好氧高温堆肥中嗜热固氮菌的筛选及应用

Screening and utilization of thermophilic nitrogen-fixing bacteria during high temperature aerobic composting

摘要

目的 筛选好氧高温堆肥中的高效固氮微生物，并通过固氮微生物的添加提高堆肥含氮量，也为固氮菌生物有机肥的研制提供优质菌株。 方法 分别在好氧高温堆肥的高温期和成熟期采集样品，用Ashby无氮培养基分离固氮菌，测定菌株的固氮能力、最佳生长条件和生长曲线；通过对菌株的形态特征、生理特征和生化反应以及16s rRNA基因测序鉴定菌株，并将菌株回接到堆肥中研究其保氮效果。 结果 菌株A3和B2的固氮能力分别为7.88 mg/L和22.96 mg/L。结合形态特征、生理和生化鉴定及16s rRNA基因序列分析，A3和B2分别被鉴定为Nocardiopsis dassonvillei和Bacillus cereus。2个菌株均为嗜热广幅营养型细菌，能适应广泛的pH值并迅速生长，均可产生IAA和铁载体。B2可以利用有机磷，能耐8%的盐浓度。A3显著提高堆肥含氮量28.5%，但B2不能提高堆肥含氮量。 结论 A3（Nocardiopsis dassonvillei）可用于堆肥固氮菌提高堆肥含氮量并具有生产固氮菌生物有机肥的潜力。鉴于B2（Bacillus cereus）菌株良好的固氮能力和其他功能，具备研制微生物制剂的潜力。

Abstract

Objective The aim of this study was to screen high-efficiency nitrogen-fixing microbes from high-temperature aerobic compost，and to use the selected high-quality strains to improve the nitrogen content of compost，and to develop bioorganic fertilizers. Method Nitrogen fixing microbial strains were isolated using Ashby nitrogen-free medium from samples collected at the high temperature stage and the mature stage of aerobic high-temperature composting，and the nitrogen fixing ability，optimal growth conditions and growth curves of the microbes were determined.The strains were identified by morphological and physiological characterization，biochemical reactions and 16S rRNA gene sequencing，and the strains were then inoculated back into the compost mixture to study their effects Result The results showed that the nitrogen-fixing ability of the two isolated strains,A3 and B2，was 7.88 mg/L and 22.96 mg/L,respectively.A3 and B2 were identified as Nocardiopsis dassonvillei and Bacillus cereus,respectively.Both strains were eutrophic and thermophilic bacteria that could adapt to a wide range of pH and grow rapidly.Both strains were able to produce IAA and siderophore.In addition,B2 could utilize phosphorus,and tolerate salt concentrations of up to 8%.Only A3 was shown to significantly increase the nitrogen content of the compost product,by 28.5%,while B2 did not have the same effect. Conclusions A3 (Nocardiopsis dassonvillei) can be used to improve the nitrogen content of compost,and has the potential to produce nitrogen-fixing bacteria bioorganic fertilizers.Given the good nitrogen-fixing ability and other functions of B2 (Bacillus cereus),it has the potential to develop microbial agents.

Graphical abstract

关键词

堆肥 / 固氮菌 / 固氮能力 / 功能鉴定 / 堆肥含氮量

Key words

composting / nitrogen-fixing bacteria / nitrogen-fixing ability / functional identification / nitrogen content of compost

氮是农业生产中必不可少的元素，目前主要通过施肥和借助生物固氮来增加土壤中的氮素。化肥在提高作物产量的方面发挥着重要作用^［1］，然而长期大量施用化肥导致土壤酸化板结，影响土壤健康；此外，氮素通过各种途径损失破坏生态环境^［2］，加剧温室效应^［3］。生物固氮可以代替部分化肥氮，减少化肥氮的使用，是促进农业生产的绿色、可靠途径^［4-5］。固氮菌不仅给植物提供氮素^［6］，还可以活化土壤养分，影响土壤酶^［7-8］和重金属的活化吸收^［9］，从而影响植物生长。固氮菌也可作为堆肥添加剂，减少堆肥过程中氮的损失，提高堆肥质量^［10］，生产固氮菌生物有机肥。

