盐酸提取大眼金枪鱼骨中可溶性钙工艺优化

Optimization of soluble calcium extraction process from bigeye tuna （Thunnus obesus） bones using hydrochloric acid

摘要

目的 充分提取鱼骨钙，高值化利用鱼骨资源。 方法 以大眼金枪鱼骨为原料，采用盐酸提取法提取可溶性钙。大眼金枪鱼骨中钙含量采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICPMS）测定，提取液中的可溶性钙采用原子吸收光谱法测定.在单因素试验优化盐酸浓度、液料比、提取温度和提取时间的基础上，采用Box-Behnken设计对盐酸浓度、液料比和提取时间三个因素进一步优化。进行模型可行性分析，将钙提取率的实际值和多元回归拟合得到的预测值进行比对。 结果 大眼金枪鱼骨中钙含量高达164.7 mg/g。通过Box-Behnken设计拟合的方程可用于实际情况的模拟，修正后工艺参数为盐酸浓度1.00 mol/L、液料比14∶1、提取温度80 ℃、提取时间80 min，钙提取率为84.21%。 结论 研究结果为大眼金枪鱼骨制备钙制剂提供了理论依据。

Abstract

Objective In order to fully extract the calcium of fish bones and make high-value utilization of fish bone resources. Method Bigeye tuna (Thunnus obesus) bones are used as raw materials to extract soluble calcium by hydrochloric acid.The calcium content in bigeye tuna bones is measured by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICPMS).Atomic absorption spectrometry was used to determine the calcium content in the extraction.Based on the optimization of hydrochloric acid concentration，liquid to material ratio，extraction temperature and extraction time in one-factor experiments，the three factors of hydrochloric acid concentration，liquid to material ratio and extraction time were further optimized by Box-Behnken design.The model feasibility analysis was carried out，and the actual value of calcium extraction rate was compared with the predicted value obtained by multiple regression fitting. Result The equations fitted by Box-Behnken could be used to simulate actual conditions，and the modified process parameters were hydrochloric acid concentration 1.00 mol/L，liquid to material ratio 14∶1，extraction temperature 80 °C and extraction time 80 min，calcium extraction rate was 84.21%. Conclusion This study provided a theoretical basis for the calcium preparation from bones of bigeye tuna.

Graphical abstract

关键词

大眼金枪鱼骨 / 盐酸钙提取 / 工艺优化

Key words

Bigeye tuna（Thunnus obesus） bone / calcium extraction by hydrochloric acid / process optimization

大眼金枪鱼（Thunnus obesus）别称肥壮金枪鱼，鲈形目、鲭科、金枪鱼属，是一种分布广泛的大洋性高洄游性鱼类，具有极高的营养价值和商业价值^［1-4］。目前，大眼金枪鱼常用于制备生鱼片和罐头，产生了大量边角料。在冷冻大眼金枪鱼初加工过程中，大块中轴骨被形态完整地分割下来，数量及其可观^［5］。由于金枪鱼骨腥味重、骨质硬，无法做出香酥鱼骨排、骨粒脆等常见的鱼骨休闲食品，因此多被积压在冷库中或粗加工成鱼粉，经济效益极低，其高值化利用工艺有待开发。鱼骨的主要成分是灰分、蛋白质和粗脂肪。灰分中富含以羟基磷灰石结晶的形式存在的生物钙，且钙磷比有利于人体吸收^［6］。鱼骨钙的提取工艺优化对高值化利用大眼金枪鱼骨具有重要意义。

