不同品种苜蓿总黄酮对奶牛体外瘤胃发酵和饲料降解率的影响

Effects of total flavonoids from different alfalfa varieties on in vitro rumen fermentation of dairy cows and feed degradation rate

摘要

目的 探究苜蓿总黄酮对奶牛体外瘤胃发酵和底物干物质降解率的影响。 方法 采用体外产气法，通过一种苜蓿总黄酮不同梯度对瘤胃发酵和底物干物质降解率的影响确定适宜的添加剂量，分别将6种不同品种苜蓿总黄酮（S1~S6）按适宜剂量添加至0.5 g TMR中，加入75 mL的微生物培养液，置于恒温培养箱（39 ℃）中培养24 h，并记录0、2、4、6、9、12、24 h时间点的产气量。发酵结束后，测定发酵液中pH、NH₃-N、VFA、氧化还原电位以及底物干物质降解率。 结果 不同比例苜蓿总黄酮的发酵液中，在24 h时产气量，0.4%、0.6%和0.8%组的产气量显著大于1%、1.2%组和对照组（P<0.05）；氧化还原电位在0.8%组时，显著大于其他组（P<0.05）；TVFA在0.8%组时，显著大于其他实验组和对照组（P<0.05）；乙酸在0.8%组时，显著大于其他试验组和对照组（P<0.05）。2）不同品种苜蓿总黄酮发酵液中，24 h时的产气量与降解率无显著差异（P>0.05）；对照组中的NH₃-N显著高于试验组（P<0.05）；S6、S5、S3组中的还原电位显著高于S₂、S₁和对照组（P<0.05）；S₃组的发酵液中总挥发性脂肪酸和乙酸浓度显著高于其他组（P<0.05），S₃组的发酵液中丙酸浓度显著高于其他组（P<0.05）。 结论 不同品种苜蓿总黄酮对奶牛体外瘤胃发酵和饲料降解率的影响存在显著差异，其中S₃品种苜蓿总黄酮效果最佳，为后续作为奶牛饲料配方中添加剂的筛选提供理论参考。

Abstract

Objective This experiment was conducted to investigate the effects of total flavonoids in alfalfa on in vitro rumen fermentation of dairy cows and on the rate of substrate dry matter degradation. Method The method of gas production inv vitro was used to determine the appropriate dosage of total flavonoid addition by measuring the effects of different amounts of alfalfa total flavonoids on rumen fermentation and substrate dry matter degradation rate.The total flavonoids of six alfalfa varieties(S1-S6) were added into 0.5 g TMR at the appropriate dosage, followed by adding 75 mL microbial culture medium. The gas production was recorded at 0, 2, 4, 6, 9, 12 and 24 h after incubation at 39 ℃ for 24 h. After the fermentation, the pH, NH₃-N, VFA, REDOX potential, and degradation rate of substrate dry matter in fermentation broth were determined. Result In fermentation broth with different proportions of alfalfa total flavonoids, the gas production at 24 h was significantly higher in 0.4%,0.6% and 0.8% groups than in 1%,1.2% groups and the control group (P<0.05).The REDOX potential,TVFA and Acetic acid in the group of 0.8% were significantly higher than that of other groups (P<0.05).There was no significant difference in gas production and degradation rate at 24 h in fermentation broth among different total-flavonoid addition treatments of different alfalfa varieties(P<0.05).The NH₃-N in control group was significantly higher than that in experimental groups (P<0.05).The reduction potential in S6,S5 and S3 groups was significantly higher than that in S2,S1 and control groups(P<0.05).The concentrations of total volatile fatty acids and acetic acid in fermentation broth of S3 group were significantly higher than those of other groups (P<0.05),and propionic acid concentration in fermentation broth of S3 group was significantly higher than that of other groups P<0.05). Conclusion There were significant differences in the effects of alfalfa flavones on in vitro rumen fermentation of dairy cows and on feed degradation rate among different varieties, which was the best for S3 alfalfa, providing theoretical reference for the subsequent screening of alfalfa flavones as feed additives for dairy cows.