特定生境和样品有利于分离出具有特定功能和适宜于特殊环境的微生物菌株^［11］。目前，研究者们从植物根系^［12］、土壤环境^［13］和水环境^［14］中，分离并鉴定出了大量固氮菌，主要有Azotobacter，Agrobacterium，Pseudomonas，Aquaspirillum Dietzia，Azospirillum，Dietzia，Neorhizobium，Klebsiella，Bacillus，Enterobacter，Serratia，Arthrobacter，Burkholderia，Fictibacillus，Fictibacillus rigui，Staphylococcusaureus^{［11，13，15-18］}等。然而，有关堆肥中固氮菌的筛选较少，且筛选于常规环境的固氮菌很难适应好氧堆肥的高温环境，导致其应用于堆肥的效果受到严重影响。因此，本研究从好氧高温堆肥中分离和鉴定高效嗜热固氮菌株，并将培养好的固氮菌株回接到堆肥中，以期提高堆肥含氮量和堆肥质量，为优质固氮菌生物有机肥的生产提供高效菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

将鸡粪与羊粪充分混匀，含水量调至（60±1）%，装箱至箱体的100%（60 cm×60 cm×45 cm的泡沫箱） ，敞口放置在校园带彩钢板顶的室外进行堆肥，堆肥时间为 2020年9月27日~2020年10月18日。每隔2 d进行翻堆混匀后取样。分别从高温期（第6天，65 ℃）的样品和腐熟期（第21天，10 ℃）的样品筛选嗜热固氮菌。

1.1.2 培养基

Ashby无氮培养基：甘露醇 10 g，H₂PO₄ 0.2 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO₄·2H₂O 0.1 g，CaCO₃ 5 g，1 000 mL去离子水，pH调至7.2~7.4，固体培养基则再加15~20 g琼脂。

LB富集培养基：胰蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，酵母膏 5 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.2~7.4。

糖发酵培养基：蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K₂HPO₄ 0.2 g，糖类（分别为葡萄糖、乳糖、蔗糖） 10 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.2~7.4。

葡萄糖蛋白胨液体培养基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 5 g，NaCl 5 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.2~7.4。

蛋白胨液体培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.2~7.4。

苯丙氨酸脱氨酶培养基：酵母膏3 g，NaCl 5 g，L-苯丙氨酸1 g，Na₂HPO₄ 1 g，琼脂15~20 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.2~7.4，分装试管。

西蒙斯（Simnos）氏柠檬酸盐培养基：柠檬酸钠 2 g，NaCl 5 g，MgSO₄·7 H₂O 0.2 g，（NH₄）₂HPO₄ 1 g，K₂HPO₄·3H₂O 1 g，1%麝香草酚蓝水溶液10 mL，琼脂15~20 g，去离子水1 000 mL。

明胶液化培养基：NaCl 5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏 3 g，明胶 120 g，去离子水1 000 mL，加热溶化后pH调至7.2~7.4。

碳源基础培养基：酵母膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，去离子水1 000 mL（碳源分别为：麦芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和甘露糖）。

氮源基础培养基：优化后的碳源 5 g，NaCl 5 g，去离子水1 000 mL（氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和玉米粉）。

CAS培养基：蔗糖 2 g，酸水解酪蛋白（SOLARBIO）3 g，磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.8） 5 mL，CaCl₂ （1 mmol/L） 1 mL，CAS检测液250 mL，琼脂 40 g，去离子水 1 000 mL。

无机磷基本培养基：Ca₃（PO₄）₂ 10.0 g，葡萄糖 10.0 g，MgSO₄ 0.3 g，KCl 0.3 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.3 g，FeSO₄ 0.03 g，MnSO₄ 0.03 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.0~7.5。

PVK培养基：葡糖糖 10.0 g，Ca₃（PO₄）₂ 5.0 g，（NH₄）₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO₄·7H₂O 0.1 g，KCl 0.2 g，酵母粉 0.5 g，MnSO₄ 0.002 g，FeSO₄ 0.002 g，0.4%溴酚蓝溶液 0.6 g/L，琼脂 18.0 g，去离子水1 000 mL，pH调至7.0~7.2。

有机磷培养基：葡萄糖 10.0 g，（NH₄）₂SO₄ 0.2 g，MgCl₂ 5.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 0.1 g，植酸钙 2.0 g，去离子水 1 000 mL。

