环纹奥斯特线虫PCR-ELISA快速检测方法的建立

Establishment of a rapid PCR-ELISA method for the detection of Ostertagia circumcincta

摘要

目的 建立高效、快速、灵敏、特异、准确的环纹奥斯特线虫检测方法。 方法 根据GenBank已发表的奥斯特线虫ITS-2的基因序列，对该上下游引物的5′端分别标记地高辛和生物素，按照PCR-ELISA的操作步骤对所用链霉亲和素的包被浓度、BSA封闭液的封闭浓度、PCR产物的作用时间、酶标二抗的工作稀释浓度以及作用时间、显色时间等进行优化，进而确定反应的最佳条件；以环纹奥斯特线虫、东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫的DNA为模板，在最佳反应条件下进行PCR-ELISA检测其特异性；批内和批间重复性试验检测其稳定性。 结果 建立的环纹奥斯特线虫PCR-ELISA快速检测方法的敏感性比常规PCR高10倍，和其他线虫无交叉反应，特异性强，变异系数小于10%，稳定性好。 结论 建立的高效、快速、特异、安全的Ostertagia circumcincta间隔区ITS-2检测方法，可以为进一步研制用于Ostertagia circumcincta的流行病学调查、诊断试剂提供技术支撑。

Abstract

Objective The study was conducted to develop an efficient，rapid，sensitive，specific and accurate method for the detection of Ostertagia circumcincta. Method The PCR primers were labeled with Digoxin and Biotin according to the gene sequence of ITS-2 from GenBank.The optimal reaction conditions were determined by optimizing the coating concentration of streptavidin，the blocking concentration of BSA blocking solution，the reaction time of PCR products，the working dilution concentration and the reaction time and color development time of enzyme labeled second antibody.PCR-ELISA was used to detect the specificity of DNA from Ostertagia circumcincta，Trichostrongylus orientalis，Haemonchus contortus，Bunostomum trigonocephalum and Oesophagostomum kansuensis.The stability was detected by within-run and between-run repetitive experiment of the PCR-EL1SA. Result The sensitivity of rapid PCR-ELISA was 10 times higher than those of conventional PCR，there was no cross reaction with other nematodes，the specificity was strong，the coefficient of variation was less than 10%，and the stability was good. Conclusion In this study，an efficient，rapid，specific and safe method of detecting O.circumcincta,i.e.,the ITS-2 method，was established，providing the technical support to the further development of the reagent for epidemiological investigation and diagnosis of O.circumcincta.

Graphical abstract

关键词

环纹奥斯特线虫 / PCR / PCR-ELISA

Key words

Ostertagia circumcincta / PCR / PCR-ELISA

奥斯特线虫主要分布在温带和气温较凉爽的地区，主要感染牛、绵羊、山羊和其他家养和野生反刍动物，也可以感染人。给养殖业带来巨大的经济损失，并且危害人类身体健康^［1-2］。奥斯特线虫通常和东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫等消化道线虫混合感染，对上述消化道线虫的诊断，具有重要的经济学意义^［3］。传统上对线虫的诊断主要依靠第3阶段幼虫（L3）的孵化和其形态差别，费时费力^［4-6］，且特异性和敏感性较低^［7-8］，传统形态学方法对形态相似的虫种进行鉴别存在较大的局限性。电镜虽可以将不同虫种准确区分，但需要专业人员，成本高，不适用于大样本研究^［9］。奥斯特线虫寄生于牛羊皱胃和十二指肠，粪便抗原免疫学检测可以作为其诊断方法之一，Agneessens等2001年建立了一种关于胃部感染线虫检测粪便虫体抗原的捕获ELISA方法，敏感性较好，但是特异性较差，很难在临床上应用^［10］。奥斯特线虫虫卵随牛羊粪便排出体外，粪便虫卵检测在一定程度上可以对奥斯特线虫感染做出定性诊断^［11］。为克服形态学和免疫学诊断的局限性，分子生物学方法已经用于小反刍动物^［12-15］和牛^［16-18］的重要胃肠道线虫的鉴别诊断。