胶原蛋白占鱼骨有机成分的30%，胶原蛋白与钙盐结合让鱼骨结构更致密，导致钙的溶解度极低，因此采用煮制等简单的物理提取方法无法有效地析出^［7］。研究者围绕鱼骨钙的提取工艺和应用开展了大量工作.目前，有效提取骨钙的方法主要有酸法、醇碱法和酶解法，其中醇碱法对营养成分的破坏较大^［8］，张宏梅等^［9］用木瓜蛋白酶提取罗非鱼中的可溶性钙，在酶底比为3%，pH值为4.0，酶解时间为10 h的条件下，提取率为2.89%，酶法的提取时间长、提取率低、工艺繁琐且成本高。采用酸法提取鱼骨钙较为主流。杨淑晓等^［10］用盐酸提取虹鳟鱼骨中的可溶性钙，在盐酸浓度为3.4 mol/L、提取温度为52 ℃、提取时间为2.1 h的条件下得可溶性钙提取率为28.45%，何云^［11］用盐酸提取鮟鱇鱼骨中的钙，根据单因素试验确定优选范围后通过正交试验确定最优参数组合，提取率为31.21%。毛毛等^［12］设计了真鳕鱼骨胶原肽及鱼骨钙联产工艺，以去除胶原蛋白的鱼骨粉为原料通过2次提取法获取果酸钙，得率为93.8%，双次提取工艺较为繁琐。在常压和高压2种情况下用食醋溶出脱脂黄花鱼骨中的钙，结果表明，常压和高压下醋酸浓度都为0.9 mol/L，料液比为1∶20，常压下浸泡时间为60 min，高压为45 min，常压下浸泡温度60 ℃，但溶出率均低于45%^［13］。白艳等^［14］通过单因素试验和正交试验得到盐酸提取鳗鱼骨钙的最佳组合为3 mol/L盐酸、用量 4 mL、反应温度 108 ℃、反应时间 60 min，该条件下鳗鱼骨钙溶出率为 22.29%，达到最大。张龙等^［15］也用盐酸对鳗鱼骨钙进行提取，最优条件为3 mol/L盐酸、用量4 mL、提取温度50 ℃、提取时间150 min，得率为81.31%，较白艳等的提取率高。通过前人的研究得出，酸法的提取率高、耗时短、成本低、副作用小，是一种较好的提钙方法。

为了最大限度地利用金枪鱼骨钙资源，为后续生产钙制剂提供基础数据和技术参考。本研究拟测定大眼金枪鱼骨的基本成分，并以其为原料，以钙提取率为指标，采用单因素法和响应面法优化盐酸提取可溶性钙的工艺条件，提高金枪鱼骨钙提取率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大眼金枪鱼鱼骨，购自上海沃域食品有限公司，置于-20 ℃冰箱贮藏。盐酸，硝酸均为分析纯，上海柯灵斯试剂有限公司；乙酸，乳酸均为分析纯，上海泰坦科技股份有限公司Greagent品牌；无水柠檬酸，分析纯，Adamas试剂有限公司。

1.2 试验仪器

XM-2500旭曼摇摆式高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，DHG-9053A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Kjeltec 8400 FOSS全自动凯氏定氮仪，Soxtec 2050索氏脂肪提取仪，FOSS（福斯）公司； Thermo iCAP Q等离子体发射质谱仪HPLC-ICPMS，美国热电公司；ZEEnit 700原子吸收光谱仪，德国耶拿分析仪器股份公司；日立SU5000热场发射扫描电镜，日立有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大眼金枪鱼骨粉的制备

剔除鱼骨上残留的鱼肉，流水冲洗，除去血污等杂质，用剪刀沿骨节处剪断，得到长度约为3 cm的骨段，洗净。将骨段置于恒温鼓风干燥箱中，55 ℃干燥10 h。干燥后的鱼骨用高速多功能粉碎机粉碎，得到大眼金枪鱼骨粉。

1.3.2 基本成分的测定

水分含量测定：直接干燥法，参照《GB 5009.3-2016食品中水分的测定 直接干燥法》；灰分含量的测定：灼烧法，参照《GB 5009.4-2016食品中灰分的测定 食品中总灰分的测定》；粗蛋白含量的测定：自动凯氏定氮法，参考《GB5009.5-2016食品中蛋白质的测定 凯氏定氮法》，略有改动，将鱼骨粉0.2 g，五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.4 g，硫酸钾（K₂SO₄）3.5 g，浓硫酸12 ml放入洗净干燥的消化管中，石墨消解仪升温至421 ℃，消化47 min，至消化液呈清透状态，上机测定；粗脂肪含量的测定：索氏抽提法，参照《GB5009.6-2016食品中脂肪的测定 索氏抽提法》。

1.3.3 矿物质及微量元素测定

采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），参照《GB 5009.268-2016 食品中多元素的测定 电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）》，采用微波消解前处理。ICP-MS条件：KED模式；射频功率1 500 W；等离子体气流量15 L/min；载气流量0.80 L/min；辅助气流量0.40 L/min。氦气流速4.2 mL/min；雾化器4 ℃；蠕动泵40 r/min。

