MK571通过激活法尼醇X受体抑制肝脏胆汁酸合成

MK571 inhibits bile acids synthesis in liver by activating farnesoid X recepto

摘要

目的 基于法尼醇X受体，探究MK571对肝脏胆汁酸合成的影响. 方法 按体质量将24只健康大鼠随机分为MK571低、中、高剂量组和对照组，每组6只，分别每天腹腔注射5 、10 、20 mg/kg MK571和等体积生理盐水，连续给药7 d。采用全自动生化分析仪检测血清肝功能生化指标；HE染色观察肝脏病理学变化；LC-MS/MS检测血清和肝脏胆汁酸含量；蛋白免疫印迹法检测大鼠肝脏胆汁酸相关调节蛋白表达。 结果 与对照组相比，MK571干预后，血清丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）含量均显著下降（P<0.05）；病理结果显示肝脏出现炎症损伤；胆汁酸检测结果显示：血清和肝脏甘氨熊去氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和鹅去氧胆酸含量均显著下降（P<0.05）；此外蛋白免疫印迹法结果显示：法尼醇X受体（Farnesoid X receptor，FXR）和胆盐输出泵（Bile salt export pump，BSEP）表达量均显著上升（均P<0.05），而胆固醇-7α-羟化酶（Cholesterol-7α-hydroxylase，CYP7A1）、胆固醇-12α-羟化酶 （Cholesterol-12α-hydroxylase，CYP8B1） 和胆固醇-27α-羟化酶 （Cholesterol-27α-hydroxylase，CYP27A1） 表达量均显著下降（P<0.05）。 结论 MK571可以抑制肝脏胆汁酸合成，其作用机制可能与激活FXR，下调CYP27A1，CYP7A1和CYP8B1表达，上调BSEP表达有关。

Abstract

Objective The study aimed to investigate the effect of MK571 on liver bile acids synthesis based on the farnesoid X receptor. Method Twenty four healthy rats were employed and randomly divided into 4 groups according to body weight，i.e.,MK571 low-dose，middle-dose，and high-dose groups and control group，with 6 rats in each group.The rates of four groups were intraperitoneally injected with 5，10 and 20 mg/kg of MK571 and an equal volume of normal saline，respectively，for 7 days.The biochemical indexes of serum liver function were detected by automatic biochemical analyzer; the pathological change of liver was observed by using HE staining; the content of bile acid in serum and liver was determined by LC-MS/MS; and the expression of bile acid-related regulatory proteins in rat liver was measured by Western blot. Result Compared with the control group，the levels of serum alanine aminotransferase (ALT)，total bilirubin (TBIL) and total bile acid (TBA) were significantly decreased after MK571 intervention (P<0.05).Pathological results showed that the inflammatory damage occurred in the liver.The detection of bile acids showed that glycosodeoxycholic acid，glycideoxycholic acid，glycideoxycholic acid，Glycinocholic acid，and Chenodeoxycholic acid both in serum and liver were significantly decreased (P<0.05).In addition，the results of Western blot showed that both farnesoid X receptor (FXR) and bile salt export pump (BSEP) expressions significantly increased (P<0.05)，while the expression of either cholesterol-7α-Cholesterol-7α-hydroxylase (CYP7A1)，cholesterol-12α-hydroxylase (CYP8B1)，or cholesterol-27α-hydroxylase (CYP27A1) significantly decreased(P<0.05). Conclusion It was indicated that MK-571 could inhibited bile acids synthesis in liver，which might be associated with activating FXR，the down-regulated expressions of CYP27A1，CYP7A1 and CYP8B1，and the up-regulated expression of BSEP.

Graphical abstract

关键词

胆汁酸 / MK571 / 法尼醇X受体 / 调节蛋白

Key words

bile acids / MK571 / farnesoid X receptor / bile acids-related regulatory protein

胆汁酸主要由肝细胞合成并储存在胆囊中，是体内胆固醇代谢的重要途径^［1-2］。胆汁酸合成途径主要有两条，经典途径和替代途径。经典途径主要由胆固醇-7α-羟化酶 （cholesterol-7α-hydroxylase，CYP7A1） 和胆固醇-12α-羟化酶（cholesterol-12α-hydroxylase，CYP8B1） 介导，产生至少70%的胆汁酸^［3］。替代途径主要由胆固醇-27α-羟化酶（cholesterol-27α-hydroxylase，CYP27A1） 介导^［4-5］。胆汁酸的排泄主要通过胆盐输出泵（bile salt export pump，BSEP） 和多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2） 排出^［6］。此外胆汁酸还通过Na⁺依赖性牛磺胆酸协同转运蛋白 （Na⁺ taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP） 和有机阴离子转运多肽2（organic anion transportingpolypeptide 2，OATP2）被肝细胞重吸收。法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）是肝脏和肠道中的胆汁酸的传感器。细胞内胆汁酸浓度升高会激活FXR的转录，减少CYP7A1的表达，抑制胆汁酸合成。此外通过抑制 NTCP的表达负调节肝细胞对胆汁酸的摄取，促进BSEP的表达，增加胆汁酸的排泄^［7］。胆汁酸代谢紊乱与肝胆代谢疾病密切相关^［8］。胆汁酸的积累会形成不溶性盐，并在胆管中沉淀，最终导致胆汁淤积，肝细胞损伤甚至肝硬化坏死^［9-10］。因此胆汁酸的蓄积已成为诱发胆汁淤积，肝细胞和胆管细胞损伤的重要因素^［11］。

