度，而添加AJ可显著提高乙酸产量和挥发酸度。

2.4 添加芦荟汁对葡萄酒发酵过程中总酸度的影响

由图3可见，在IF早期和SF中期，添加SO₂和添加AJ的总酸均较对照低，而在SF后期和IF中期和后期，添加SO₂和添加AJ的总酸均较对照高。SF后期的总酸显著低于初始值以及IF组。结果表明，添加SO₂和添加AJ显著抑制IF早期和SF中期总酸升高，显著提高SF后期和IF中期和后期总酸度，接种酵母菌能提高总酸度。

2.5 添加芦荟汁对葡萄酒发酵高级醇含量的影响

由表3可知，由SF和IF所得酒中正丙醇、异丁醇和异戊醇含量远高于正丁醇、正己醇和2-苯基乙醇含量。与SF相比，IF高级醇含量增加较快，异丁醇和异戊醇含量较高，而正丙醇、正丁醇、正己醇和2-苯基乙醇含量较低。对于对照的正丙醇、正丁醇和2-苯基乙醇含量，添加SO₂组的异丁醇、正丁醇和2-苯基乙醇含量，添加AJ组除正己醇外的高级醇含量，在SF和IF之间均存在显著差异。对SF，添加SO₂显著提高异戊醇和2-苯乙醇的产量，添加AJ显著降低异戊醇和2-苯乙醇的产量。除SF的异戊醇、2-苯基乙醇外，其他高级醇含量在对照和添加组之间无显著差异。此外，对SF的正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇含量，在添加AJ与添加SO₂之间差异显著。各组的正己醇含量均无差异。

结果表明，接种酵母加快生成所有高级醇，提高异丁醇和异戊醇的产量，显著抑制生成正丙醇、正丁醇、正己醇和2-苯基乙醇。添加AJ和添加SO₂同样不影响IF高级醇产量，但对SF高级醇产量影响较大，且两添加组之间差异较大，尤其对正丙醇和异丁醇产量影响较大（P<0.05）。正己醇产量不受接种酵母、添加AJ和添加SO₂的影响，而正丁醇产量受接种酵母影响，但不受添加AJ与添加SO₂影响。

2.6 添加芦荟汁对葡萄酒发酵酯类化合物含量的影响

由表3可知，IF组所得酒中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯含量分别高于SF组，而乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量分别低于SF组。虽然在发酵过程中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯和辛酸乙酯含量在添加组与对照之间偶有差异，但发酵结束检出的所有酯含量在添加组与对照之间无显著差异。除了添加SO₂组的乙酸异戊酯和辛酸乙酯，检出的所有酯含量在SF和IF之间始终差异显著；除了SF组的乙酸乙酯含量，检出的所有酯含量在添加AJ和添加SO₂之间无显著差异。未检测到乳酸乙酯、苯乙酸乙酯以及琥珀酸二乙酯。

结果表明，接种酵母对酯类化合物产量的影响大于添加AJ和添加SO₂，可显著促进产丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，抑制产乙酸乙酯和乙酸异戊酯；而添加AJ和添加SO₂几乎不影响最终酒的酯含量（乙酸乙酯除外）。乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量占比首居一二，且SF比IF的含量高，添加AJ比添加SO₂的含量高。

2.7 添加芦荟汁对葡萄酒发酵色度、褐变度及感官质量的影响

SF组的葡萄酒色度无显著差异，而IF组的色度差异较大，依添加SO₂、对照和添加芦荟而降低，对照和添加SO₂的葡萄酒色度在SF和IF之间无差异，而SF添加芦荟汁的葡萄酒色度低于IF组（表3）。无论是SF还是IF的葡萄酒褐变度，添加SO₂与对照无显著差异，且均高于添加AJ；IF组添加AJ和添加SO₂的褐变度均高于SF组（表3）。褐变度是葡萄酒中花色苷、单宁及多酚化合物氧化程度的体现，结果表明，添加AJ比添加SO₂对氧化的抑制作用更大，IF比SF的氧化作用更大。感官评价可知，添加AJ比对照和添加SO₂发酵的葡萄酒的口感更清新、爽口、苦味更少，总体质量与添加SO₂发酵的葡萄酒感官质量相近，甚至略好（表4）。

3 讨论

添加AJ和添加SO₂的SF早期耗糖较慢，可能与AJ或SO₂对内源微生物的抑制有关^［16］。添加AJ的IF耗糖较快较多，可能归因于AJ促进了内源和外源酵母生长和代谢，产生更多的乙醇和乙酸。接种酵母菌和添加SO₂可能较强地抑制产乙酸微生物的生长和代谢，从而降低乙酸产量和挥发性酸度，而添加AJ则作用相反。