1.3.4 微观结构的观察

将鱼骨粉冷冻干燥后固定在导电胶上，真空喷金，加速电压6 kV，使用扫描电镜观察不同放大倍数下的微观结构。

1.3.5 可溶性钙提取的单因素试验

参考何云^［11］的方法，准确称取1.000 g鱼骨粉，料液比10∶1，70 ℃水浴加热60 min的基础条件下，保持其他条件不变，只改变其中一个条件进行单因素试验，以可溶性钙提取率为指标，设置盐酸浓度（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mol/L）、提取时间（30、40、50、60、70、80、90 min）、液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）以及提取温度（30、40、50、60、70、80、90 ℃），每组试验重复3次。

1.3.6 响应面法优化可溶性钙提取工艺的试验

根据单因素试验结果，以提取率为响应变量，以酸浓度、液料比和提取时间3个因素为自变量（考察因子），采用Box-Behnken试验设计，探究各因素交互作用下提取率的变化规律，试验因素及水平编码见表1。

1.3.7 提取液中可溶性钙含量的测定

火焰原子吸收光谱法，参考《GB 5009.92-2016食品中钙的测定 火焰原子吸收光谱法》，略有改动。火焰原子吸收光谱条件：灯电流1.0 mA；波长422.7 nm；狭缝0.2 nm；负高压-350 V；空气流量5.0 L/min；乙炔气流量1.0 L/min。

1.3.7.1 钙标准曲线绘制

钙标准系列溶液中钙的质量浓度分别为0、5、10、20、40、60 mg/L，利用火焰原子吸收光谱仪测定吸光度值。以钙浓度为横坐标x，吸光度值为纵坐标y，得到标准曲线：

y= 0.022 1x+0.084 3 R² =0.998 6（1）

1.3.7.2 可溶性钙含量的测定

待反应结束后过滤，取滤液稀释、混匀，过0.22 μm滤膜，导入火焰原子化器，记录吸光值。将吸光值代入（1）式，乘对应的稀释倍数，得到提取液中的可溶性钙含量。

1.3.8 提取率计算可溶性钙提取率（%）=\frac{\mathrm{提取}\mathrm{液中}\mathrm{的可}\mathrm{溶性}\mathrm{钙含}\mathrm{量}}{\mathrm{大眼}\mathrm{金枪}\mathrm{鱼骨}\mathrm{粉的}\mathrm{钙含}\mathrm{量}}×100%

1.3.9 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2010和 IBM SPSS Statistics 26软件进行处理和方差分析，采用Design Expert 8.0.6 对实验数据进行回归分析，采用Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 大眼金枪鱼骨的基本成分

大眼金枪鱼骨的基本成分见表2，其中，灰分含量为49.30 g/100g，高于列表中大多数鱼类鱼骨的灰分含量^［16］，灰分中富含钙，因此大眼金枪鱼骨适宜作为提取钙元素的天然原料。蛋白质和水分含量分别为27.44和6.46 g/100g，和其他鱼类的差别不大；脂肪含量相对较低，为9.81 g/100g。

2.2 大眼金枪鱼骨的矿物质和微量元素含量

由表3可知，大眼金枪鱼骨中Ca含量高达164.7 mg/g，高于鯖鱼（143 mg/g）、鲑鱼（135 mg/g）和虹鳟鱼（147 mg/g）^［16］。研究表明，成人膳食中钙磷比为1∶1~2∶1时最利于肠道对Ca的吸收^［17］，大眼金枪鱼骨中P含量为81.6 mg/g，钙磷比约为2∶1，接近人体的钙磷比，符合膳食营养要求。此外，其还含有Fe（904.79 mg/kg）、Zn（68.23 mg/kg）、Al（25.71 mg/kg）、Se（0.25 mg/kg）等微量元素，对维持人体正常的生理功能有一定作用。

