葡萄皮皂苷提取条件优化及其稳定性分析

Optimization of extraction conditions and stability analysis of grape skin saponins

摘要

目的 研究无水乙醇质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数、pH值对酿酒葡萄皮渣中皂苷萃取的影响及产物稳定性分析，以期为葡萄皮皂苷提取提供参考。 方法 采用双水相体系萃取葡萄皮中的皂苷，在单因素试验基础上，选取无水乙醇质量分数、粗提液质量分数、pH值为主要影响因子，利用Box-Behnken设计3因素3水平试验，以葡萄皮皂苷为响应值进行响应面分析。同时，对优化后的皂苷进行温度和金属离子稳定性试验。 结果 葡萄皮皂苷最佳萃取条件为：无水乙醇质量分数21%、粗提液质量分数为4%、pH值为6。在最优条件下实测值为90.3%，试验结果与模型预测值（90.615 6%）相接近，表明模型预测值与试验值之间有很好的拟合性，证实了模型的有效性。稳定性试验研究结果表明，45 ℃时皂苷稳定性最好，Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺对皂苷的稳定性都有一定的影响。 结论 通过试验优化了葡萄皮皂苷的萃取工艺条件，可为酿酒葡萄皮渣的资源化开发提供技术参考。

Abstract

Objective To study the effects of anhydrous ethanol mass fraction，ammonium sulfate mass fraction，crude extract mass fraction and pH value on the extraction of saponins from grape skin residue，and to analyze the stability of the product. Method Saponins from grape skins were extracted by aqueous two-phase system.On the basis of single factor experiment，the mass fraction of anhydrous ethanol，the mass fraction of crude extract and the pH value were selected as the main influencing factors.Box-Behnken design was used to design three-factor and three-level experiment，and saponins from grape skins were used as response values to conduct response surface analysis.At the same time，temperature and metal ion stability tests were carried out on the optimized saponins. Result The optimal extraction conditions of grape skin saponins were as follows: the mass fraction of anhydrous ethanol was 21%，the mass fraction of ammonium sulfate was 24%，the mass fraction of crude extract was 4%，and the pH value was 6.Under the optimal conditions，the measured value was 90.3%，and the experimental results were close to the predicted value of the model (90.615 6%)，indicating that the predicted value of the model was well fitted with the experimental value，which confirms the validity of the model.The results of stability test showed that saponin had the best stability at 45 ℃，and metal ions Mg²⁺，K⁺，Ca²⁺ had certain influence on the stability of saponin. Conclusion The extraction conditions of grape skin saponins are optimized，which could provide technical reference for the resource development of grape skin residue.

Graphical abstract

关键词

葡萄皮渣 / 皂苷 / 萃取 / 响应面设计

Key words

grape skin residue / saponins / extraction / response surface design

2020年全球葡萄酒产量为260亿L，在酿酒过程中葡萄皮渣废料占加工总量的20%左右^［1-2］。葡萄皮渣中含有大量的膳食纤维、皂苷类、白藜芦醇、多酚类、花色苷、蛋白质等多种功能性成分，但资源化利用率较低，造成了资源浪费的同时还严重污染了环境^［3-18］。^{现代药理学研究表明，皂苷类多具有祛痰止咳、抗菌、抗氧化、提高免疫能力、降血糖、抗结石和抗肿瘤等多方面的生物活性，同时植物皂苷类可以预防老年人骨质疏松等多种疾病，是目前天然药物领域研究的热点，具有深度开发和利用的价值［19-24］。}

随着萃取技术体系的逐步发展和成熟，双水相萃取法已被广泛应用到天然产物的研究中^［25-28］。与传统的乙醇回流提取法相比，双水相萃取法具有设备简单，可在常温下进行，能耗低，不会破坏萃取物性质，回收效率高等优势^［29-32］。但目前关于酿酒葡萄皮渣的皂苷类萃取研究未见报道。本研究以无水乙醇质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数、pH值对葡萄皮皂苷分配系数及萃取率的影响为基础，采用Box-Behnken 响应面试验，优化萃取条件，以期为利用无水乙醇和硫酸铵双水相体系提取葡萄皮渣中的皂苷提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