MK571是一种白三烯D4（leukotriene D4，LTD4） 和半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CYSLTR1） 抑制剂。据报道MK571可以通过调节细胞因子、粘附分子和阻止内皮氧化型谷胱甘肽的输出，缓解氧化应激，减轻炎症^［12-13］。MK571已成功应用于气道过敏、肺部炎症和肾损伤等疾病^［14］。此外MK571也是一种常用的多药耐药相关蛋白 （multidrug resistance-associated proteins，MRPs） 抑制剂。抑制MRP5可以显著减轻大鼠败血症引起的急性肺损伤^{［13，15］}。同时MRP2作为肝脏胆汁酸另一条排泄途径，受到MK571的抑制。然而目前关于MK571对胆汁酸合成影响的研究很少，机制更是不明。鉴于胆汁酸在肝损伤中的作用不可忽视，因此本研究主要探讨MK571对肝脏胆汁酸合成及其调节蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，6~8周龄，体质量180~200 g，购自兰州兽医研究所实验动物中心，实验动物证号为SCXK（甘）2020-0002，饲养于兰州大学药学院动物房，室温25 ℃，昼夜12 h交替，试验期间动物可以自由进食、饮水。所有试验程序和动物护理均在尽量减少动物痛苦的条件下进行，并严格遵循兰州大学动物伦理委员会的指导。

1.2 试验材料

MK571钠盐（纯度>98%） （美国Med Chem Express公司）；CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、BSEP和NTCP抗体（美国Abcom公司）；FXR和CYP7A1抗体（美国Santa Cruz公司）；RIPA裂解缓冲液（美国Thermo公司）；其余试剂为国产分析纯。

OLYMPUS AU400全自动生化分析仪（日本OLYMPUS光学株式会社）；17/17R低温高速离心机（美国Thermo公司）；Smart WLI光学显微镜（德国GBS公司）；LT-224S分析天平（北京赛多利斯公司）。

1.3 动物分组及试验

供试SD大鼠适应性喂养1周后，根据体质量随机分为4组：MK571低、中、高剂量组和对照组，每组6只，分别每天腹腔注射5、10、20 mg/kg MK571和等体积生理盐水，连续给药7 d，每2 d记录一次大鼠的体质量。

1.4 大鼠肝功能指标含量检测

所有大鼠最后一次处理后，禁食过夜，次日用适量的乙醚麻醉。从腹主动脉获取3 mL血液样品，立即以8 000 r/min离心10 min 获得血清，采用全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸转氨酶 （AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL） 和总胆汁酸（TBA）含量。剩余血清储存在-80 ℃冰箱中用于后续分析。

1.5 苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠肝组织病理学变化

收集完血液样品后，立即采集肝组织。一部分放入液氮中快速冷冻，随后转移到-80 ℃冰箱。另一部分置于4%中性甲醛固定液中固定24 h，用于后续病理分析。HE染色：常规制备肝石蜡切片，梯度乙醇脱蜡，苏木精伊红染色，脱水，中性树胶封片，再加盖玻片，在光学显微镜下观察染色情况。

1.6 UPLC-MS/MS测定大鼠血清和肝脏胆汁酸含量

取出低温储存的血清和肝脏样品，使用UPLC-MS/MS方法检测胆汁酸含量。流动相由乙酸铵-氨水溶液 （A） （7.5 mmol/L 乙酸铵，0.1% 氨水，pH 7.5） 和甲醇 （B） 组成。色谱柱为 ZORBAX Eclipse Plus C18 （2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。梯度洗脱比例：0~1 min，45% B→50% B；1~2 min，50% B→65% B；2~4 min，65% B；4~7 min，65% B→90% B；7~7.01 min，90% B → 45% B；7.01~14 min，45% B。具体检测条件见表1，注射体积为10 µL，流速为0.2 mL/min，柱温保持在30 ℃。

