陇藜1号籽实多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究

Extraction techniques and antioxidant activity of Longquinoa 1 polysaccharides from seeds

摘要

目的 优化纤维素酶对未脱壳藜麦籽实多糖提取工艺，并评价藜麦籽实多糖的抗氧化活性。 方法 以陇藜1号藜麦籽实为试验材料，经粉碎过筛、脱脂等，采用纤维素酶酶解，在单因素试验的基础上，设计了提取温度、料液比、提取时间、酶浓度的4因素3水平响应面优化试验，并研究了多糖对羟自由基、DPPH和ABTS⁺自由基的清除率。 结果 在温度60℃、料液比1∶20、时间2.0 h、酶浓度5%的条件下，多糖的提取效果最佳，为5.16%。藜麦多糖对羟自由基、DPPH自由基清除率分别为60.55%和44.04%；对ABTS⁺自由基清除率为9.09%。 结论 研究结果为藜麦籽实多糖提取及开发利用提供了试验依据。

Abstract

Objective To optimize the extraction process of unhulled quinoa seed polysaccharides by cellulase and evaluate its antioxidant activity. Method Enzymatic hydrolysis crushed，sieved and defatted quinoa seeds with cellulase based on the single-factor test，the four-factor three-level response surface optimization test of extraction temperature，material-to-liquid ratio，extraction time and enzyme concentration was carried out，and the scavenging rate of polysaccharides on hydroxyl radicals，DPPH and ABTS+ radicals was studied. Result The best extraction effect was achieved at a temperature of 60 ℃,a material-to-liquid ratio of 1∶20,a time of 2.0 h and an enzyme concentration of 5%,and the extraction rate could reach 5.16%.The scavenging rates of quinoa polysaccharide on hydroxyl radical and DPPH radical were 60.55% and 44.04%,respectively，and the effect was remarkable.The radical scavenging rate of ABTS+ was 9.09%. Conclusion This study provides a basis for the extraction and utilization of quinoa polysaccharides.

Graphical abstract

关键词

藜麦 / 多糖提取 / 响应面设计 / 抗氧化活性

Key words

quinoa / polysaccharide extraction / response surface methodology / antioxidant activity

2021年中国藜麦种植面积约2万hm²，其中甘肃省的种植面积1万hm²，陇藜1号是甘肃的主栽品种^［1］。多糖是构成生物体生命活动所需要的重要营养物质之一，具有抗癌、预防心脑血管疾病、缓解疲劳和抗氧化等功效。有关对藜麦多糖提取、纯化和含量测定等方面的研究主要集中在藜麦叶、秸秆及藜麦米方面^［2］。如蒋玉蓉等^［3］研究结果表明，藜麦叶片多糖的提取率可达到6.101 3 g/100 g，对DPPH和羟自由基的IC₅₀（半抑制浓度）分别为31.96 μg/mL和157.62 μg/mL。郝晓华等^［4］采用微波技术从藜麦秸秆中萃取多糖，提取率为1.93%，多糖对 DPPH和羟自由基的清除率为71.09%和29.72%。李佳妮等^［5］采用酶解-超声联合萃取藜麦多糖，并测定其对羟自由基、 DPPH和 ABTS⁺自由基的清除作用，发现多糖溶液对羟自由基清除率较高，对 DPPH和 ABTS⁺自由基无明显清除效果。目前对未脱壳的陇藜1号藜麦籽实多糖的提取及抗氧化研究尚未见报道，未脱壳藜麦籽实直接提取多糖，可省去砻谷工序。

本研究以陇藜1号未脱壳的籽实为试验材料，在单因素试验的基础上，采用4因素3水平响应面设计对纤维素酶提取藜麦籽实多糖的工艺参数进行优化，并对其抗氧化性进行研究，旨在为未脱壳的陇藜1号多糖提取和进一步利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

陇藜1号购自甘肃省藜美农业科技有限公司。

1.2 试剂

纤维素酶（晟发食品科技有限公司，活力10⁵ U/g），葡萄糖、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸均为分析纯（天津光复科技发展有限公司）；苯酚、浓硫酸、石油醚、考马斯亮蓝-G250均为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）。

