快速测定唐古特白刺种子生活力的研究

A rapid determination of seed viability of Nitraria tangutorum

摘要

目的 快速评价唐古特白刺种子的发芽潜力。 方法 对浸种温度、浸种时间、TTC溶液浓度、染色温度和染色时间进行5因素4水平正交试验以测定唐古特白刺种子的生活力，并进行回归分析。 结果 浸种温度、浸种时间、TTC溶液浓度、染色温度和染色时间5个因素都是影响唐古特白刺种子生活力测定的主要因素，其中浸种时间影响最大，浸种温度与TTC浓度次之；试验测得种子生活力的最佳检测条件是35 ℃下浸种20 h、0.3% TTC染色液、25 ℃恒温、黑暗条件下染色15 h，84%的种子表现出强生活力；拟合方程可以预测试验过程中76.8%的情况。 结论 研究筛选出的最优组合可以快速测定唐古特白刺种子的生活力，并且回归方程可以检测试验中出现的异常值，可为后续育苗造林提供参考。

Abstract

Objective The studt aimed to evaluate quickly the germination potential of Nitraria tangutorum seeds. Method Using N.tangutorum seeds as material，a 5-factor 4-level orthogonal test was performed on the seed soaking temperature，seed soaking time,TTC solution concentration，dyeing temperature and dyeing time to determine the seed viability，and regression analysis was performed. Result A total of 5 factors are the main factors that affect the determination of seed viability，among which the time of soaking seeds has the greatest influence，followed by soaking temperature and TTC concentration.The best detection conditions are soaking seeds at 35 ℃ for 20 hours，0.3% TTC staining solution，25 ℃ constant temperature，and staining for 15 hours under dark conditions.The seeds about 84% showed strong viability，the fitting equation can predict 76.8% of the conditions during the experiment. Conclusion The optimal combination screened out in this study can quickly measure the viability of a batch of N.tangutorum，and the regression equation can detect abnormal values in the experiment，providing a reference for subsequent seedling cultivation and afforestation.

Graphical abstract

关键词

温汤浸种 / TTC法 / 染色时间 / 染色温度 / 回归分析 / 种子生活力

Key words

seed activity / soaking seeds in warm soup / TTC method / dyeing time / dyeing temperature / regression analysis

唐古特白刺（Nitraria tangutorum），又称酸胖、白茨、白刺，主要分布于陕西北部、内蒙古西部、宁夏、甘肃河西、青海、新疆及西藏东北部等地区^［1］。白刺是中国荒漠地区特有的灌木树种，具有较强的耐盐碱、耐干旱和防风固沙的生态适应性，常被用来固定流沙，对我国西北地区的生态环境具有重要意义。其叶和果实等可提取药物，有一定经济价值。近年来受人为破坏、环境变化和病虫害等的严重危害，唐古特白刺在全国各个自然分布区均有不同程度的缩减^［2-3］。以柴达木盆地自然分布区为例，目前有10万hm²唐古特白刺，其中3.3万hm²以上遭到不同程度的破坏^［4］。在这种情况下，恢复唐古特白刺自然分布区是十分必要的。唐古特白刺一般采用播种造林，而一批发芽率高的种子是播种造林的基本条件。种子的发芽率主要取决于种子本身生活力强弱和是否休眠两个方面。种子生活力是种子发芽的潜在能力或种胚所具有的生命力，所以常用种子生活力来评价一批种子的质量好坏和其发芽的可能性^［5］。

唐古特白刺为核果植物，种子被石质细胞组织包裹，形成坚硬的果核，狭卵形，表面孔穴分布不均且少^［6］，因此硬实现象是影响唐古特白刺种子发芽率高低的关键因素之一。目前许多学者对唐古特白刺种子发芽率的研究多集中在通过热水浸种^［7］、擦破种皮或果皮^［8］或浓硫酸浸泡^［9］等打破休眠和内果皮硬实的影响^［10］以提高发芽率。不同的预处理方式导致了唐古特白刺种子发芽率的差异很大，造成这种情况的原因有：一是擦破内果皮和打破休眠的程度不同，二是忽略了种子本身的生活力大小。利用发芽率检测一批种子的质量是最准确的，可对于发芽周期长的唐古特白刺种子来说是耗时耗力，因此，急需找到一种科学并且检测时间短的方法代替直接发芽试验。秦家顺^［11］发现TTC染色法的检测结果与种子实际发芽率相接近。TTC法是根据胚的染色形状、颜色深浅来判断种子生活力大小，这种方法世界公认、原理可靠、不受休眠限制^［12］，因此TTC染色法快速测定种子生活力是比较理想的一种替代方式。目前还没有关于快速检测唐古特白刺种子质量的相关报道，本研究优化了TTC溶液对唐古特白刺种子的染色条件，旨在快速检验唐古特白刺种子的发芽潜力，为播种造林、恢复唐古特白刺分布区提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试唐古特白刺种子于2020年8月初采自甘肃省武威市凉州区羊下坝镇唐古特白刺试验田（N 38°24′，E 103°9′）。利用尼龙网布揉搓，洗去果肉后晾干，保存于4 ℃冰箱中备用。种子于10月初取出后常温干燥保存，试验在11月中旬进行^［9］。