2.3 大眼金枪鱼骨的扫描电镜观察

骨组织中的主要无机成分为羟基磷灰石结晶和无定型磷酸钙^［18］。鱼骨中不同类型钙盐具有不同的形态，以羟基磷灰石为代表的晶体钙盐呈片状，非晶体钙盐多以无定形的CaHPO₄形式存在^［7］。根据图1可知，大眼金枪鱼骨表面不含孔隙、结构致密，同时含有片状形态的羟基磷灰石晶体钙盐和无定型的磷酸钙非晶体钙盐，因此通过简单的溶解方式无法有效地使钙溶出，可通过酸破坏鱼骨内部组织结构，提取可溶性钙。

2.4 可溶性钙提取的单因素试验

2.4.1 酸浓度对提取率的影响

准确称取1.000 g鱼骨粉，用不同浓度的盐酸提取可溶性钙.酸用量10 mL，70 ℃水浴加热60 min。测定上清液中可溶性钙浓度，计算提取率。由图2可知，随着酸浓度的增大，钙的提取率先增大后趋于稳定。酸浓度影响酸性的强弱，酸性越强，对骨胶原蛋白的破坏越强，鱼骨钙更易溶出，可溶性钙提取率增加。酸浓度从0.3 mol/L增大到0.9 mol/L的过程中，提取率显著提高（P<0.05）。酸浓度为0.9 mol/L时，钙提取率最高，达到77.93%。后续再增加酸浓度，提取率略有降低，且无显著性差异（P<0.05），可能原因是0.9 mol/L的盐酸对骨胶原蛋白的作用达到最佳效果。因此，选取0.9 mol/L为优化后的酸浓度，进行后续试验。

2.4.2 液料比对提取率的影响

准确称取1.000 g鱼骨粉，改变液料比（盐酸溶液用量mL∶鱼骨粉质量g）提取可溶性钙。酸浓度均为0.9 mol/L，70 ℃水浴加热60 min。测定上清液中可溶性钙浓度，计算提取率，由图3可知，液料比直接关系到鱼骨粉和盐酸溶液的接触面积，是影响钙提取效果的重要因素.由图4可知，随着液料比的增加，鱼骨钙的提取率逐渐上升，这是由于盐酸和鱼骨粉间的浓度差和接触面积越大，钙就越能够充分溶出、提取效率就越高^［19］。液料比6∶1至14∶1范围内，提取率显著增加（P<0.05）.液料比14∶1和16∶1时，提取率分别为78.32%和80.67%，增长率无显著性差异（P<0.05）。从节约资源和降低成本角度考虑，选取14∶1为优化后的液料比，进行后续试验。

2.4.3 提取温度对提取率的影响

准确称取1.000 g鱼骨粉，改变提取温度。酸浓度均为0.9 mol/L，液料比14∶1，水浴加热60 min。测定上清液中可溶性钙浓度，计算提取率，由图4可知，随着提取温度的升高，分子的能量增加、运动速度加快，反应物之间的有效碰撞加剧，最终导致反应速率的增大.提取温度从30 ℃上升至80 ℃的过程中，钙提取率总体呈上升趋势，40至50 ℃和60至70 ℃略有降低，但无显著性差异（P<0.05），可能原因是盐酸的挥发作用。提取温度80 ℃时，钙提取率为83.50%，温度上升10 ℃后，提取率为83.53%，无显著性差异（P<0.05），推测提取温度高于80 ℃后，盐酸的挥发和钙的溶出达到平衡状态，故选取80 ℃为优化后的提取温度，进行后续试验。

2.4.4 提取时间对提取率的影响

准确称取1.000 g鱼骨粉，改变提取时间。酸浓度均为0.9 mol/L，液料比14∶1，水浴温度80 ℃。测定上清液中可溶性钙浓度，计算提取率，由图5可知，提取时间从30 min延长至40 min，提取率显著增高（P<0.05）。随着酸解时间的继续延长（40~70 min），钙的溶出率的增加不显著（P<0.05）。提取时间为80 min时，钙提取率最高，达到85.09%，延长至90 min后反而出现下降的趋势。综合考虑提取效率和盐酸挥发，得到优化后的提取时间为80 min。