葡萄皮渣：2020年9月采自甘肃莫高实业股份有限公司，将采集的葡萄皮渣经挑选、晒干、粉碎，得到干净的葡萄皮粉末，备用。

1.2 仪器与试剂

722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；XO-SM50超声波微波组合反应系统（南京先欧仪器制造有限公司）；DKB-501超级恒温水浴（扬州三发电子有限公司）；FZ102微型植物试样粉碎机（河北黄骅中兴仪器有限公司）；DD-5M离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

无水乙醇（≥99.7%）、香草醛（≥99%）、冰乙酸（≥99.5%）、高氯酸（≥72%）、硫酸铵、NaOH、HCl等均为国产分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄皮中皂苷含量测定条件优化

1.3.1.1 粗提液的制备^［33］

称取葡萄皮粉末5 g，放入250 mL的三角瓶中，葡萄皮粉末与50%的无水乙醇以1∶5（g/mL）的比例混合摇匀，超声15 min后2 000 r/min离心5 min，取粗提液待用。

1.3.1.2 双水相萃取方法^［34］

准确量取一定质量分数的无水乙醇、硫酸铵及葡萄皮皂苷粗提液，充分振荡混匀后静置，使两相进行分离。

1.3.1.3 香草醛冰乙酸-高氯酸比色法测定皂苷含量^{［30，35］}

取分离液0.1 mL，依次加入0.2 mL香草醛冰乙酸混合液、0.8 mL高氯酸在60 ℃下水浴15 min，再用水冷却5 min，用冰乙酸定容至10 mL，测定510 nm下的吸光值（空白对照将上清液换为等量蒸馏水）。带入回归方程y=0.066 1x-0.023，R²=0.997，（x为皂苷质量浓度mg/mL，y为吸光值）得到皂苷的质量浓度。

1.3.1.4 皂苷萃取率的测定^［30］

在双水相萃取中，常采用相比R、分配系数K和萃取率Y作表征来评判双水相体系中萃取物的萃取效果。分配系数K指物质在两相中的分配情况，为上下相质量浓度比，萃取率Y指上相中的物质含量占双水相萃取出的总物质含量的比例。

在香草醛冰乙酸-高氯酸比色法测定皂苷含量的基础上，按（1）式计算葡萄皮皂苷的萃取率Y：

相比：R=\frac{V_{\mathrm{1}}}{V_{\mathrm{2}}}

分配系数：K=\frac{C_{\mathrm{1}}}{C_{\mathrm{2}}}

萃取率：Y=\frac{RK}{RK+\mathrm{1}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：V₁：上相体积（mL）；V₂：下相体积（mL）；C₁：上相皂苷的质量浓度（mg/mL）；C₂：下相皂苷的质量浓度（mg/mL）。

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 单因素试验

分别以无水乙醇质量分数、硫酸铵质量分数、粗提液质量分数、pH值为单一变量，对皂苷萃取率进行分析。按照1.3.1.2、1.3.1.3方法计算萃取率并绘制图表、解释分析。

1.3.2.2 响应面法优化试验

在单因素试验的基础上，选取对葡萄皮皂苷萃取率影响较大的3个因素，采用中心组合试验Box-Behnken 设计试验因素与水平（表1），采用Design Expert软件设计3因素3水平。并用响应曲面法对试验结果进行比较分析，确定各因素之间的交互作用对葡萄皮皂苷萃取率的影响，优化其萃取条件^［36-37］。

1.3.2.3 稳定性试验

取经优化工艺制备的同一样液，分别在25、35、45、55 ℃条件下，每隔2 h测其吸光值，以吸光值的变化反映温度对皂苷稳定性的影响；测定Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子在不同浓度下的吸光值，反映皂苷的金属离子稳定性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 无水乙醇质量分数对葡萄皮中皂苷萃取率的影响

选择无水乙醇的质量分数（V/V）分别为19%、21%、23%、25%、27%，硫酸铵质量分数24%，粗提液质量分数4%，pH值为6时，对葡萄皮皂苷萃取率进行研究。考察无水乙醇质量分数对皂苷萃取率的影响。如图1所示，皂苷萃取率和分配系数随着无水乙醇质量分数的增大呈现先增加后减少的趋势，于分配理论而言，当无水乙醇较少时，硫酸铵的盐析起主要作用，随着无水乙醇质量分数的增加，黏度增加，同时相界面的张力也增加，破坏双水相体系的稳定性，从而降低了皂苷的萃取率^［38］。由图1所示，当无水乙醇质量分数为21%时，分配系数和萃取率达到最高值，综合考虑确定无水乙醇的较佳质量分数为21%。