关键词

苜蓿总黄酮 / 体外发酵 / 品种 / 饲料降解率

Key words

alfalfa total flavonoids / in vitro fermentation / varieties / feed degradation rate

近年来，植物提取物作为一类新型绿色的抗生素替代品成为研究的热点，植物提取物中的黄酮、多糖、生物碱、有机酸等多种活性物质^［1］，能够对动物机体产生抗炎、抗氧化、提高饲料转化率、改善免疫平衡、调节营养平衡等积极的生理功能^［2］。其中，黄酮类是植物中含量相对较高，且结构最为稳定的一类营养活性物质，具有抗菌、抗氧化及免疫调节等生理功能^［3］。

紫花苜蓿作为反刍动物优质的蛋白饲料，除常规营养成分外，优质苜蓿中总黄酮含量可达到10.351 mg/g^［4］，其主要的黄酮化合物可分为苷类、异黄酮类、异黄烷等^［5］。有研究表明，奶牛干物质采食量会随着苜蓿黄酮添加量升高而升高，可以有效地提高奶牛机体抗氧化能力，减少瘤胃甲烷排放，且不会影响瘤胃发酵特性^［6］，抑制淋巴细胞凋亡，完善非特异性免疫^［7］，还能增加瘤胃细菌门和属的数量，提高细菌的丰富度和多样性^［8］。因此，苜蓿黄酮在维持反刍动物机体健康及提高机体免疫有广阔的应用前景。臧清波^［9］通过对233份苜蓿中黄酮类化合物进行了测定和评价，发现不同苜蓿之间黄酮类化合物存在显著差异。因此本试验采用体外产气法研究不同品种苜蓿总黄酮对瘤胃体外发酵产气量、发酵液的影响，揭示不同品种苜蓿总黄酮之间的差异，为后续作为奶牛饲料配方中添加剂的筛选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苜蓿来源：6个品种苜蓿均来自正道生态集团小汤山种植基地。

发酵底物：选用北京市某奶牛场泌乳奶牛的TMR（精粗比为4∶6），将TMR烘干粉碎过40目筛，底物组成及营养水平如表 1。

瘤胃液采集：选取3头体况相近、胎次和泌乳期相同荷斯坦奶牛，饲前2 h通过口腔采取其瘤胃液，装入保温瓶中，并迅速带回实验室用纱布（4层）过滤待用。

人工唾液：采用Menke^［10］的方法进行配制，如下：先将蒸馏水（1 000 mL）倒入玻璃瓶中，然后依次加入微量元素溶液（0.25 mL）、 碳酸盐缓冲液（500 mL）、磷酸盐缓冲液（500 mL）、刃天青（2.5 mL），摇匀加热至39 ℃后，再次加入现配的还原液（100 mL），继续混匀，并通入CO₂、待溶液褪色或颜色变浅后，停止通入CO₂，待用。

微生物培养液：将瘤胃液与人工唾液按1∶2的体积比混合，摇匀。

1.2 试验方法

1.2.1 苜蓿总黄酮的提取

参考潘予琮^［4］的提取条件，采用乙醇超声提取法，取1 g苜蓿粉末，加入30 mL 80%的乙醇溶液，超声提取35 min，将提取液用真空冷冻干燥器进行浓缩干燥，制成固体备用。

1.2.2 体外发酵添加量的筛选

依据实验室前期研究，选取一种总黄酮提取率最高的苜蓿黄酮（WL363HQ）设置不同比例（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%）来确定体外发酵最优添加比例，分别将不同比例的苜蓿总黄酮添加到0.5 g TMR中，加入75 mL的微生物培养液，置于恒温培养箱（39 ℃）中培养24 h，每组3个重复。

1.2.3 不同品种苜蓿对瘤胃体外发酵的影响

分别将S1~S6 6种不同品种苜蓿总黄酮（WL298HQ、WL363HQ、WL366HQ、国产苜蓿、WL440HQ、WL525HQ）按上述确定最优比例添加至0.5 g TMR中，加入75 mL的微生物培养液，置于恒温培养箱（39 ℃）中培养24 h，每组3个重复。