1.2 试验方法

1.2.1 正交试验设计

参考相关学者^［13-16］的研究，选取2个打破种子休眠、影响种子萌发的关键因素（浸种温度、浸种时间），选取3个影响种子染色的关键因素（TTC浓度、染色温度、染色时间）作为检测唐古特白刺种子生活力的指标。采取L₁₆（4⁵）5因素4水平正交试验设计（表1）。

1.2.2 种子预处理

唐古特白刺种子用0.5%的高锰酸钾消毒40 min后，蒸馏水冲洗8~10次，用70% H₂SO₄浸种20 min，蒸馏水再冲洗8~10次，用pH试纸测试最后一次的冲洗液，直至pH值处于6.5~7.5^［17］。

1.2.3 TTC溶液的配制

用NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O按照一定比例配制pH=7的磷酸缓冲液^［18］，精确称取0.1、0.3、0.5、0.7 g的氯化四唑粉剂，分别溶解于100 mL磷酸缓冲液中，配制成0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的TTC溶液，放置于棕色瓶中，4 ℃冰箱避光保存备用。

1.3 TTC染色

1.3.1 浸种处理

预处理的种子取出50粒为一个组合，共16个处理组合，每个处理组合重复3次。先将放有蒸馏水的培养皿放入各个试验梯度的恒温箱中2 h，后将种子放入培养皿中，使种子完全浸没，然后按照正交试验设计分别浸泡处理5、10、15、20 h。

1.3.2 染色

取出浸泡的种子，用吸水纸吸干表面水分，在试验台上沿内果皮的纵向用解剖刀切开，留下保留完整种胚的一半，放入培养皿中，加入等量对应浓度的现配TTC溶液，使种子完全浸没，放回到其对应25、30、35、40 ℃恒温箱中，避光染色，按照正交试验设计分别等待5、10、15、20 h后取出培养皿，用蒸馏水将种子冲洗干净，吸水纸吸干表面的水分，准备观察。

1.3.3 观察

用镊子将染色的种子从内果皮中取出，观察种胚和胚乳染色面积及深浅并记录。判断种子生活力强弱的标准为：种胚和胚乳全部或大部分染成红色、粉色，为生活力强；种胚和胚乳仅有少部分染成红色、粉色，为生活力弱；种胚和胚乳未被染色，呈现黄色或白色，为无生活力^［19-20］。

种子生活力（%）=\frac{\mathrm{有强}\mathrm{生活}\mathrm{力的}\mathrm{种子}\mathrm{数}}{\mathrm{供试}\mathrm{种子}\mathrm{总数}}×100%

1.4 数据处理

采用Excel统计数据计算种子生活力（均值±标准差）、极大值、极小值以及各因素水平对应的总生活力（总生活力：每个因素水平对应的生活力之和）；Minitab18对数据进行方差分析、相关性分析与回归分析。

2 结果与分析

2.1 唐古特白刺种子生活力测定正交试验结果

对正交试验结果进行极差分析（表2），比较各因素对测定结果的影响大小，极差值为：R₂>R₄>R₃>R₁>R₅，即浸种时间对测定唐古特白刺生活力影响最大，其次是染色温度，而影响较小的是TTC浓度、浸种温度和染色时间。以各因素对应最大值来代表检测生活力的最优条件时，其中因素A（浸种温度）最大值出现在水平4，因素B（浸种时间）最大值出现在水平3，因素C（TTC浓度）最大值出现在水平1，因素D（染色温度）最大值出现在水平1，因素E（染色时间）最大值出现在水平4，即唐古特白刺在40 ℃下浸种15 h、0.1% TTC染色液、25 ℃恒温、黑暗条件下染色20 h，染色效果最好。