PCR-ELISA方法具有更快的诊断速度和更高的灵敏度，为寄生虫的鉴别诊断、分类和流行病学调查提供了简便的方法^［19-20］。目前该方法已经广泛应用于动植物检疫、医学、食品等多个学科^［21-24］。核糖体DNA中介于5.8S，18S和28S之间的内转录间隔区（ITS），包括ITS-1和ITS-2 2段序列，由于ITS区受到的选择压力较小，进化速度快且长度不大，加上协同进化使该片段在基因组不同单元间极其一致，且5.8S，18S和28S rDNA的高度保守，便于设计引物进行动物寄生虫的种间以及株间的分类鉴定，可以利用ITS的基因结构特点建立特异的检测方法^［25-26］。因此，本研究以环纹奥斯特线虫的ITS-2为靶基因，通过条件筛选，旨在建立环纹奥斯特线虫PCR-ELISA的快速检测方法，为临床环纹奥斯特线虫病的批量诊断服务。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

环纹奥斯特线虫、东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜寄生虫病创新团队提供。

1.1.2 试剂与耗材

链霉亲和素和辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体购于Sigma公司；BSA、TMB显色液购于Solarbio公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购于OMEGA公司；pMD 19-T载体和DNA提取试剂盒购于Takara公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司；其余试剂均为化学分析纯。

PCR仪购于Bio-Rad 公司；电泳仪、电泳槽及凝胶成像仪购于北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank数据库检索到的Ostertagia circumcincta间隔区ITS-2基因序列，在NCBI对ITS-2基因序列进行比对，用Oligo 6引物分析软件，设计1对特异性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

OcITS-2-P₁：5'-TTGCAGACGCTTAGAGT GGTGA-3'。

OcITS-2-P₂：5'-GTACGCCATGTTGCATA TGTTA-3'。

1.2.2 样品寄生虫DNA提取及环纹奥斯特线虫ITS-2基因PCR产物克隆鉴定、测序

取1.1.1中的环纹奥斯特线虫、东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫样品，按TaKaRa DNA提取试剂盒操作步骤提取上述寄生虫基因组DNA，4 ℃保存备用。用设计合成的引物对环纹奥斯特线虫的基因组DNA进行PCR扩增，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。将回收后的DNA连接到载体pMD 19-T构建pMD 19-T-ITS-2质粒。将鉴定为阳性的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，对序列进行比对和分析。

1.2.3 引物标记以及PCR扩增

在引物的上下游5'端分别标记上地高辛（DIG）和生物素（BIO），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成1对PCR-ELISA所需要的引物。

OcITS-2-P₁：5'-DIG-TTGCAGACGCTTAG AGTGGTGA-3'

OcITS-2-P₂：5'-BIO-GTACGCCATGTTGC ATATGTTA-3'

反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3 环纹奥斯特线虫ITS-2基因PCR-ELISA检测方法的建立

1.3.1 链霉亲和素最佳包被浓度的确定

用0.05 mol/L、 pH为9.6的碳酸盐缓冲液，把链霉亲和素 （1 mg/mL） 倍比稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 25 μg/mL，200 μL /孔包被酶标板，4 ℃湿盒过夜，按照稀释后的浓度进行PCR-ELISA检测，依据D_450nm以及P/N值确定链霉亲和素的最佳包被浓度。

1.3.2 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定

按照1.3.1筛选出的链霉亲和素的最佳包被浓度包被酶标板，分别用1%、2%、3%、4%、5%、6%和8%的BSA封闭液封闭，以标记引物所扩增出的PCR产物作为一抗，用1∶2 000稀释的HRP标记的抗地高辛抗体作为二抗，将封闭时间设定为10、20、30、45、60、90、120 min，进行PCR-ELISA检测，确定最佳封闭液浓度和封闭时间。