1.2 固氮菌的分离、纯化与生理生化鉴定

1.2.1 固氮菌的分离和纯化

称取5 g样品，用无菌水制成10^-1、10^-3、10^-5、10^-7和10^-9的菌悬液后均匀的涂布于Ashby无氮培养基上，培养5~7 d后，选取长势好的菌株分别接种到新鲜的无氮培养基上，并连续进行4~5次的划线纯化，直至出现单菌落，继续纯化。将纯化好的菌株于4 ℃斜面保存^［19］。

1.2.2 菌株形态和生理生化鉴定

将保存的菌株接种于LB固体培养基培养2~3 d，观察菌落形态（包括形状、颜色、表面干湿情况），并进行记录。将菌株进行革兰氏染色后在光学显微镜下观察革兰氏染色的结果等^［20］。通过糖类发酵试验、乙酰甲基甲醇试验（Voges-Prokauer 试验）、甲基红试验（Methyl red 试验）、吲哚试验、苯丙氨酸脱氨酶测定、柠檬酸盐利用试验以及明胶液化试验^［15］，结合Bergey细菌手册^［21］初步鉴定分离的菌株。

1.3 菌株固氮能力的测定

菌株固氮能力的测定参考改进的碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法^［22］。将菌株在Ashby无氮培养基中培养7 d，离心后取1 mL上清液置于比色管中，用无氨水定容至10 mL，加入碱性K₂S₂O₄（经重结晶得到）溶液后于121 ℃下消解45 min，冷却后加入1 mL 10% HCl溶液，用无氨水定容至25 mL，分别在波长220 nm和275 nm处测吸光度。以10 mL无氨水代替样品溶液作为空白，标准曲线使用 KNO₃ 标准液测定。依据下式结合标准曲线计算固氮量：

Ar=（A_s220-2A_s275）-（A_b220-2A_b275）

标准曲线：y=0.069 2x-0.000 9，R²=0.999 7

式中：A_s220和A_s275表示样品溶液分别在波长220 nm和275 nm下的吸光度；A_b220和A_b275分别表示空白溶液在波长220 nm和275 nm处的吸光度。Ar表示样品溶液校正吸光度与空白溶液校正吸光度的差。

1.4 菌株最适生长条件和生长曲线的测定

固氮菌最适生长条件测定参考贾辉等^［23］的方法，包括最适温度、pH、盐浓度和碳氮源的测定。生长曲线的测定参考Omotoyinbo等^［24］的方法。

1.5 菌株功能性的测定

1.5.1 固氮菌产IAA能力测定

参考Glickmann等^［25］的方法，采用Salkowski比色法测定菌株产IAA的能力。将细菌在含有2.45 mmol/L L-色氨酸的LB培养基中培养3 d，离心后取1 mL上清液，加入2 mL Salkowski试剂，室温暗处显色30 min 后，于530 nm处测吸光度。用3-IAA标准品制作标准曲线，方程为：y=0.112 9x-0.019 4，R²=0.999 1。

1.5.2 产铁载体能力测定

参考Schwyn等^［26］的方法。将菌株接种到CAS液体培养基上，于30 ℃培养3 d，若培养基变为橙色，则表示具有产铁载体的能力。

1.5.3 无机磷利用能力测定

将菌株在PVK培养基划线培养3 d后，划线部分呈蓝色，则表示该种菌可以降解无机磷。将初筛的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，培养1 d后取200 mL菌悬液接种于50 mL无机磷培养基上培养7 d，离心后取上清液1.25 mL于比色管中，用钼锑抗比色法^［27］测定上清液磷含量。用标准磷溶液制作标准曲线，方程为：y=0.694 5x+0.016 8，R²=0.999 5。

1.5.4 有机磷降解能力测定

参考王欢等^［28］的方法，将菌株点布于有机磷固体培养基上，若有解磷圈出现，则说明该种细菌具有降解有机磷的能力。记录解磷圈直径（HD）和菌落直径（CD），并计算HD/CD。