由正交试验结果进行方差分析，由表3可知，试验选取的5个影响因素都对试验结果有极显著影响（P<0.01），即说明浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度和染色时间都是影响唐古特白刺种子生活力测定的主要因素。

以3次试验的结果分析得到种子生活力随因素水平变化的生活力情况（图1），随因素A（浸种温度）的水平变化，白刺种子生活力呈显著性增大，在水平A₄达到最大值；随因素B（浸种时间）的水平变化，种子生活力在水平B₃达到最大值，之前呈显著性增大，后又显著性减小；随因素C（TTC浓度）的水平变化，种子生活力在水平C₁到C₂略有下降，后显著减小；随因素D（染色温度）的水平变化，种子生活力先显著减小，后显著增大，但并没有高于水平D₁；随因素E（染色时间）的水平变化，种子生活力呈显著性增大、减小和增大，在水平E₄达到最大值。

2.2 相关性分析

对5个直接影响种子染色的因素和种子生活力进行相关性分析，与种子生活力成正相关的因素是浸种温度、浸种时间和染色时间，其中相关性最强的是浸种时间，达到极显著水平，浸种温度与染色时间均未达到显著水平；与种子生活力成负相关的因素是TTC浓度和染色温度，均未达到显著水平。

多因素直接进行相关性分析，各因素之间存在相互影响，导致各因素与种子生活力之间的线性关系强弱存在偏差，在直接进行相关性分析的基础上进行净相关性分析（偏相关性分析），在控制部分因素的线性影响的条件下，再次分析各因素与种子生活力直接的线性关系。由表4可以看出，控制因素B（浸种时间）后，因素A（浸种温度）和种子生活力呈显著线性正相关，因素C（TTC浓度）和种子生活力呈显著线性负相关；控制因素C（TTC浓度）后，因素A（浸种温度）仍然和种子生活力呈显著线性正相关；控制因素A（浸种温度）后，因素D（染色温度）、E（染色时间）与种子生活力的线性关系不显著。

2.3 回归分析

2.3.1 初步拟合回归方程

通过对5个因素和检测结果进行分析，存在函数关系，构建检测唐古特白刺种子生活力的数学模型，以种子生活力为因变量（Y），以5个直接影响种子染色的因素为自变量（X），采用回归分析的方法拟合回归方程，数据处理方法选择“Enter”法，得到初步回归方程：

Y=\mathrm{11.1}+\mathrm{0.767}A+\mathrm{2.827}B-\mathrm{19.83}C-\mathrm{0.5}D+\mathrm{0.453}E

初步拟合的回归方程拟合度为65.3%，D-W值为 3.061（在0~4之间）>2，说明存在负自相关现象，反之存在正自相关现象，而越接近2（一般在1.5~2.5之间认为正常）说明自相关性越弱，即残差图无明显规律。拟合回归方程呈现极显著水平说明各回归系数不同时为0，自变量和因变量的线性关系显著，可建立线性模型。由初步拟合的回归方程拟合度不高，仅可以预测试验中65.3%的自变量和因变量之间的关系，对试验结果进行常规检验。

2.3.2 回归诊断并优化方程

对方程进行回归诊断，结果（图2）表现为：首先从正态概率图中可以看到，数据集中在直线周围分布，无明显规律，其次在直方图中满足正态曲线，说明满足拟合回归方程的要求；在与拟合值图和与顺序图中，呈现的是观测值距离拟合方程的程度大小，用标准化残差表示，在95%的置信区间内，标准化残差取值在［-2，2］之间，超出此范围，默认为异常值，如图所示，结合此模型，计算得到COOK距离=0.4，DFITS=1.55，所有观测值都在此范围内，无强影响点。在确定不是由于输入错误的情况下，剔除异常值后重新拟合回归方程。

Y=\mathrm{23.1}+\mathrm{0.589}A+\mathrm{3.36}B-\mathrm{15.39}C-\mathrm{0.678}D-\mathrm{0.08}E

（R²=0.768，调整R²=0.738，D-W=2.52）

DFITS_（i）=\frac{{\widehat{y}}_i-{{\widehat{y}}_i}_{(i)}}{{\widehat{\sigma }}_{(i)}{h_i}^{\mathrm{1}/\mathrm{2}}}

式中：{\widehat{y}}_{(i)}是i个观测值被排除后算得的模型预测值，{\widehat{\sigma }}_{(i)}是对应的标准误差，{h_{(i)}}^{\mathrm{1}/\mathrm{2}}是第i个杠杆率的平方根。