1.3 测定指标和方法

体外GP（产气量）：通过AGRS-Ⅱ微生物发酵微量产气自动记录仪记录各时间点的GP。

产气参数计算：根据McDonald^［11］的产气模型计算样品在培养2、4、6、9、12、24 h时间点的动力参数。

pH的测定：通过METTLR TOLEDO pH仪进行测定。

氧化还原电位测定：通过METTLR TOLEDO氧化还原电位仪进行测定。

VFA的测定：取5 mL 瘤胃发酵液于10 000×g 离心 10 min，然后取3 mL上清液并加入 0.3 mL偏磷酸溶液（25%），摇匀后静置30 min，在10 000×g离心10 min，取1.5 mL上清液置于测样瓶中采用安捷伦7890B型号气相色谱仪测定。

NH₃-N的测定：取5 mL瘤胃发酵液于离心管中，通过12 000×g 离心 20 min后取上清液 40 μL，加入苯酚显色试剂2.5 mL，摇匀，再加入次氯酸盐试剂2.0 mL，再次摇匀，水浴（37 ℃） 30 min，于 550 nm 波长处测定吸光值，计算浓度。

1.4 统计分析

通过Excel统计整理数据后，采用IBM SPSS 22.0软件中ANOVA对数据进行单因素方差分析，采用Tukey法进行多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 苜蓿黄酮体外发酵添加剂量的筛选

2.1.1 体外产气参数及降解率

由表2可知，在快速产气部分a值中，苜蓿总黄酮添加比例为0.6 % 时，显著高于添加1.2 % 组（P <0.05），与其他组无显著差异，在1.2 %组时，快速产气部分a值为负值，其余均为正值；在缓慢产气速度常数c值中，添加1.2 % 组显著高于其他组（P<0.05）；在潜在产气量（a+b）值中，0组、0.4 % 组、0.6 % 组、0.8 % 组显著高于1.2 % 组（P<0.05），其他组无显著差异；在24 h时，0.4 %、0.6 %和0.8 %组的产气量显著大于1 %、1.2 %组和对照组（P<0.05）。缓慢产气部分b值和降解率无显著差异（P>0.05）。

2.1.2 NH₃-N、氧化还原电位及pH的测定

如表3所示，在不同比例苜蓿总黄酮发酵后的瘤胃液中，试验组中的NH₃-N含量极显著高于空白组（P<0.05），但试验组中NH₃-N含量没有显著差异。发酵后瘤胃液的氧化还原电位呈先上升后下降的趋势，当比例为0.8%组时，还原电位达到了最大值，为271 mV，其显著高于1.2%、1%、0.4%、0.2%组和对照组的电位值（P<0.05），0.4%、1%、1.2%组还原电位值显著高于0.2%和对照组（P<0.05）。底物发酵结束后，pH无显著差异。

2.1.3 VFA 的测定

如表4所示，瘤胃液中总挥发性脂肪酸（TVFA）和乙酸在比例为0.8%时，达到了最大值，分别为114.87 mmol/L和64.43 mmol/L。TVFA在0.8%组时，显著大于0.2%、0.4%、1%、1.2%和对照组（P<0.05），0.4%组显著大于对照组（P<0.05）；乙酸在0.8%组时，显著大于0.2%、0.4%、1%、1.2%和对照组（P<0.05），0.6%组时，显著大于0.2%、1%、1.2%和对照组（P<0.05）；乙丁酸在0.6%、0.8%组时，显著大于其他试验组和对照组（P<0.05）。试验组发酵液中的丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸和乙酸/丙酸均无显著差异（P>0.05）。

以上试验结果表明，苜蓿总黄酮最佳添加比例为0.8% DM。

2.2 不同品种苜蓿总黄酮对瘤胃体外发酵的影响

2.2.1 产气参数及降解率

如表5所示，快速产气部分a值均为负值，说明快速产气部分存在产气滞后、其余均为正值；在慢速产气b中，S6显著高于S2、S1、S4、S5和S0（P<0.05），S2、S3显著高于S5、S4、S1和S0（P<0.05），最高值为63.82 mL；在缓慢产气速度常数c中，S6显著高于其他组（P<0.05），最大值为0.21；在潜在产气量中，S6显著高于S5、S4、S1和S0（P<0.05），S2、S3显著高于S1、S0（P<0.05）；24 h时的产气量与降解率无显著差异（P>0.05）。