2.1.2 硫酸铵质量分数对葡萄皮中皂苷萃取率的影响

选择硫酸铵质量分数分别为18%、20%、22%、24%、26%，无水乙醇质量分数21%，粗提液质量分数4%，pH值为6时，对葡萄皮皂苷萃取率进行研究。考察硫酸铵质量分数对皂苷萃取率的影响。如图2所示，分配系数和皂苷萃取率随着硫酸铵质量分数的增加而增大，达到最大值后略有下降，主要原因是：随着硫酸铵质量分数的增加，双水相体系的分相能力逐渐增大，故皂苷萃取率会增大，但硫酸铵用量饱和后对萃取率影响不再有明显的影响；硫酸铵用量不同，上下相电位差也不同，而电位差大小影响萃取率和分配系数，当硫酸铵质量分数过高时，会破坏皂苷，从而使皂苷萃取率下降^［39］。因此，硫酸铵的较佳质量分数确定为24%。

2.1.3 粗提液质量分数对葡萄皮中皂苷萃取率的影响

选择粗提液质量分数为2%、4%、6%、8%、10%，无水乙醇质量分数21%，硫酸铵质量分数24%，pH值为6时，对葡萄皮皂苷萃取率进行测定。考察粗提液质量分数对皂苷萃取率的影响。如图3所示，分配系数和皂苷萃取率随着粗提液质量分数的增加呈现先增加后减小的趋势，可见，粗提液质量分数影响上下相的分配。当粗提液质量分数达到一定值时，由于皂苷的溶解性是一定的，只增加粗提液的质量分数，而在无水乙醇质量分数不变的情况下，不再溶解皂苷，增加粗提液质量分数，反而可能会使溶出量下降。综合考虑，确定较佳的粗提液质量分数为4%。

2.1.4 pH值对葡萄皮皂苷萃取率的影响

选择体系pH值分别为3、4、5、6、7，无水乙醇质量分数21%，硫酸铵质量分数24%，粗提液质量分数4%，对葡萄皮皂苷萃取率进行研究。考察pH值对皂苷萃取率的影响。体系pH值可以改变两相电位差，因此pH值对萃取物的分配影响较大^［2］。图4表明，分配系数和皂苷萃取率随pH值的增大呈现先增大后减小的趋势，pH值为6时分配系数和皂苷萃取率最高，因此确定较佳pH值为6。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 Box-Behnken设计响应面优化萃取条件及结果

根据单因素试验的结果，选取对葡萄皮皂苷萃取率影响较大的3个因素：粗提液质量分数（A）、pH值（B）、无水乙醇质量分数（C）分别为自变量，皂苷萃取率为响应值，在硫酸铵质量分数为24%的基础上进行试验设计。响应面试验设计及结果见表2。

2.2.2 回归模型的建立及方差分析

对Box-Behnken 响应面试验进行方差分析，结果见表3。

使用Design-Expert 8.0.6软件对表2、3数据进行多元回归拟合分析，建立葡萄皮皂苷萃取率工艺参数回归方程为：

Y=90.50+0.038A-1.19B+1.20C+0.50AB+2.58AC-0.68BC-7.48A²-4.48B²-11.45C²

由表3数据可知，模型P<0.000 1，说明回归方差分析模型显著，失拟项P值=0.888 1>0.05，差异不显著，说明皂苷萃取率的其他未知因素对试验结果的干扰程度小，试验误差小，该回归模型与实测值能较好的拟合，能很好的对响应值进行预测。变异系数（coefficient of variation，CV）=0.72%，较低，表明试验具有较好的可靠性；模型决定系数R²=0.997 7，说明响应值皂苷萃取率试验值和预测值间拟合度良好，校正系数R²_Adj=0.994 8，表明该模型能解释99.48%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，可用此模型来预测和分析葡萄皮中的皂苷萃取率。

从方差分析结果可以看出，该回归模型F检验非常显著（P<0.01），模型的一次项系数B（pH值）、C（无水乙醇质量分数）对皂苷萃取率（Y）的影响均为极显著（P<0.01），而A（粗提液质量分数）的影响不显著（P>0.05）；交互项AC对响应值的影响极显著（P<0.01），其他交互项均不显著（P>0.05）；二次项A²、B²、C² 均极显著（P<0.01）。由模型各因素的回归系数绝对值大小可知，3个因素对葡萄皮中皂苷萃取率影响的大小顺序依次是：C>B>A，即无水乙醇质量分数>pH值>粗提液质量分数。