2.5 响应面法优化可溶性钙提取工艺的结果分析

2.5.1 响应面试验设计及结果

由单因素试验结果分析可知，水浴温度过高导致酸的挥发速度加快、酸浓度下降，温度上升至80 ℃，提取率达到较高水平，再升温提取率反而呈下降趋势^［20］。因此，本研究对4个单因素进行筛选后，固定提取温度为80 ℃，选取盐酸浓度（A）、液料比（B）和提取时间（C）3个因素进一步优化提取工艺，结果见表4。

利用Design Expert 8.0.6软件对数据进行多元回归拟合，建立可溶性钙提取率对考察因子酸浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）的二次多项回归方程为：

提取率（%）=84.37+2.99A+0.46B+1.23C+1.30AB+0.22AC-0.17BC-6.55A²-5.80B²-4.32C²

对该拟合模型进行方差分析和显著性分析，由表5可知，该模型F=66.37，达到了极显著水平（P<0.000 1），失拟项F=0.21，P=0.887 9>0.05，无显著影响，因此该模型可以用于实际情况的模拟。由表6可知，二次项方程的决定系数R²=0.988 4，说明该模型中钙提取率的实际值和测量值有较高的吻合度，校正决定系数R²_adj=0.973 5，说明钙提取工艺有97.35%的程度受到盐酸浓度、液料比和提取时间的影响，预测决定系数R²_pred =0.959 6，说明模型有良好的预测性，因此该模型和回归方程准确率较高，可用于对分析结果的拟合与预测^［21］。变异系数CV反映试验结果和真实值的偏差，该模型的变异系数为1.240 7%，说明可靠性较高。因素的F值越大，该因素对响应值的影响越大，反之越小^［22］。表5中，一次项A和C对钙提取率的影响极显著（P<0.01），交互项AB对钙提取率的影响显著（P<0.05），二次项A²，B²和C²极显著（P<0.01）。酸浓度（A）的F值最大，提取时间（C）次之，液料比（B）的F值最小，说明三者对钙提取率的影响顺序为：酸浓度（A）＞提取时间（C）＞液料比（B）。

2.5.2 响应面各因素交互作用分析

Box-Behnken试验设计模拟出的3D曲面图和2D等高线图能够更加直观地反映各因素之间对钙提取率的交互作用情况。3D曲面的坡度越陡峭，响应面值受到考察因子的影响越敏感^［23］。2D等高线呈马鞍形或椭圆形，等高线密集，说明因素之间交互作用显著，等高线呈圆形，说明因素之间交互作用不显著^［24］。酸浓度、液料比和提取时间3个因素两两之间的交互作用对钙提取率影响的3D曲面图和2D等高线图见图6。3个曲面图均为凸型曲面，都具有一定坡度，钙提取率随因素的变化先升后降，其中，图6-A的3D曲面图坡度最陡峭，等高线图呈椭圆形，说明酸浓度和液料比交互作用对钙提取率的影响最为显著，与表5结果一致。图6-B酸浓度与提取时间，图6-C液料比与提取时间的曲面坡度较平缓，等高线接近于圆形，两两交互作用对该提取率的影响不显著，与表5结果对应。

2.5.3 响应面模型优化及验证

通过Design-Expert 8.0.6软件Box-Behnken设计优化得到金枪鱼骨提取钙的最佳工艺条件为：酸浓度0.97 mol/L、液料比14.13∶1、提取时间81.47 min，钙提取率预测值为84.83%，考虑到实际操作过程，修正后的工艺优化条件为：酸浓度1.00 mol/L、液料比14∶1、提取时间80 min。采用修正后的工艺条件进行三次平行试验，得到钙提取率为84.21%，说明该回归模型可用于实际情况的模拟。

3 结论

本研究测定了大眼金枪鱼骨的基本成分和矿物质含量，其中钙含量高达164.7 mg/g，金枪鱼骨可以做为一种良好的天然钙源加以利用。通过扫描电镜观察，鱼骨的表面无孔隙，结构致密，利用酸溶解得到钙是一种高效的方法。基于单因素试验，采用Box-Behnken设计优化，确定用盐酸溶液提取大眼金枪鱼骨钙的优化工艺参数：盐酸浓度为1.00 mol/L、液料比14∶1、提取温度80 ℃、提取时间80 min，钙提取率高达84.21%。本研究可为大眼金枪鱼骨用于制备钙制剂及高值化利用鱼骨资源提供技术指导并奠定研究基础。

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