1.3 仪器

DGG9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；JA2003型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；DKS26型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；GT101型高速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； STSJB-1000型电动搅拌器（上海索廷智能设备股份有限公司）；Lyo Quest-85型真空冷冻干燥机（河南兄弟仪器设备有限公司）；1510酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；FTIR920傅里叶变换红外光谱仪（天津市拓普仪器有限公司）

1.4 试验方法

1.4.1 藜麦多糖的提取

流程：藜麦粒→粉碎→过筛→脱脂→风干→加去离子水→调pH值至5→控制温度、时间、料液比、酶浓度→水浴磁力搅拌→离心→收集上清液→醇沉收集沉淀→计算藜麦多糖提取率。

1.4.2 单因素试验

参考郭怡等^［6］的方法，在温度为60 ℃、时间为1.5 h，料液比为1∶35、纤维素酶用量为3%的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，设置料液比分别为1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55；温度为40、50、60、70、80 ℃；时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h；酶浓度为1%、3%、5%、7%、9%。通过苯酚-硫酸法测多糖浓度，计算提取率，每组试验重复3次。

1.4.3 响应面试验

以单因素试验最佳提取条件作为自变量，以多糖的提取率作为响应值，对纤维素酶法提取藜麦多糖进行4因素3水平响应面试验，具体试验设计内容见表1。

1.5 标准曲线制备

参考罗春萍等^［7］的方法，将200 mg干燥葡萄糖标品溶解，100 mL容量瓶定容。吸取1、2、3、4、5 mL移入100 mL容量瓶再次定容，取2 mL离心管分别添加200 μL不同浓度的标液、200 μL 6%的苯酚溶液和700 μL 浓硫酸，60 ℃水浴15 min，冷却至室温。在485 nm下测吸光值，测定3次，取平均值，绘制标准曲线。

1.6 多糖含量测定及提取率计算

采用苯酚-硫酸法，取200 μL稀释的多糖待测液，蒸馏水作空白对照，在485 nm处测定吸光值，取3次平均值。

藜麦多糖提取率（%）=\frac{C\times V\times N}{M}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：C为多糖浓度；V为样品定容后的体积（mL）；N为稀释倍数；M为藜麦籽实质量（mg）。

1.7 分离与纯化

将粗多糖液pH值调至5.0，加入3%的木瓜蛋白酶，60 ℃水浴酶解1 h，然后煮沸灭酶，离心，取上清液在截留量为1 000 U的透析袋中透析24 h，减压浓缩。配制Sevage试剂（氯仿-正丁醇=4∶1），加入五倍体积多糖溶液，震荡20 min，4 000 r/min离心5 min，取上层水相4次，加乙醇至上层水相含醇量为80%，4 ℃过夜静置，沉淀离心加蒸馏水复溶，真空冻干。

1.8 红外与紫外光谱分析

参考张彩梅等^［8］方法，取2 mg多糖粉末，与150 mg溴化钾混合研磨均匀后压片，在波长500~4 000 cm^-1的范围内进行红外光谱仪扫描。

用2 mL的蒸馏水将20 mg多糖粉末溶解，用紫外线分光光度计在220~700 nm的波长下进行检测。

1.9 抗氧化性测定

1.9.1 羟自由基清除力

参考Teng等^［9］方法，取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL多糖溶液2 mL，加入6 mmol/L硫酸亚铁溶液2 mL，静置10 min，加入6 mmol/L水杨酸溶液2mL，静置30 min，在510 nm测定吸光度。

清除率S(\mathrm{\%})=\left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{i}}-A_{\mathrm{j}}}{A_{\mathrm{0}}}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：A_i 为样液吸光值；A_j 为蒸馏水替代水杨酸吸光值；A₀为蒸馏水替代样液吸光值。

1.9.2 DPPH自由基清除率

参考Tan等^［9］方法，取4 mL 0.2 mmol/LDPPH-无水乙醇溶液与2 mL浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液分别混合，25 ℃避光反应30 min，517 nm波长测定吸光度，计算清除率。

清除率S(\mathrm{\%})=\left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{x}}-A_{\mathrm{y}}}{A_{\mathrm{0}}}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：A_x 为以乙醇溶液代替DPPH自由基测得背景对照；A_y为再以蒸馏水代替多糖溶液测得空白对照A₀。