1.7 蛋白免疫印迹法分析

使用适量RIPA裂解缓冲液（RIPA∶PMSF=99∶1，V/V） 裂解肝组织，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度以便调整上样量。再通过SDS-PAGE电泳分离得到不同分子量的蛋白质，并转移到PVDF膜上，然后用脱脂牛奶在室温下封闭1 h。之后PVDF膜分别与抗NTCP （Abcom，ab131084，1∶1 000）、抗CYP7A1（Santa Cruz，sc-25536，1∶1 000）、抗CYP27A1 （Abcom，ab126785，1∶1 000）、抗CYP7A1 （Abcom，ab191910，1∶1 000）、抗FXR （Santa Cruz，sc-25309，1∶500）、抗-β-actin （1∶3 000） 抗体4 ℃摇床过夜。然后将膜在HRP偶联的二抗 （1∶4 000） 中孵育1 h，并使用增强化学发光液进行检测。最后用Image J软件进行灰度值统计。

1.8 统计分析

利用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。试验中所有结果用\overline{x}±s表示，P<0.05表示差异显著。采用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 MK571对大鼠肝功能生化指标的影响

当肝脏受到损伤时，肝细胞膜通透性发生改变，血中AST和ALT水平升高^［16］。由表2可知，与对照组相比，MK571干预后血清AST含量呈上升趋势但无显著性差异。高剂量组血清ALT水平显著性降低（P<0.05）。中、高剂量组AST/ALT比值显著性上升（P<0.05）。这些结果表明当给予高剂量的MK571时会造成轻微的肝损伤。同时中、高剂量组TBIL和TBA含量均显著降低 （P<0.05）。因此认为，MK571可引起轻微肝损伤，并降低血清TBA和TBIL含量。

2.2 MK571对肝脏组织病理学变化的影响

HE染色结果见图1。对照组肝细胞形态规则，排列规则，并且肝脏未出现炎症细胞浸润、胆管扩张等病理损伤。但高剂量组肝脏汇管区出现炎症细胞浸润 （红色箭头），部分肝细胞出现嗜酸性病变。HE结果显示短期低剂量MK571不会引起肝细胞损伤，但高剂量MK571会引起肝脏轻度炎症。

2.3 MK571对血清和肝脏胆汁酸含量的影响

胆汁酸存在于肝、胃、肾、脑和心脏等不同的器官中，拥有相同的初级胆汁酸（CA和CDCA）^［17-18］。在啮齿动物中，CDCA可被羟基化为α-鼠胆酸（α-MCA），并进一步转化为β-鼠胆酸（β-MCA）。并且在大鼠血浆中，β-MCA和CA含量约占总胆汁酸的1/3。在人血浆中，GCDCA 和 GCA 含量约占总胆汁酸的1/2^［5］。

大鼠血清胆汁酸的含量检测结果见图2-A。与对照组相比，低、中、高剂量组大鼠血清GCA、CDCA含量显著降低（P<0.05）；中、高剂量组血清LCA、GUDCA、GCDCA、CA含量显著降低（P<0.05）；高剂量组血清TCA和GDCA含量显著降低（P<0.05）；然而，中、高剂量组UDCA含量显著升高（P<0.01）。结果表明MK571干预后，大鼠血清中初级胆汁酸（CA和CDCA）含量显著减少；甘氨酸结合的胆汁酸（GCA，GUDCA，GCDCA，GDCA） 和牛磺酸结合的胆汁酸 （TCA）显著减少；UDCA含量显著升高（P<0.05）.

大鼠肝脏胆汁酸的含量检测结果见图2-B。与对照组相比，低、中、高剂量组肝脏GCA、GCDCA、TUDCA（中剂量除外）含量均显著降低（P<0.05）；中、高剂量组肝脏中GUDCA、UDCA、β-MCA的含量显著降低（P<0.05）；高剂量组肝脏中CDCA和GDCA的含量显著降低 （P<0.05）；然而高剂量组DCA和LCA含量显著升高 （P<0.05）。结果表明MK571干预后，大鼠肝脏中初级胆汁酸 （β-MCA 和 CDCA） 含量显著降低 （P<0.05）；甘氨酸结合的胆汁酸 （GCA、GUDCA、GCDCA、GDCA） 和牛磺酸结合的胆汁酸 （TUDCA） 含量均显著减少 （P<0.05）。结合血清和肝脏中的胆汁酸含量变化，发现MK571干预后，血清和肝脏中初级胆汁酸和牛磺酸/甘氨酸结合胆汁酸含量均出现显著性降低。此外发现MK571可以增加血清中UDCA含量和肝脏中DCA和LCA含量。