1.6 菌株分子鉴定

将分离出来的 2 株细菌分别接种于琼脂平板上，于37 ℃，含5% CO₂的大气中培养后，放入37 ℃的液体培养基中搅拌。根据制造商的说明，使用细菌DNA试剂盒（OMEGA）从细胞颗粒中分离出基因组DNA样本，随后对纯化的DNA样本进行质量控制。使用TBS-380荧光计（特纳生物系统公司，加利福尼亚州桑尼维尔）对基因组DNA进行定量。利用高质量的DNA样本（D_260/280=1.8~2.0，>6 μg）构建片段文库。测序工作由上海Biozeron生物技术有限公司（中国上海）进行。对每个菌株的Illumina对末端测序，用至少1 μg基因组DNA 进行测序文库的构建。按照Illumina的标准基因组DNA文库制备程序，制备插入大小约为400 bp的成对末端文库。通过Covaris将纯化的基因组DNA剪切成所需大小的较小片段，并使用T4 DNA聚合酶生成钝端。在钝性磷酸化DNA片段的3'端添加“A”碱基后，将转接器连接到DNA片段的末端。所需片段可通过凝胶电泳纯化，然后通过PCR选择性富集和扩增，并进行了文库质量测试。合格的Illumina对端文库将用于Illumina NovaSeq 6000测序（150 bp×2，上海BIOZERON有限公司）。Trimmomatic通过参数（version0.36http：//www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic）对原始配对末端读数进行修剪，并对质量进行控制从而获得的干净数据。使用 ABySS（http：//www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss）对多个Kmer参数进行基因组组装，得到了最佳的组装结果。随后应用GapCloser软件（https：//sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/）填补剩余的局部内部空白，并纠正最终组装结果的单碱基多态性。

1.7 固氮菌株对堆肥保氮能力的影响

将培养到10⁹ CFU的菌液按照10%（V/m）加入到羊粪中进行堆肥（60 cm×60 cm×45 cm泡沫箱），以无菌培养基为对照，共3个处理，分别记作CK、A3和B2。每个处理重复3箱，含水率调至（60±1）%。堆肥时间为2021年8月28日~2021年9月15日。所有处理每隔2 d翻堆一次。于堆肥最后1 d取样测定全氮量（TN）。

1.8 数据处理

试验数据由Excel 2016处理和绘图。通过ab initio预测方法获得2株细菌的基因模型，并用 GeneMark 鉴定。然后将所有基因模型与非冗余，即NCBI中的NR 数据库、SwissProt （http：//uniprot.org）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）和（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）进行blastp模块的功能注释，结合 Gene Ontology（http：//www.geneontology.org），通过eggnog-mapper （v5.0）比对，从而标准化这些生物功能注 释术语。此外，使用tRNAscan SE （v1.23，http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE）鉴定tRNA，使用RNAmmer （v1.2，http：//www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/）测定rRNA。用Core基因分析结果构建系统发育树。原始数据上传到NCBI数据库，接收号为SUB11167856和SUB11167868。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学和生理生化特征

从高温期和腐熟期的堆肥样品中初步分离出11株固氮菌，根据对固氮能力的测定，最终筛选出2株高效固氮菌（分别用A3和B2表示），A3为放线菌，B2为细菌。2株固氮菌的形态特征如图1所示。A3的菌落呈菌丝生长，颜色呈灰色，菌落边缘颜色较浅为白色，质地干燥易挑起；B2的菌落均呈圆形，白色，表面呈蜡状，菌落湿润，边缘完整。

生理生化测定结果显示，A3为革兰氏阴性菌，B2为革兰氏阳性菌。A3和B2均可以使葡萄糖、乳糖、蔗糖产酸，其中B2产酸并产气。VP试验中，A3和B2均为阴性。MR试验中，B2为阳性，A3为阴性。2种菌均具有色氨酸酶，可以分解色氨酸产生吲哚。两种菌株均不能利用柠檬酸盐，也不具有苯胺酸脱氢酶。B2具有类蛋白水解酶，可以使明胶液化。因此，初步判定A3属于Nocardiopsis属，B2属于Bacillus属。

2.2 菌株的固氮能力

固氮菌的固氮能力强弱直接决定了其应用前景。2株固氮菌培养7 d的固氮量如图2所示。A3和B2的固氮量分别为7.88 mg/L和22.96 mg/L，B2菌株的固氮能力较强。

2.3 菌株的最适生长条件和生长曲线

图3显示了2株固氮菌的最适生长条件和生长曲线。2株固氮菌最适生长温度均为45 ℃，属于嗜热菌^［29-30］； B2的最适pH为7，A3的最适pH为10，2株固氮菌在pH 5~10内均有生理活性，表明它们对pH的适应范围较广；A3和B2均有一定的耐盐性，B2的耐盐性较高。以麦芽糖和酵母膏分别作为碳氮源时，2株固氮菌生长情况最好，但在其他碳氮源中也能生长良好，说明它们是广幅营养性细菌。A3在20 h达到稳定期，B2在22 h达到稳定期，表明2种菌株都可以快速生长与繁殖。