1.9.3 ABTS⁺自由基清除率测定

参考Teng等^［9］方法，取25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L过硫酸钾混合，避光静置12~16 h，用无水乙醇稀释成工作液，在734 nm所测吸光度记为A_r（0.7±0.02）。取0.1 mL梯度浓度多糖提取液（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL），加入ABTS⁺工作液5 mL，避光反应10 min，734 nm所测吸光度，记为A_t。以无水乙醇代替ABTS⁺工作液所测吸光度记为A₀。

清除率S（%）=\left(\mathrm{1}-\frac{A_t-A_{\mathrm{0}}}{A_r}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.10 数据处理

采用SPSS、Origin、Expert 8.0.6对数据处理分析和制图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线见图1。线性回归方程为：

y=0.001 8x+0.003 4，R²=0.999 4

由R²=0.999 4，拟合度高。

2.2 单因素试验

2.2.1 时间对提取率的影响

图2所示，提取时间在0.5~2 h间，多糖提取率随提取时间的增加呈上升趋势，在2 h时多糖提取率最大（4.18%）。之后随着时间的延长，提取率开始下降。其原因可能是由于加热时间过长，少量多糖发生水解或氧化造成含量降低；同时，由于过度热浸提，导致部分多糖包裹在固态不溶物或其他物质中沉降造成损失的缘故。这与石子林等^［11］热水浸提法提取密花香薷多糖和符洪宇等^［12］热水浸提法提取香椿子多糖结果一致。因此，适宜的提取时间应为2 h。

2.2.2 料液比对提取率的影响

图3表明，在1∶15~1∶25的料液比范围内，随着料液比的增加，提取效果呈上升趋势，1∶25时达到峰值（3.95%）。随着料液比的增加，提取率逐步下降。这是因为料液比增大，底物浓度被稀释，从而影响了酶解的速率和多糖的得率。因此，宜选择料液比为1∶25进行后续试验。

2.2.3 提取温度对多糖提取率的影响

图4可以看出，当温度在40~60 ℃，随着温度的提高藜麦多糖的提取率也逐渐增加。60 ℃时达到最大值（4.14%）。随后，温度越高，提取率则不断下降。其原因是高温影响了纤维素酶的活性。因此，适宜的提取温度应为60 ℃。

2.2.4 酶浓度对多糖提取率的影响

由图5可见，在1%~5%的酶浓度范围内，多糖提取率与加酶量成正比，随纤维素酶的添加量增大而逐渐升高。酶浓度在5%时达到最大，多糖提取率为4.38%。在纤维素酶添加量大于5%之后，酶促反应并没有继续加快，反而出现下降趋势，这可能是由于纤维素酶添加过多，在底物有限的条件下，影响了其作用的发挥。因此，宜选择酶浓度为5%作为后续试验。

2.3 响应面试验

2.3.1 方差分析

试验结果见表2，回归模型方差分析见表3。

回归方程：Y=5.04+0.55A+0.55B-0.21C+

0 27D+0.43AB-0.31AC-0.32AD+0.22BC-0.17 BD-0.16CD-0.99A²-2.02B²-0.41C²-0.97D²

方差分析结果表明，此模型显著（P<0.05），复相关指数为R²_Adj=96.89%；失拟项P值为0.606 5，不显著（P>0.05）。说明响应值预测性好，数值误差小。

提取时间（A）、提取温度（B）和酶浓度（D）一次项对提取率的影响为极显著（P<0.01），交互二次项AB、AC、AD对提取率的影响为显著（P<0.05）。

2.3 2　响应面优化分析

由图6~11可见，响应面图形均为山丘型，且等高线呈椭圆形，说明提取温度、提取时间、酶浓度和料液比的交互作用对提取效果有明显的影响。提取时间轴的等高线曲线光滑，提取温度轴的等高线密度较大，表明温度对藜麦籽实多糖的提取有明显的促进作用。对藜麦籽实多糖的提取效果的主要影响因子依次为：提取温度>提取时间>酶浓度>料液比。

2.3 3　工艺条件验证

在提取温度60.54 ℃、时间2.17 h、料液比1∶20.9、酶浓度5.10%时，藜麦多糖提取率达到最高，为5.20%。为方便操作及提高重复性，调整提取时间为2.0 h、温度60 ℃、料液比1∶20、酶浓度5%，进行3次验证试验。结果表明，藜麦多糖提取率平均为5.16%，与理论值数据接近，说明确定的工艺条件合理。