2.2.2 NH₃-N、氧化还原电位及pH的测定

如表6所示，不同发酵液中的NH₃-N有明显差异，对照组显著高于S1、S3、S4、S5和S6组（P<0.05），S2、S6显著高于S1、S3、S4和S5组（P<0.05）。氧化还原电位中的“+”表示氧化电位，“-”表示还原电位，S6、S5、S3组显著高于S2、S1和对照组（P<0.05），S4、S1显著高于S2、S0组（P<0.05）。不同发酵液中的pH之间无显著差异（P>0.05）。

2.2.3 VFA的测定

如表7所示，S3组的发酵液中TVFA和乙酸浓度显著高于其他组（P<0.05）；S3组的发酵液中丙酸浓度显著高于其他组（P<0.05）；S0、S1、S2、S3组的发酵液中异丁酸浓度显著高于其他组（P<0.05）；S0、S1、S3组的发酵液中丁酸浓度显著高于其他组（P<0.05）；S0组的发酵液中异戊酸浓度显著高于其他组（P<0.05）；S1组的发酵液中戊酸浓度显著高于其他组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 苜蓿总黄酮体外发酵对体外产气参数及降解率的影响

体外产气参数是体外发酵中一项综合指标，在一定程度上能反映瘤胃对饲料利用的情况及瘤胃微生物的活动趋势，一般来说，产气量等越高瘤胃对饲料的利用率越高，表明瘤胃微生物活性越强^［12］。本试验中，不同比例苜蓿总黄酮对快速产气部分a、缓慢产气常数c、潜在产气量（a+b）及24 h产气量GP₂₄都有显著影响，整体表明，比例为0.4%、0.6%和0.8%时，可以显著提高产气量。因此，添加适量的苜蓿总黄酮可能会降低原虫数量，使体外产气量增加，提高了瘤胃对饲料的利用率。白齐昌^［13］通过研究沙棘黄酮对绵羊体外产气量、pH、VFA等影响，发现沙棘黄酮可以提高瘤胃体外发酵的产气量，结果与本试验相似。不同品种苜蓿总黄酮之间的瘤胃体外产气量存在显著差异，但快速产气部分a值均为负值，说明在体外发酵前期存在着产气滞后，可能是未将发酵瓶中的底物与发酵液混合均匀所造成，从缓慢产气部分b和潜在产气量（a+b）来看，添加苜蓿总黄酮有利于提高发酵时的产气量，且在S₆组时最高（b为63.82 mL，（a+b）为57.83 mL）。干物质降解率可以反映微生物利用饲料的情况^［14］，是饲粮被机体利用程度的重要指标^［15］。在本试验中，不同比例和不同品种苜蓿总黄酮对瘤胃体外发酵中的底物降解率没有显著差异。

3.2 苜蓿总黄酮体外发酵对NH₃-N、氧化还原电位及pH的测定影响

NH₃-N是反映瘤胃内氮平衡及MCP合成的重要指标^［16］。饲料中的可降解蛋白和非蛋白氮通过部分瘤胃微生物的降解作用最终生产NH₃-N，而NH₃-N又可以通过瘤胃微生物的作用合成MCP。NH₃-N的浓度受饲粮结构和微生物的影响较大，当MCP合成速率减慢时，NH₃-N的浓度上升，抑制微生物的生长繁殖，造成氨中毒。有研究表明瘤胃NH₃-N浓度的适宜范围为6.58~36.7 mg/dL^［17］。本试验中，不同比例体外发酵液中的NH₃-N含量显示，试验组显著高于对照组且在正常范围为之内，可能是因为苜蓿总黄铜促进了饲料中非蛋白氮的降解速率^［18］；不同品种苜蓿总黄酮对发酵液中的NH₃-N有显著的影响，对照组显著高于其他试验组，S₂、S₆显著高于其他试验组，说明S₁、S₃、S₄和S₅更有利于MCP的合成，提高瘤胃对日粮的利用率。