2.4 MK571对大鼠血清和肝脏胆汁酸组成的影响

试验发现在正常大鼠体内，游离型胆汁酸在血清中占大多数（图3-A），而牛磺酸结合的胆汁酸在肝脏中占大多数（图3-B）。此外随着MK571的干预，血清游离型胆汁酸比例增加，牛磺酸结合型胆汁酸的比例下降；在肝脏中，甘氨酸结合型胆汁酸的比例下降，牛磺酸结合型的胆汁酸比例增加。这些结果表明大鼠血清主要含有游离型胆汁酸，肝脏主要含有结合型胆汁酸，尤其是牛磺酸结合型胆汁酸。MK571干预后，大鼠血清和肝脏中游离型和结合型胆汁酸的比例发生变化。据此认为MK571可影响大鼠血清和肝脏胆汁酸组成。

2.5 MK571对肝脏胆汁酸相关调节蛋白的影响

胆汁酸的合成和排泄受许多代谢酶和转运蛋白的调控。当给予MK571后，大鼠血清中总胆汁酸含量显著降低，血清和肝脏中初级胆汁酸和甘氨酸/牛磺酸结合型胆汁酸含量显著降低。蛋白免疫印迹法结果显示（图4）与对照组相比，中、高剂量组FXR、BSEP和NTCP的表达量均显著增加（P<0.05）；低、中剂量组CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1的表达量均显著降低（P<0.05）。以上结果表明MK571可激活FXR，下调CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的表达，减少肝脏中胆汁酸的合成；上调BSEP的表达，促进胆汁酸的排泄。同时发现MK571对上述胆汁酸相关代谢酶和转运蛋白的影响不呈现剂量依赖性。

3 讨论

胆汁酸存在于不同的器官中，并且以不同的形式 （共轭/非共轭）和不同的比例存在^［17］。据报道，通过检测胆汁酸含量变化来检测肝病要比一些传统的方法更灵敏、更准确^［8］，其中用血清胆汁酸水平变化诊断肝病更灵敏可靠^［19］。人体内每天有将近500 mg的胆固醇转化为胆汁酸^［20］。胆汁酸的主要合成部位是肝脏，同时受许多代谢酶的调控，CYP7A1主要催化CA和CDCA的合成，CYP8B1催化CA的合成，CYP27A1和CYP7B1催化CDCA的合成^［4，21］。此外许多转运蛋白负责胆汁酸的排泄和重吸收。BSEP是胆汁酸主要的外排转运蛋白，几乎只在肝脏中表达，介导95%的胆汁酸排泄到胆汁中^［22-23］。NTCP和OATP2主要负责胆汁酸的重吸收^［6］。FXR在维持胆汁酸稳态方面起着至关重要的作用。当FXR被激活时，FXR通过诱导其下游靶基因小分子异二聚体伴侣受体 （SHP） 或成纤维细胞生长因子15/19 （FGF15/19） 的活性来抑制胆汁酸的合成^［24］。已有研究报道大黄素通过增加FXR和BSEP的mRNA水平和蛋白质表达对小鼠胆汁淤积具有保护作用^［25］。同时胆汁酸不仅是FXR的天然配体，还对FXR具有调节作用^{［10，26］}。例如CDCA毒性较小，是一种有效的FXR配体；T-β-MCA和T-α-MCA是FXR拮抗剂^［18］。据报道胆汁酸对FXR的亲和力为：CDCA>LCA>DCA>CA，激活力为：CDCA>DCA>LCA^［24］。本研究发现大鼠腹腔注射不同剂量的MK571后，血清总胆汁酸含量显著下降；大鼠肝脏中FXR和BSEP的表达显著升高，CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达量均有不同程度的降低；血清和肝脏初级胆汁酸和结合型胆汁酸含量显著降低。此外发现肝脏LCA和DCA的含量显著升高，以上结果提示LCA和DCA含量的增加激活了FXR通路，下调肝脏CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达，上调BSEP的表达，可显著降低大鼠血清和肝脏胆汁酸的含量。在生理条件下人体中大多数胆汁酸与甘氨酸结合，而在大鼠中，胆汁酸与牛磺酸结合物占大多数^［27-28］。此外甘氨酸结合的胆汁酸与肝损伤呈正相关^［29］，牛磺酸结合的胆汁酸对血管舒张和内皮功能障碍具有有益作用，并且已成为门静脉高压症的潜在治疗方法^［30］。本试验发现随着MK571的干预，血清和肝脏总胆汁酸的组成结构会发生变化。血清中游离型胆汁酸比例增加，牛磺酸结合型胆汁酸的比例下降；肝脏中甘氨酸结合型胆汁酸的比例下降，牛磺酸结合型的胆汁酸比例增加。上述结果提示MK571在肝脏疾病方面具有潜在治疗作用，但仍需要进一步深入探究。

4 结论

MK571通过激活FXR，下调肝脏CYP27A1、CYP7A1和CYP8B1的表达，上调BSEP的表达，显著降低大鼠肝脏胆汁酸的合成。

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基金资助

兰州市科技局项目(2017-RC-61)

兰州大学第一医院院内基金(ldyyyn2018-10)