1.3.3 一抗最佳反应时间的确定

按照1.3.1和1.3.2筛选出的最佳包被浓度和最佳封闭条件，以标记引物所扩增出的PCR产物作为一抗，将PCR产物加入酶标板的反应时间分别设定为5、l0、20、30、40、50、60 min，进行PCR-ELISA检测，确定一抗最佳反应时间。

1.3.4 酶标二抗最佳反应条件的确定

根据1.3.3筛选出的最佳反应条件进行PCR-ELISA，将HRP标记的抗地高辛抗体（1 mg/mL）按照1∶500依次倍比稀释至1∶32 000，将二抗反应时间依次设定为5、l0、20、30、40、50、60 min，根据结果确定最佳反应条件^［27］。

1.3.5 最佳显色时间的确定

根据上述最佳反应条件进行PCR-ELISA的测定，37 ℃条件下，将显色时间设置为1、3、5、10、15、20 min，根据结果确定最佳反应条件。

1.3.6 PCR最佳循环次数的确定

以Ostertagia circumcincta间隔区ITS-2设计的引物，进行PCR扩增，将PCR循环数分别设置为5、10、15、20、25、30和35，进行PCR-ELISA检测，根据结果确定最佳循环次数。

1.3.7 PCR-ELISA临界值的测定

利用建立好的PCR-ELISA检测方法，对己知的42份环纹奥斯特线虫阴性样品进行检测，根据测得的D_450nm值进行统计分析。

1.3.8 敏感性试验

用超纯水将环纹奥斯特线虫阳性DNA进行10倍梯度稀释，稀释浓度分别为4.1 ng/μL、410 pg/μL、41 pg/μL、4.1 pg/μL、410 fg/μL、41 fg/μL，按所建立的PCR-ELISA方法进行检测，与常规PCR作比较，评价其敏感性。

1.3.9 特异性试验

对环纹奥斯特线虫、东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫基因组DNA，按所建立的PCR-ELISA方法进行检测，评价其特异性。

1.3.10 重复性试验

用同一批次包被的酶标板对环纹奥斯特线虫病的4份阳性样品和1份阴性样品进行重复性试验，每份样品重复检测5次，评价其批内重复性。用不同批次包被的酶标板对环纹奥斯特线虫病的4份阳性样品和1份阴性样品进行重复性试验，每份样品重复检测5次，评价其批间重复性，测定其D_450nm值，计算变异系数。

2 结果与分析

2.1 PCR产物克隆鉴定与测序

对环纹奥斯特线虫基因组DNA PCR产物和重组克隆质粒pMD19-T-ITS-2 PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，90 V电压电泳40 min，均可以检测到大小约196 bp的条带，与预期大小相符（图1）。

测序结果显示，重组质粒pMD19-T-ITS-2基因中的目的基因片段大小为196 bp，与试验预期结果相符，其序列与GenBank中己经发表的Ostertagia circumcincta间隔区ITS-2基因序列同源性为99%，用BLAST软件对序列进行分析比对结果如图2所示。

2.2 环纹奥斯特线虫ITS-2基因PCR-ELISA检测方法的建立

2.2.1 链霉亲和素最佳浓度的确定

由表1可知，当链霉亲和素浓度为1.25 μg /mL时，P/N=17.29的值最大，确定链霉亲和素的最佳包被浓度为1.25 μg/mL。

2.2.2 最佳封闭液浓度和封闭时间的确定

由表2可知，当封闭液浓度为3%，封闭时间为30 min时，P/N=14.57值最大，确定BSA封闭液最佳封闭浓度为3%，最佳封闭时间为30 min。

2.2.3 一抗最佳反应时间的确定

由表3可知，当PCR产物反应20 min时，P/N=20.40值最大，确定一抗反应最佳时间为20 min。

2.2.4 酶标二抗条件的确定

由表4可知，当HRP标记的抗地高辛抗体浓度为1∶2 000，反应时间为 20 min时，P/N=14.09值最大，确定二抗最佳稀释浓度为1∶2 000，最佳反应时间20 min。