2.4 菌株的功能性

2株菌株的功能性测定结果见表2。2株菌株均有产IAA的能力，A3和B2在3 d内产生的IAA分别为3.76 mg/L和1.60 mg/L；A3和B2在PVK培养基上划线培养3 d后，B2培养基划线呈蓝色，说明B2能降解无机磷，定量分析B2的无机磷溶解能力为1.76 mg/L；在有机磷培养基上培养3 d后，B2出现磷解圈，说明其具有降解有机磷的能力。2株菌株在CAS培养基中培养4~7 d后，2株菌的培养基由蓝变黄，说明其具有产铁载体的能力。

2.5 菌株的鉴定

16S rRNA基因测序的菌株系统进化树如图4。菌株A3为达氏拟诺卡氏菌（Nocardiopsis dassonvillei），B2为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

2.6 菌株的功能注释

GO注释结果如表3所示，2种微生物均有固氮基因（nif）和固氮酶，证明这2种微生物均为固氮菌。B2和A3具有NifU、NifB、NifS固氮基因及其编码的固氮酶，并且B2具有一氧化氮双加氧酶（NOD），在有氧过程中参与NO解毒，称为一氧化氮双加氧酶反应，可以利用O₂和NAD（P）H将NO转化为硝酸盐，不仅保护细菌免受各种有毒氮化合物的伤害，还可以将NO转化为硝酸盐固定下来，但NOD的酶活性受到同源还原酶的制约，因此A4能否将NO转化为硝酸盐还需进一步研究^［31］。A1和B2具有转导组氨酸激酶NtrY，参与菌株的固氮和调节氮代谢。

除了固氮功能外，2株细菌还拥有其他具有利用价值的功能（表4~5）。2种菌株均具有色氨酸酶（tryptophan，IAA的前体），参与了IAA的合成。2株菌都具有铁载体代谢基因和铁载体合成酶；B2具有参与代谢磷酸盐的酶，这与上述功能性测定结果相符。A3具有代谢重金属的功能，可以代谢Cr⁶⁺，有Pb、Cd、Co、Ni的抗性基因；B2没有代谢重金属的功能，但有Mo、Ni、Co、Hg、Cr、As、Mn的抗性基因。因此A3菌株有修复重金属污染土壤的潜能。除此之外，B2还具有代谢钾、镁盐的功能，并且在菌株的生长条件测定中，B2的耐盐能力最强，可在8%盐浓度的培养基中生长。

2.7 菌株对堆肥保氮能力的影响

堆肥过程中有机氮的矿化和硝态氮的反硝化（NH₃和N₂O）造成氮的损失^［32］，而固氮菌的添加可以减少堆肥过程中的氮素损失^［10］。2种菌株对堆肥的保氮能力见图5。结果表明，堆肥过程中，A3处理的堆肥含氮量较CK分别提高28.5%，而B2菌株堆肥的含氮量较CK没有显著差异。表明A3菌株具有良好的堆肥保氮能力。

3 讨论

本研究从高温期和成熟期的堆肥样品中分离出2株嗜热型固氮菌株，固氮量分别为7.88 mg/L和22.96 mg/L，从玉米根际分离出的固氮菌Alcaligenes faecalis的固氮能力为11.4 mg/L；从碱性土壤分离出的P.Borealis固氮能力为18.73 mg/L，但大多数固氮菌的固氮能力在6~10 mg/L^［12-13］，因此本研究分离出的2株固氮菌均有良好的固氮能力。经过测序，2株固氮菌分别被鉴定为达氏拟诺卡氏菌（Nocardiopsis dassonvillei）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），其中蜡样芽孢杆菌是已被证实的固氮菌^［33-35］。