氧化还原电位常用于衡量瘤胃内容物中氧化还原能力，其受饲粮类型、采食时间、饲料添加剂影响^［19］。本试验中，氧化还原电位均为负值，则为还原电位，随着不同比例的增加，还原电位呈先上升后下降趋势，在0.8%组时，达到最大值（-271 mV）且试验组显著高于对照组，说明苜蓿总黄酮具有提高还原电位作用，可能与黄酮类具有抗氧化作用有关；在不同品种苜蓿总黄酮发酵液中，S₃、S₅、S₆的还原电位显著高于其他试验组和对照组，则说明这三种苜蓿可能具有较好的抗氧化作用。

瘤胃内pH是瘤胃内环境稳定性的重要的指标之一，受唾液、瘤胃液和饲粮结构等影响^［20］，pH值过高或过低都会影响瘤胃微生物生存环境，从而影响动物的健康。在不同比例试验中，试验组和对照组之间pH没有显著差异，数值均在正常范围内。不同品种苜蓿总黄酮对发酵液pH无显著影响，从整体来看，试验组的pH高于对照组，说明添加苜蓿总黄酮会提高瘤胃液pH，有利于调节奶牛瘤胃内环境稳态。

3.3 苜蓿总黄酮对体外发酵VFA影响

VFA是反刍动物瘤胃日粮中C_m（H₂O ）_n和蛋白质被降解的最终产物，为机体提供70%~80%的能量^［21］。VFA不仅可以反映动物对饲料的利用情况，也具有调节胃肠激素分泌，促进肠道上皮细胞增殖和生长等作用^［22］。在不同比例试验中，TVFA、乙酸、丙酸等均呈现先上升后下降趋势，在0.8%组时，TVFA、乙酸、丙酸浓度均显著大于其他试验组和对照组，表明苜蓿总黄酮最适添加比例为0.8%；不同品种苜蓿总黄酮对发酵液中VFA有显著影响，TVFA和乙酸浓度含量从大到小依次为S₃>S₁>S₂>S₄>S₅>S₀>S₆，则S₃效果较佳。有研究发现，苜蓿中由黄酮、黄酮苷和黄酮醇组成的总黄酮具有强大的抗氧化活性^［23］，因此，不同品种苜蓿总黄酮中所含有的黄酮种类组合不同，可能会对瘤胃微生物造成不同的影响，进而造成发酵液中挥发酸浓度含量有显著差异。在发酵液中，乙酸/丙酸均大于1.6，则说明发酵类型为乙酸发酵，乙酸是反刍动物脂肪合成的主要前体物质，是乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要原料，乙酸转化为乳脂的效率为67%~71%，因此乙酸含量升高利于乳脂率的提高^［24］。栗明月等^［25］添加竹叶总黄酮对奶牛瘤胃体外发酵研究发现其发酵类型也为乙酸发酵类型，与本试验结果相似。由此可见，添加适宜的苜蓿总黄酮可以提高瘤胃微生物对底物的消化利用。

4 结论

1） 通过不同浓度比例试验研究表明，苜蓿总黄酮最佳添加浓度比例为0.8% DM；

2） 通过不同品种苜蓿黄铜提取物试验表明，S3品种苜蓿总黄酮效果更佳，为后续作为奶牛饲料配方中添加剂的筛选提供理论参考。

参考文献

[1] 卢德勋.饲料营养活性物质（nutricines）：一个亟待重新审视的研究领域［J］.饲料工业，2020，41（3）：1-5.

[2] 甘智才，玉永雄.紫花苜蓿中的活性物质及其对畜禽的营养作用［J］.江西饲料，2009（3）：20-25.

[3] Muqier， Qi S， Wang T，et al.Effects of flavonoids from Allium mongolicum Regel on growth performance and growth-related hormones in meat sheep［J］.Animal Nutrition，2017，3（1）：33-38.