2.2.5 最佳显色时间的确定

根据上述最佳反应条件进行PCR-ELISA，由表5可知，当显色时间为5 min时，P/N=15.50值最大，符合检测要求。

2.2.6 PCR最佳循环次数的确定

由表6可知，当循环数为30个循环时，P/N值=19.50最大。确定PCR扩增的最佳循环次数为30个循环。

2.2.7 PCR-ELISA临界值的测定

对42份样品数据统计分析，根据SPSS软件计算得到平均值X=0.17，标准方差SD=0.05，校正值=X+3SD=0.32，当样品PCR-ELISA检测D_450nm≥0.32时，判定为环纹奥斯特线虫阳性，当D_450nm <0.32时，判定为阴性样本。

2.2.8 敏感性检测

由图3和表8可知，PCR-ELISA可检测出环纹奥斯特线虫DNA的最低浓度为410 fg/μL，而常规PCR可以检测最低模板浓度为4.1 pg/μL，证明PCR-ELISA的敏感性比常规PCR高10倍。

2.2.9 特异性检测

用所建立的PCR-ELISA检测方法对奥斯特线虫、东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫DNA进行检测，结果如表9所示。奥斯特线虫D_450nm为0.36，大于校正值0.32，检测结果为阳性，其他病原体D_450nm均小于0.32，结果为阴性。证明本研究建立的PCR-ELISA检测方法特异性好，无交叉反应。

2.2.10 重复性试验

用同一批次包被的酶标板进行批内重复性试验，由表10可知，5份样本的变异系数分别为4.00%，2.70%，3.00%，5.10%，7.90%，变异系数均低于8%，说明建立的PCR-EL1SA检测方法的批内重复性良好。

用同一批次包被的酶标板进行批间重复性试验，由表11可知，5份样本的变异系数分别为3.80%，5.80%，7.10%，4.50%，7.80%，变异系数均低于10%（表11），说明建立的PCR-EL1SA检测方法的批内重复性良好。

3 讨论

PCR-ELISA检测是将PCR扩增目的基因与ELISA准确定量相结合的一种检测方法，该方法将PCR检测的快速性与ELISA检测的敏感性有机结合，使生物信号逐级放大，具有敏感、特异、可大量检测样品等优点^［28-30］，为医疗、兽医和农业等行业重要的检测方法^［31］。该方法可直接通过读取D_450nm值判断结果，减少了人为因素对结果的影响，同时无需接触溴化乙锭（EB）致癌物质，减少了对试验人员和环境的潜在危险。

本试验对奥斯特线虫ITS⁃2基因的保守序列设计引物，在上下游引物的5’端分别标记生物素和地高辛，利用生物素和链霉亲和素特异性结合的原理，带有标记的PCR产物与链霉亲和素结合，酶标二抗与地高辛结合。链霉素和生物素的结合能力是普通抗原抗体结合能力的10⁶倍，“链霉亲和素-生物素”系统是PCR-ELISA检测的最好搭档^［32-35］。通过对链霉亲和素的包被浓度、包被条件、封闭液浓度及封闭时间、PCR产物反应时间、二抗工作浓度以及反应时间等条件进行优化，最终筛选出最佳奥斯特线虫PCR-ELISA反应条件。

本试验对PCR扩增的平台期摸索确立了最佳循环次数，分别以5、10、15、20、25、30和35循环数进行扩增并检测，结果显示30个循环数时，扩增效率己经达到最高，确定最佳循环数为30个循环，此时最为省时高效。同时，在试验过程中对各个反应条件进行优化，最终确定最佳包被条件为1.25 μg /mL的链霉亲和素4 ℃包被过夜，3%的BSA封闭液37 ℃条件下封闭20 min，PCR产物37 ℃作用20 min，HRP标记的抗地高辛抗体2 000倍稀释的酶标二抗（1 mg/mL） 37 ℃反应20 min，显色5 min。经过条件优化，本试验建立的PCR-ELISA检测方法比原来节省了0.5~1 h左右。