固氮菌是一种典型的中温生物，一般在25~30 ℃的最适温度下生长，土壤中的少数固氮菌可以在0 ℃生长。当温度高于35 ℃时，固氮菌的生长速度会减缓，并通过萌发囊肿在高温下存活^［6］。固氮菌群的存在受pH值控制，通常固氮菌的最适生长pH为7~7.5，而较低的pH值（<6.0）会减少固氮菌群，甚至会完全抑制其生长。本研究所筛选的2株固氮菌最适温度均为45 ℃，在20~55 ℃均能生长；2株固氮菌在pH5~10内均有活性，对pH的适应范围较广。在堆肥过程中的pH值一般在6.5~8.5^［36］，这与分离出的固氮菌适应范围一致，有利于固氮菌的新陈代谢。2株菌均有一定的耐盐性，其中，B2（Bacillus cereus）最适盐浓度可达8%。因此，2种固氮菌对环境条件的适应范围较广，不仅可以作为堆肥添加剂，还具有其他应用前景。

PGPB促进植物生长的机制可以分为直接作用和间接作用，前者是指微生物合成的IAA和赤霉素等可以直接促进植物的生长，或改变土壤中某些元素的形态，从而促进植物吸收，比如固氮、溶磷等。间接作用是指菌株产生的某些物质（如铁载体和ACC等）能够抑制或降低如缺铁，植物病害和乙烯过量等不利因素对植物生长和产量的影响^［36］。在本研究中，A3（Nocardiopsis dassonvillei）和B2（Bacillus cereus）均具有产铁载体的能力。铁载体是植物促生菌中确认的对抗性生物控制剂的机制之一^［37-38］，具有产铁载体能力的菌株可以开发为植物病原体的有效生物控制剂。并且铁载体可以与土壤中的重金属离子螯合，形成可溶的重金属-铁载体螯合物，从而增加重金属的活性^［38］。其中，B2具有溶磷能力。磷酸盐溶解能力是微生物的重要功能，解磷菌通过促进有机肥的转化和不溶性磷酸盐的利用来改善磷的活性，可以减少磷肥的施用^［39］。除此之外，功能基因鉴定结果显示A3（Nocardiopsis dassonvillei）和B2（Bacillus cereus）具有ACC脱氨酶（1-aminocyclopropane1-carboxylate）。ACC脱氨酶是固氮菌的一个重要特性，ACC脱氨酶负责植物乙烯前体ACC分解为氨和酮丁酸，从而降低植物中的ACC水平^［40］。金属抗性基因注释（BacMet）结果显示，A3有Pb、Cd、Co、Ni的抗性基因，并且可以代谢Cr⁶⁺；B2有Mo、Ni、Co、Hg、Cr、As、Mn的抗性基因。因此A3菌株有修复重金属污染土壤的潜能。金属抗性基因可以使得A3和B2更好地适应环境中重金属的胁迫。

在堆肥中接种微生物已被认为是一种清洁、有效地减少堆肥过程中氮损失的方法^［41］。然而，由于堆肥环境中本身存在大量土著微生物，外源微生物进入堆肥后面临微生物之间竞争的不确定性，导致微生物制剂对氮素的保留效果难以控制^［42］。本研究结果表明，堆肥中添加A3菌株后，相较CK堆肥含氮量提高了28.5%，而添加B2菌株对堆肥含氮量没有显著影响；但2种菌株的固氮能力显示，B2菌株的固氮能力显著高于A3菌株。由此说明，外源固氮菌添加到堆肥中的演替和定殖是一个复杂的过程，即使是筛选于堆肥的固氮菌也不是都能够提高堆肥的含氮量。当外源微生物添加到堆肥中可能由于土著优势微生物的激烈竞争而影响其生长和繁殖，详细机理还有待于进一步深入研究。因此，对于堆肥中固氮菌的筛选不能单纯看其固氮能力，更应看其实际应用的效果。

4 结论

菌株A3（Nocardiopsis dassonvillei）和B2（Bacillus cereus）都具有较强的固氮能力，并具有一定的促生，生防和防治土壤污染方面的功能。A3（Nocardiopsis dassonvillei）可用作堆肥添加剂，提高堆肥中的氮素含量，生产固氮菌生物有机肥；而B2（Bacillus cereus）不具有提高堆肥中氮素含量的能力。但由于B2菌株良好的固氮能力和其他功能，具备研制微生物制剂的基础，还需要进一步深入研究。

参考文献

[1] Kumar P， Brar S K， Pandove G，et al.Bioformulation of Azotobacter spp.and Streptomyces badius on the productivity，economics and energetics of wheat （Triticum aestivum L.）［J］.Energy，2021，232：120868.