2.4 红外与紫外光谱分析

与多糖的特征峰相比，3 420.62 cm^-1处为一宽的多糖分子间或分子内O-H伸缩振动引起的吸收峰，2 930.79 cm^-1处为非对称结构的C-H伸缩振动引起的吸收峰^［13］，表明该提取物为多糖类物质。1 654.14 cm^-1处存在一个C=O伸缩振动吸收峰，1 402.47~1 085.24 cm^-1处有C-H变角振动吸收峰，1 026.40 cm^-1处的吸收峰是由吡喃糖环的醚键C-O-C所产生，618 cm^-1处有吸收峰说明具有β-型糖苷键，证明提取物符合多糖结构特征和官能团特性^［14］。

220~700 nm藜麦去蛋白粗多糖紫外光谱如图13所示。由图13可知，提取的粗多糖不含蛋白质、核酸，这与江琦^［15］等研究表明的200~220 nm为多糖特征峰，260、280 nm处为核酸蛋白特征峰的结果一致。

2.5 抗氧化性测定

2.5.1 羟自由基和DPPH自由基清除率

图14可见，在浓度为1~5 mg/mL的范围内，随着多糖浓度的增大，羟自由基清除率逐渐提高。在浓度为5 mg/mL时清除率可达60.55%。

图15表明，随着溶液浓度的增大，藜麦粗多糖对 DPPH自由基的清除速度逐渐提高，3.0 mg/mL时DPPH自由基的清除效率达到44.04%，但低于VC。

2.5 2　ABTS⁺自由基清除率

图16所示结果表明，随着浓度的增大，藜麦粗多糖对 ABTS⁺自由基的清除作用逐渐增强，当浓度为3 mg/mL时，其清除率为9.09%。与 DPPH自由基清除率比较，去除效率相对较低。

3 讨论

只有在最佳pH值、提取温度、提取时间、料液比和酶浓度下，酶才能最大限度地发挥其作用。藜麦籽实由外部颖壳和内部藜谷组成，富含纤维素。纤维素酶促进植物细胞壁溶解的同时，还可促使纤维素和半纤维素分解成寡糖和单糖，加快胞内物质溶出速度^［16］。由于底物结构的复杂性，纤维素酶能够特异性地吸附在底物纤维素上，并与不同成分协同作用，使其降解为葡萄糖。

本试验采用未脱壳的藜麦籽实，在提取时间为2.0 h、温度为60 ℃、料液比1∶20、酶浓度5%的条件下，其多糖提取率最高，为5.16%。这与郭怡等^［6］报道的在料液比1∶32、酶用量2 000 U/g、温度65 ℃、时间90 min最优条件基本一致。从提取率来看，本研究低于郭怡等^［6］报道的提取率8.0%，但高于徐澜等^［17］报道的采用超声波辅助法提取藜麦种子多糖的结果（偏关县2 094.5 μg/g，静乐县1 781.5 μg/g）。分析其原因是因为郭怡等使用的是藜麦米，徐澜等采用的是超声波辅助水提法。由此可见，对于未脱壳的藜麦籽实体，采用纤维素酶提取多糖，可显著增加多糖得率。

傅里叶红外光谱测定表明，本研究获得的藜麦多糖具有糖类化合物红外特征峰。紫外光谱显示，纯化后的藜麦多糖不含核酸和蛋白质。多糖类化合物是由糖苷键结合、聚合程度不同的物质所混合的高分子碳水化合物，具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤和降血糖等生物活性^［1］。从抗氧化性来看，陇藜1号藜麦籽实多糖对羟自由基和DPPH自由基清除效果显著，对ABTS⁺自由基清除作用一般。藜麦多糖含量丰富，具有无毒、无害、无残留、无抗药性等特点，未来开发利用前景广阔。

4 结论

纤维素酶可促使纤维素和半纤维素分解，提高多糖提取率。影响未脱壳藜麦籽实多糖提取率的主要因素依次为提取温度>提取时间>酶浓度>料液比，在提取时间为2.0 h、温度为60 ℃、料液比1∶20、纤维素酶浓度5%的条件下，其多糖提取率可达到5.16%左右。抗氧化性是评价多糖的重要指标之一，陇藜1号藜麦籽实多糖对羟自由基、DPPH自由基清除率效果好，对ABTS⁺自由基清除率相对较低。

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基金资助

藜麦精深产品研发及推广应用项目(ZCYD-2020-6-1)