本试验建立的奥斯特线虫PCR-ELISA可检测出样本的最低浓度为410 fg/μL，而常规PCR可以检测最低模板浓度为4.1 pg/μL，证明PCR-ELISA的敏感性比常规PCR高10倍，并与东方毛圆线虫、捻转血矛线虫、羊仰口线虫、甘肃食道口线虫无交叉反应，说明其特异性好。对相同模板进行批间和批内重复性进行检测，检测结果显示变异系数均低于10%，说明建立的PCR-ELISA方法批内批间重复性良好，证明本试验建立的PCR-ELISA检测方法稳定性高。本试验所建立的PCR-ELISA检测方法具有高效、快速、灵敏、特异、安全等优势，可以快速、准确的检测奥斯特线虫，为调查和预警提供技术支持。

参考文献

[1] Roberts L S， Janovy J.Foundations of parasitology［M］.8th ed.New York：McGraw-Hill，2012.

[2] Williams J C.Infection with Ostertagia ostertagi in goats and calves［J］.Veterinary Parasitology，1987，23：51-67.

[3] Charlier J， van der Voort M， Kenyon F，et al.Chasing helminths and their economic impact on farmed ruminants［J］.Trends Parasitol，2014，30：361-367.

[4] Lichtenfels J R， Hoberg E P， Zarlenga D S.Systematics of gastrointestinal nematodes of domestic ruminants： advances between 1992 and 1995 and proposals for future research［J］.Vet Parasitol，1997，72：225-245.

[5] Berrie D A， East I J， Bourne A S，et al.Differential recoveries from faecal cultures of larvae of some gastro-intestinal nematodes of cattle［J］.J Helminthol，1988，62：110-114.

[6] Hubert J， Kerboeuf D.A new method for culture of larvae used in diagnosis of ruminant gastrointestinal strongylosis： comparison with fecal cultures［J］.Can J Comp Med，1984，48：63.

[7] Dobson R J， Barnes E H， Birclijin S D，et al.The survival of Ostertagia circumcincta and Trichostrongylus colubriformis in faecal culture as a source of bias in apportioning egg counts to worm species［J］.Int J Parasitol，1992，22：1005-1008.

[8] Roeber F， Kahn L.The specific diagnosis of gastrointestinal nematode infections in livestock： Larval culture technique，its limitations and alternative DNA-based approaches［J］.Vet Parasitol，2014，205：619-628.

[9] 韩亮，周东辉，刘卿，等.基于ITS序列鉴别3种感染白耗牛线虫的PCR-RFLP方法的建立［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2017，35（2）：164-168.

[10] Agneessens J， Claerebout E， Vercruysse J.Development of a copro-antigen capture ELISA for detecting Ostertagia ostertagi infections in cattle ［J］.Vet.Parasitol，2001，97：227-238.

[11] 青海畜牧兽医科学院 等.畜牧兽医草原译文［J］.青海省科学技术协会，1982：163-187.

[12] Harmon A F， Williams Z B， Zarlenga D S，et al.Real-time PCR for quantifying Haemonchus contortus eggs and potential limiting factors［J］.Parasitol Res，2007，101：71-76.

[13] Learmount J， Conyers C， Hird H，et al.Development and validation of real-time PCR methods for diagnosis of Teladorsagia circumcincta and Haemonchus contortus in sheep［J］.Vet Parasitol，2009，166：268-274.

[14] Siedek E M， Burden D， von S G.Feasibility of genusspecific real-time PCR for the differentiation of larvae from gastrointestinal nematodes of naturally infected sheep［J］.Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2005，119：303-307.

[15] Samson-Himmelstjerna G V， Harder A， Schnieder T.Quantitative analysis of ITS2 sequences in trichostrongyle parasites［J］.Int J Parasitol，2002，32：1529-1535.

[16] Zarlenga D S， Chute M B， Gasbarre L C，et al.A multiplex PCR assay for differentiating economically important gastrointestinal nematodes of cattle［J］.Vet Parasitol，2001，97：201-211.