[4] 潘予琮.基于指纹图谱技术的苜蓿和燕麦草中黄酮类营养活性物质分析与评价［D］.北京：北京农学院，2021.

[5] 杨蕾.黄酮类化合物在反刍动物营养上的研究进展［J］.家畜生态学报，2019，40（2）：8-12.

[6] 占今舜，苏效双，刘明美，等.日粮中添加苜蓿黄酮对奶牛血液生化指标、抗氧化性能和免疫的影响［J］.中国农业大学学报，2017，22（5）：66-74.

[7] 苏效双，占今舜，詹康，等.苜蓿黄酮对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖与抗氧化的影响［J］.草业学报，2015，24（12）：139-145.

[8] 占今舜.苜蓿黄酮对奶牛生产性能、瘤胃代谢和免疫性能影响的研究［D］.扬州：扬州大学，2017.

[9] 臧清波.233份紫花苜蓿黄酮类化合物及饲用品质评价［D］.呼和浩特：内蒙古大学，2019.

[10] Menke K H， Raab L，SalewskiA，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro ［J］.Small Ruminate Research，1979：93-217.

[11] Orskov E， Mcdonald I.The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage［J］.Agriculture Science Camb，1979：92-499.

[12] 黄雅莉.啤酒糟、木薯渣对奶水牛体外瘤胃发酵特性和产奶性能的影响［D］.南宁：广西大学，2012.

[13] 白齐昌，郝小燕，项斌伟，等.沙棘黄酮对绵羊体外产气量、瘤胃发酵参数和微生物菌群的影响［J］.动物营养学报，2020，32（3）：1405-1414.

[14] Gao W， Chen A， Zhang B，et al.Rumen degradability and post-ruminal digestion of dry matter［J］.Asian-Australasian journal of animal sciences，2015，4（28）：485-493.

[15] 孙国强，吕永艳，张杰杰.利用体外瘤胃发酵法研究全株玉米青贮与花生蔓和羊草间的组合效应［J］.草业学报，2014，23（3）：224-231.

[16] 沈振峰，常鹤龄，王静，等.不同芦苇草与白酒糟比例组合对绵羊瘤胃体外发酵的影响［J］.甘肃畜牧兽医，2020，50（12）：43-46.

[17] Satter L D， SlyterL L.Effect of ammonia concen_tration on rumen microbial protein production in vitro ［J］.British Journal of Nutrition，1974，2（32）：199-208.

[18] 陈丹丹.四种植物提取物对肉羊甲烷排放、物质代谢及瘤胃微生物区系的影响［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2014.

[19] 陈伟.烟酸对玉米和苜蓿瘤胃培养液氧化还原态及发酵指标的影响［D］.南昌：江西农业大学，2016.

[20] 王聪，周凌云，李发弟，等.日粮中不同蒙脱石添加量对奶牛瘤胃发酵及粪便发酵的影响［J］.甘肃农业大学学报，2013，48（5）：24-31.

[21] 苏峰祥，张延利，刘强，等.日粮添加微藻粉对奶牛瘤胃发酵及乳脂脂肪酸组成的影响［J］.山西农业科学，2021，49（5）：656-661.

[22] 郭晨阳，张腾龙，徐腾腾，等.复合植物提取物对荷斯坦奶牛体外瘤胃发酵的影响［J］.动物营养学报，2020，32（8）：3698-3707.

[23] Chen S， Li X， Liu X，et al.Investigation of chemical composition，antioxidant activity，and the effects of alfalfa flavonoids on growth performance［J］.Oxid Med Cell Longev，2020，2020：8569237.

[24] 杨春涛，刁其玉，曲培滨，等.热带假丝酵母菌与桑叶黄酮对犊牛营养物质代谢和瘤胃发酵的影响［J］.动物营养学报，2016，28（1）：224-234.

[25] 栗明月，方洛云，苏汉书，等.竹叶提取物对奶牛瘤胃体外发酵参数及产气量的影响［J］.动物营养学报，2019，31（4）：1816-1822.

基金资助

国家“十三五”重点研发计划项目(2017YFD0701604-2)

北京市现代农业产业技术体系奶牛创新团队项目