2.2.3 响应面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6软件绘制粗提液质量分数、pH值、无水乙醇质量分数3个因素的交互作用对葡萄皮皂苷萃取率影响的响应曲面及等高线图（图5）。响应曲线图的曲线越平缓则表示影响越不显著，反之则亦然；等高线为圆形，表示交互作用不显著，等高线为椭圆形，则表示交互作用显著。该结果与回归方程方差分析结果一致。

2.3 验证试验

采用软件Design-Expert V 8.0.6对模型进行分析，获得葡萄皮皂苷萃取的最优条件为：粗提液质量分数4.02%，pH值5.86，无水乙醇质量分数21.11%。为验证结果的真实准确性及试验的实际操作考虑，将其修正为粗提液质量分数为4%，pH值6，无水乙醇质量分数为21%。在调整后的最佳萃取条件下进行3次平行验证试验，最终皂苷萃取率平均值为90.3%，这与预测值90.615 6%相接近，表明了模型的预测值与试验值拟合较高，试验结果准确可靠。

2.4 稳定性试验

2.4.1 温度对皂苷稳定性的影响

由图6可知，温度在45 ℃时吸光值变化幅度较小，说明在此温度下皂苷的稳定性好；而吸光值在25、35、55 ℃时都有大幅度的变化，皂苷有被破坏的迹象。

2.4.2 金属离子对皂苷稳定性的影响

由图7所示，不同的金属离子对皂苷的稳定性有一定的破坏，若吸光值变化幅度较小，说明皂苷的稳定好；若出现大幅度的变化，说明皂苷稳定性不好。因此，Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺对皂苷的稳定性都有不同程度的影响^［40］。

3 讨论

葡萄皮渣作为葡萄酒生产过程的主要废弃物，包括葡萄皮、葡萄籽及少量果肉，年产量近1 000万t。葡萄皮渣中含有多种有机质，可作为生产原料进一步开发利用^［41］。近年来，国外对葡萄皮渣的再利用已有较深的研究和了解，且部分研究成果已成功应用于工业化生产^［42-43］。我国将酒酿葡萄皮渣作为牲畜饲料、肥料甚至垃圾处理。造成了极大的资源浪费，同时污染生态环境。因此，对葡萄皮渣的综合开发利用具有重要的意义。

现代药理学研究表明，皂苷为糖的衍生物，具有祛痰止咳、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫能力、降血糖、降血脂、抗结石等多种功效。目前，天然产物的提取方法包括蒸馏、超声、微波辅助提取、超临界流体萃取及双水相萃取等。水蒸气蒸馏方法操作简便，但提取率低、耗时较长且操作温度高；超声、微波辅助提取方法对生产设备要求较高；超临界流体萃取具有高效、产生杂质少等优势，但该方法操作复杂且成本较高^［44-45］。双水相萃取操作条件温和，可在常温常压下进行，且设备简单。萃取两相易分散，传质速度快，不存在有机溶剂残留问题，绿色环保，适用于萃取生物活性物质^［46］。王婉丽等^［19］对倒心盾翅藤总皂苷进行提取工艺优化，评价了乙醇体积、料液比、提取时间及提取温度对皂苷得率的影响，同时证实了提取工艺的可行性。但双水相萃取葡萄皮皂苷的相关研究还未见文献报道。本试验选用双水相萃取方法，根据单因素试验及Box-Behnken响应面法考察乙醇质量分数、粗提液质量分数、pH值等对皂苷萃取率的影响，确定最佳的提取工艺，证明模型和提取工艺的稳定性及可行性。

4 结论

本试验采用双水相法萃取葡萄皮中的皂苷，根据单因素试验和Box-Behnken响应面分析法考察粗提液质量分数、pH值、无水乙醇质量分数对皂苷萃取率的影响，确定了萃取葡萄皮中皂苷的最佳条件：无水乙醇质量分数21%，粗提液质量分数4%，pH值6，萃取率为90.3%。并对优化后的皂苷进行稳定性研究，结果表明，45 ℃时皂苷稳定性最好，金属离子Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺的作用下都对皂苷的稳定性有影响。

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基金资助

甘肃省葡萄酒产业发展基金项目(GCJ-2019-125-1)

甘肃农业大学校列项目(GSAU-ZL-2018-8)