[17] Zarlenga D S， Hoberg E P， Stringfellow F，et al.Comparisons of two polymorphic species of Ostertagia and phylogenetic relationships within the Ostertagiinae （Nematoda：Trichostrongyloidea） inferred from ribosomal DNA repeat and mitochondrial DNA sequences［J］.J Parasitol，1998，84：806-812.

[18] Zarlenga D S， Gasbarre L C， Boyd P，et al.Identification and semi-quantitation of Ostertagia ostertagi eggs by enzymatic amplification of ITS-1 sequences［J］.Vet Parasitol，1998，77：245-257

[19] Kobets T， Badalova J， Grekov I，et al.Leishmania parasite detection and quantification using PCR-ELISA［J］.Nature protocols，2010，5（6）：1074-1080.

[20] Nolasco G， Sequeira Z， Soares C，et al.Asymmetric PCR ELISA： increased sensitivity and reduced costs for the detection of plant viruses［J］.European Journal of Plant Pathology，2002，108（4）：293-298.

[21] 郑雨桐.五种立克次体多重PCR-ELISA检测体系的建立［D］.大连：大连医科大学，2021.

[22] 方程.气肿疽梭菌PCR-ELISA检测方法的建立［D］.延吉：延边大学，2021.

[23] 吴晓利.实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较［J］.生物化工，2021，7（3）：97-98，101.

[24] 相思宇，倪婷婷，薛书江.基于ENO基因的猪附红细胞体病PCR-ELISA检测方法的建立［J］.延边大学农学学报，2019，41（2）：68-73.

[25] 牛庆丽，罗建勋，殷宏.转录间隔区（ITS）在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展［J］.中国兽医寄生虫病，2008，16（4）：41-47.

[26] 殷力媛，李法则，赵俊龙，等.动物寄生线虫遗传多样性的研究进展［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2015，33（5）：387-392.

[27] 刘斌，陈晓宇，牟筱，等.小反刍兽疫N5蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立［J］.甘肃农业大学学报，2017，52（2）：1-6.

[28] Hasani S M， Mirnejad R， Piranfar V，et al.Comparing rapid and specific detection of Brucella in clinical samples by PCR-ELISA and Multiplex-PCR method［J］.Iranian Journal of Pathology，2016，11（2）：144-150.

[29] Amani J， Ahmadpour A， Fooladi AAI，et al.Detection of E.coli O157：H7 Shigella dysenteriae toxins in clinical samples by PCR-ELISA［J］.Brazilian Journal of Infectious Diseases An Official Publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases，2015，19（3）：278-284.

[30] Hong Y， Berrang M E， Liu T，et al.Rapid Detection of Campylobacter coli，C.jejuni，and Salmonella enterica on poultry carcasses by using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（6）：3492-3499.

[31] 陈晴，王秋霞，欧长波，等.PCR-ELISA在疫病病原分子诊断中的应用［J］.中国家禽，2018，40（13）：63-65.

[32] 汪进，罗伟.链霉亲和素-生物素-ELISA方法的建立及其在HBsAg测定中的应用［J］.检验医学，1998，13（4）：213-214.

[33] 吴在荣，王宏锐.链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用［J］.放射免疫学杂志，2010，23（5）：560-563.

[34] Li W， Yan Z， Xiang G，et al.Determination of chloramphenicol residues in milk by enzyme-linked immunosorbent assay：improvement by biotin-streptavidin-amplified system［J］.Journal of Agricultural & Food Chemistry，2010，58（6）：3265-3270.

[35] Tamminen M， Joutsjoki T， Sjoblom M，et al.Screening of lactic acid bacteria from fermented vegetables by carbohydrate profiling and PCR-ELISA［J］.Letters in Applied Microbiology，2004，39（5）：439-444.

基金资助

甘肃农业大学盛彤笙创新基金项目(GAU-STS-2019-5)