2.3.3 回归系数的显著性检验

方程各系数表现为：常量>浸种时间>浸种温度>染色时间>染色温度>TTC浓度，标准误差为：常量>TTC浓度>浸种时间=染色时间>染色温度=浸种温度，其中浸种温度、浸种时间、染色温度、染色时间均小于1。T值：浸种时间>浸种温度>常量>染色时间>TTC浓度>染色温度，其中生活力与浸种时间（P_B <0.01）呈极显著线性关系，与TTC浓度（P_C <0.05）、染色温度（P_D <0.05）呈显著线性关系，与其他因素系数没有明显线性关系。VIF很大程度的远离10，说明5个因素变量之间无共线性关系（表5）。

2.3.4 回归方程预测区间

根据公式：

Y=a_{\mathrm{1}}{X}_{\mathrm{1}}+{\mathrm{a}}_{\mathrm{2}}{X}_{\mathrm{2}}-a_{\mathrm{3}}{X}_{\mathrm{3}}-{\mathrm{a}}_{\mathrm{4}}{X}_{\mathrm{4}}-a_{\mathrm{5}}{X}_{\mathrm{5}}+b

计算新拟合方程的预测区间，预测值所在范围为26.5%~90.54%。

3 讨论与结论

植物的一生起源于一粒种子，可种子萌发是植物生活史中最基础也是最脆弱的阶段，因此研究其过程及影响条件对植物一生有至关重要的意义^［21］。唐古特白刺种子在不经预处理的情况下，由于其种子硬实现象导致自然发芽率低，发芽时间长^{［1，6，22］}，难以在短时间内通过发芽试验检测一批种子的生活力强弱。使用TTC法可以快速检测一批种子的质量，但不同植物种子对TTC染液的适应浓度不同，使用1.0%TTC（pH=7）染液避光对永瓣藤种子染色3 h，染色效果最好^［23］；在40 ℃下，使用0.2% TTC染液染色2 h对南京椴种子的染色效果最好^［24］；水稻种子吸水3 h后，在30 ℃下，1% TTC染液染色2 h的染色效果最好^［25］。在这种情况下，本试验通过设计正交表进行试验，结果表明，唐古特白刺在35 ℃下浸种20 h、0.3% TTC染色液、25 ℃恒温、黑暗条件下染色15 h，染色效果最好。而在极差分析中发现不同水平下，生活力变化差异较大，而当以各因素对应最大值为最优条件筛选时，发现最优条件为40 ℃下浸种15 h、0.1% TTC染色液、25 ℃恒温、黑暗条件下染色20 h，此结果与试验得到的结果不同，相同的条件是染色温度。对此，由于以最大值筛选的最优条件未在试验中，无法直接比较。但在相关性分析中发现，唐古特白刺的浸种时间对染色效果影响最大，在控制浸种时间的影响后，发现浸种温度和TTC浓度对染色效果的影响次之，染色时间与染色温度的影响较小，表明5个因素之间存在相互影响，这与雷慧霞等^［26］在白鲜种子中的研究结果相似。综上所述，35 ℃下浸种20 h、0.3% TTC染色液、25 ℃恒温、黑暗条件下染色15 h此条件更适合唐古特白刺种子的生活力检测。此筛选的最优组合与曾彦军等^［27］对唐古特白刺的研究结果不同，其直接采用在20 ℃下浸种、1.0% TTC染液、30 ℃恒温、黑暗条件下进行染色，每隔4 h观察一次染色情况。

为了更好地了解5个因素对检测种子生活力的影响，找到一个可以直观反映其相关关系的直线，因此进行回归分析。初步拟合方程，拟合程度不高，存在负自相关现象，常规检验后发现是存在异常值，出现异常值正好解释以最大值筛选的最优条件与试验结果不符是由于异常值的存在，因此在剔除异常值组合后重新拟合方程，发现各因素系数间无共线性，此结果与偏相关分析结果一致，表明新方程拟合度高，具有预测唐古特白刺种子生活力的意义。

综上所述，本研究筛选的最优组合可以快速、准确的检测一批唐古特白刺的种子生活力，并且回归方程可以检测试验过程中是否出现异常值，可以为唐古特白刺的育苗造林提供参考。

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基金资助

中国对发展中国家常规性科技援助项目(KY202002011)

中央财政林业科技推广示范资金项目(［2020］ZYTG15)

甘肃省林业科技创新与国际合作资金项目(GLC2019-418-8)