[2] Choudhury A， Yusop M K.Evaluation of effects of nitrogen and magnesium fertilization on rice yield and fertilizer nitrogen efficiency using 15N tracer technique［J］.Journal of Plant Nutrition，2001，24（6）：855-871.

[3] Choudhury A， Kennedy I R.Nitrogen fertilizer losses from rice soils and control of environmental pollution problems［J］.Communications in Soil Science and Plant Analysis，2005，36：1625-1639.

[4] Hadija， Kuswinanti T， Jayadi M，et al.Isolation，characterization and identification of nitrogen fixing bacteria with organic fertilizer applications in paddy soil［J］.Earth and Environmental Science，2021，807（2）：22-24.

[5] 赵伟进，张格杰，王孝先，等.高原地区联合固氮菌肥对黑青稞的促生效应［J］.甘肃农业大学学报，2019，54（6）：55-61.

[6] Aasfar A， Bargaz A， Yaakoubi K，et al.Nitrogen fixing azotobacter species as potential soil biological enhancers for crop nutrition and yield stability［J］.Front Microbiol，2021，12：628379.

[7] Din M， Nelofer R， Salman M，et al.Production of nitrogen fixing Azotobacter （SR-4） and phosphorus solubilizing Aspergillus niger and their evaluation on Lagenaria siceraria and Abelmoschus esculentus ［J］.Biotechnol Reports，2019，22：1-4.

[8] Velmourougane K， Prasanna R， Chawla G，et al.Trichoderma-Azotobacterbiofilm inoculation improves soil nutrient availability and plant growth in wheat and cotton［J］.Journal of Basic Microbiology，2019，59：632-644.

[9] Kizilkaya R.Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp.strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiological properties of soils［J］.Journal of Environmental Biology，2009，30（1）：73-82.

[10] Qiu Z， Li M， Song L，et al.Study on nitrogen-retaining microbial agent to reduce nitrogen loss during chicken manure composting and nitrogen transformation mechanis［J］.Journal of Cleaner Production，2020，285：124813.

[11] Eckford R， D.Cook F， Saul D，et al.Free-living heterotrophic nitrogen-fixing bacteria isolated from fuel-contaminated antarctic soils［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（10）：5181-5185.

[12] Akintokun A K， Ezaka E， Akintokun P O，et al.Isolation，screening and response of maize to plant growth promoting Rhizobacteria inoculants［J］.Scientia Agriculturae Bohemica，2019，50（3）：181-190.

[13] Smita M， Goyal D.Isolation and characterization of free-living nitrogen fixing bacteria from alkaline soils［J］.International Journal of Scientific World，2017，5（1）：18-22.

[14] Wafula E N， Murunga S I.Isolation and identification of phosphate solubilizing and nitrogen-fixing bacteria from lake Ol’Bolossat Sediments，Kenya［J］.Modern Applied Science，2020，14（10）：37-51.

[15] Akin-Osanaiye B C， Arowolo O O， Olobayotan I W.Isolation and identification of microorganisms growing on the root of leguminous plants （groundnut，soya bean and pea）［J］.Asian Journal of Biochemistry，Genetics and Molecular Biology，2019，2（3）：1-7.

[16] Dolatabadian A， Sanavy S a M M， Ghanati F，et al. Agrobacterium rhizogenes transformed soybean roots differ in their nodulation and nitrogen fixation response to genistein and salt stress［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29（7）：1327-1339.

[17] Doolittle M， Ashok R， Alan L，et al.Presence of nitrogen fixing Klebsiella pneumoniae in the gut of the Formosan subterranean termite （Coptotermes formosanus）［J］.Bioresource technology，2008，99（8）：3297-3300.

[18] 曹晶晶，熊悯梓，钞亚鹏，等.极耐盐碱固氮菌的分离鉴定及固氮特性研究［J］.微生物学报，2021，61（11）：3483-3495.

[19] 徐德强，王英明，周德庆.微生物学实验教程 ［M］.4版.北京：高等教育出版社，2019：223-224.

[20] Gram H C.The differential staining of Schizomycetes in tissue sections and in dried preparations［J］.General Microbiology，1884，2：185-189.

[21] Cowan S T.Bergey's manual of determinative bacteriology［J］.Nature，1948，162：833.

[22] 杨帆，赵坤，郭永霞，等.微生物促腐剂配施固氮蓝澡对水稻秸秆腐解的影响［J］.南方农业学报，2019，50（11）：2421-2428.