总酸和pH值主要取决于葡萄酒中来源于酿酒葡萄或发酵的有机酸，包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸以及丙酮酸、琥珀酸、乳酸和乙酸^［20-21］，以及不同有机酸的浓度和解离特性。在发酵过程中，微生物糖代谢产生的有机酸使总酸提高，而酿酒葡萄中有机酸的降解或利用以及发酵过程中酒石酸的沉淀会引起总酸降低。A.vera制品对肠道菌群的有利影响可能与降低酵母量和pH以及促进乳酸菌生长有关^［22-23］。本研究接种酵母菌通过促进代谢而提高有机酸产量并相应降低pH值。添加AJ组的总酸度和pH值较高，可能也有类似的菌群调节作用，生成较多解离常数较小的酸（如乙酸和乳酸），但尚需进一步试验证明。

高级醇是发酵形成的重要的葡萄酒次级代谢成分。异戊醇、异丁醇和正丙醇在低浓度时会赋予葡萄酒丰富的感官品质，但较高浓度会使酒的刺激性较强且令人不愉快^［24］。虽然本研究的正丙醇、异丁醇和异戊醇含量较高，但各组的高级醇总含量均低于300 mg/L^［24］，有利于葡萄酒感官品质的提高。添加AJ组的乙酸和乙酸乙酯产量高于添加SO₂组。SF的酯生成量大于100 mg/L，可能对香气有不良影响^［25］。

色度是葡萄酒感官品质的重要指标。色素的稳定性和反应性受氧气、二氧化硫、乙醛、pH、色素和辅色素浓度等因素的影响。在葡萄酒发酵过程中，花青素形成相对稳定的聚合色素，发酵产生的乙醇和各种有机酸促进花青素浸出，并伴有乙醛辅色作用，从而增强色度^［19］。乙醇对色素的凝集作用会大幅降低葡萄酒色度^［26］。本研究的IF比SF的代谢更活跃，促进了花青素的浸出，且pH值较低，使IF的葡萄酒色度高于SF组。添加AJ比添加SO₂的色度低可能归因于SO₂有利于色素提取^［6］，添加AJ的pH值较高以及AJ中一些化合物可能与花青素结合。

对赤霞珠和Mourvèdre红葡萄酒发酵，与添加SO₂相比，添加SO₂替代品AAP（由黑萝卜和蔬菜提取物构成）发酵的乙醇含量较高^［6］，与本研究结果相反，而挥发酸较低^［6］，与本研究结果相似。添加胶体银比添加SO₂的色度低^［1］，与本研究结果相似。尽管添加胶体银发酵的红葡萄酒中色素含量较低，白葡萄酒的氧化作用较强，但与添加SO₂发酵的葡萄酒的化学和感官特征相似^［1］；添加AAP与添加SO₂发酵的红葡萄酒抗氧化活性和挥发酸度相似，可以降低SO₂添加量改善葡萄酒的感官^［6］。本研究添加AJ和添加SO₂发酵的葡萄酒感官质量相近，也与相关研究的结果相似。

虽然本研究结果是在选定的芦荟品种、酿酒葡萄品种、酵母品种以及技术条件下进行的，但研究结果为芦荟在葡萄酒中的应用提供了基础数据，具有重要的参考价值。芦荟叶片含水量高，在酿酒环境下的用量较大，可以考虑使用芦荟提取液或浓缩液，用法和用量还需要进一步探索。今后还应就芦荟制品对酿酒葡萄中分离的不同内源微生物的抗菌活性进行深入研究。

4 结论

1） 在赤霞珠红葡萄酒发酵过程中添加AJ（80 g/L）和添加SO₂（60 mg/L）同样减慢SF耗糖和产乙醇，提高乙醇产量、总酸度、感官质量以及IF异丁醇产量，降低残糖含量，但几乎不影响正丁醇、正己醇和酯产量以及SF正丙醇和异丁醇产量。

2） 添加AJ促进早期IF耗糖和产乙醇，降低葡萄酒的色度和褐变度以及SF的异戊醇和2-苯乙醇产量，提高乙酸产量以及IF的正丙醇产量，而添加SO₂作用恰好相反。

3） 添加AJ对葡萄酒发酵和质量虽存在一些不利影响，但总效果与添加SO₂相近，因此，AJ具有完全或部分取代SO₂的潜力。

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基金资助

辽宁省教育厅创新团队项目(2016J002)

大连市星火计划项目(2013B11NC078)