[23] 贾辉，陈秀蓉，芦光新，等.纤维素降解细菌的筛选、生物学特性及降解效果［J］.草业学报，2016，25（3）：60-66.

[24] Omotoyinbo O， Omotoyinbo B.Effect of varying NaCl concentrations on the growth curve of escherichia coli and staphylococcus aureus［J］.Cell Biology，2016，4（5）：31-34.

[25] Glickmann E， Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria［J］.Applied and Environmental Microbiology，1995，61（2）：793-796.

[26] Bernhard S， Neilands J B.Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores［J］.Academic Press，1987，160（1）：47-56.

[27] Shidan B.Soil agro-chemistrical analysis.［M］.3rd edition.Beijing：China Agriculture Press，2000：495.

[28] 王欢，王敬敬，徐松，等.有机磷降解菌的筛选及其促生特性［J］.微生物学报，2017，57（5）：667-680.

[29] Rothschild L J， Mancinelli R L.Life in extreme environments［J］.Nature，2001，409：1092-1101.

[30] 张凤琴.庐江汤池温泉中首个嗜热菌的分离鉴定及特性研究［J］.安庆师范大学学报（自然科学版），2020，26（2）：117-121.

[31] Smagghe B J， Trent J T， Hargrove M S.NO dioxygenase activity in hemoglobins is ubiquitous in vitro，but limited by reduction in vivo［J］.PLoS One，2008，3（4）：e2039.

[32] Beck-Friis B， Smårs S， Jönsson H，et al.SE-Structures and environment：gaseous emissions of carbon dioxide，ammonia and nitrous oxide from organic household waste in a compost reactor under different temperature regimes［J］.Journal of Agricultural Engineering Research，2001，78（4）：423-430.

[33] Crovadore J， Cochard B， Chablais R，et al.Draft genome sequences of pseudomonas koreensis Strain UASWS1668，Bacillus megaterium strain UASWS1667，and Paenibacillus sp.strain UASWS1643，considered potential plant growth-promoting Rhizobacteria［J］.Microbiology Resource Announcements，2020，9（33）：1-3.

[34] Lim J H， Kim S D.Synergistic plant growth promotion by the Indigenous auxins-producing PGPR Bacillus subtilis AH18 and Bacillus licheniforims K11［J］.Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2009，52（5）：531-538.

[35] Zelaya-Molina L X， Hernández-Soto L M， Guerra-Camacho J E，et al.Ammonia-oligotrophic and diazotrophic heavy metal-resistant serratia liquefaciens strains from pioneer plants and mine tailings［J］.Microb Ecology，2016，72（2）：324-346.

[36] 王亚军，冯炬威，李雅倩，等.高产铁载体菌Burkholderia vietnamiensis YQ9促生特性研究及其对重金属胁迫条件下种子萌发的影响［J］.环境科学学报，2022，42（2）：430-437.

[37] Sinha A K， Parli B V.Siderophore production by bacteria isolated from mangrove sediments：a microcosm study［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2019，154：151290.

[38] Yang M M， Mavrodi D V， Mavrodi O V，et al.Biological control of take-all by fluorescent Pseudomonas spp.from Chinese wheat fields［J］.Phytopathology，2011，101（12）：1484-1491.

[39] Ilhem S， Amor M， Raoudha F，et al.The impact of the inoculation of phosphate-solubilizing bacteria pantoea agglomerans on phosphorus availability and bacterial community dynamics of a semi-arid soil［J］.Microorganisms，2021，9（8）：1661.

[40] Glick B R， Todorovic B， Czarny J，et al.Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase［J］.Crit Rev Plant，2007，26：227-242.

[41] Li S Y， Li J J， Yuan J，et al.The influences of inoculants from municipal sludge and solid waste on compost stability，maturity and enzyme activities during chicken manure composting［J］.Environmental Technology，2017，38（13/14）：1770-1778.

[42] Shan G C， Li W G， Gao Y J，et al.Additives for reducing nitrogen loss during composting：A review.［J］.Journal of Cleaner Production，2021，307：127308.

基金资助

甘肃农业大学青年导师基金项目(GAU-QDFC-2021-19)

甘肃农业大学学科建设基金项目(GAU-XKJS-2018-212)

甘肃省自然科学基金项目(18JR3RA180)