生物矿化制备凹凸棒石-聚丙烯酸-碳酸钆复合材料及其弛豫性能

Preparation of attapulgite-polyacrylic acid-Gadolinium carbonate composite by biomineralization and its relaxation properties

摘要

目的 为了制备毒性低、弛豫性能较好的T₁型造影剂。 方法 以凹凸棒石作为基底，利用模拟生物矿化法制备了凹凸棒石-聚丙烯酸-碳酸钆三元复合物。利用傅立叶变换红外光谱、热重、X射线衍射光谱和透射电子显微镜等对其结构进行了表征。 结果 复合物中3种组分分布均匀、结合紧密、且凹凸棒石的棒晶结构保持完好，体外毒性试验表明所制备复合物对人体正常细胞表现出可忽略的毒性，核磁共振造影成像结果显示该复合物的纵向和横向弛豫率分别为5.47和20.19 mmol/（L·S）。 结论 制备的凹凸棒石-聚丙烯酸-碳酸钆复合材料弛豫性能较好，具有良好的造影效果，有望成为新型T₁型造影剂。

Abstract

Objective The study was conducted to prepare T₁ contrast agents with low toxicity and good relaxation performance. Method Attapulgite-polyacrylic acid-gadolinium carbonate ternary composites were prepared with attapulgite as substrate by the method of simulating biological mineralization.The structure of the composite was characterized by using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)，thermogravimetric (TG)，X-ray diffraction (XRD) and transmission electron microscopy (TEM). Result The three components in the composite were evenly distributed and closely combined，and the rod-like crystal structure of attapulgite was intact.In vitro toxicity test showed that the prepared compounds had negligible toxicity to normal human cells.The rates of longitudinal and transverse relaxation of the complex were 5.47 and 20.19 mmol/(L·s)，respectively. Conclusion The n-ATP-PAA-Gd composite prepared in this study had good relaxation performance and might achieve good contrast effect，which hence could be expected to be a new T₁ contrast agent.

Graphical abstract

关键词

凹凸棒石 / 聚丙烯酸 / 碳酸钆 / 核磁共振成像 / 造影剂

Key words

attapulgite / polyacrylic acid / gadolinium / nuclear magnetic resonance imaging / contrast agent

生物体利用矿物质，如碳酸钙和磷酸钙，来构建各种无机-有机混合材料，实现各种特定功能，如保护、机械支撑、光子学或导航，这一过程称为生物矿化^［1-4］。生物体对生物矿物的组成、形态和层次结构的完美控制激发了众多研究人员在生物体外模拟该过程制备具有显著性能的新型人工材料的兴趣，尤其是碳酸钙-有机杂化材料的仿生合成^［5-7］，然而这些可再生生物资源的利用目前仍然面临挑战。据报道，具有特定官能团的聚合物，比如聚丙烯酸可模拟生物体的蛋白质在生物矿化中的作用，能够在生物体外室温下合成具有三维交联网络结构的生物矿化材料，如干燥的非晶态碳酸钙和纤维素在聚丙烯酸的作用下，可合成透明、坚固且灵活的非晶态碳酸钙^［8］。这种生物矿化凝胶的形成大多依赖Ca²⁺和COO^-之间的相互作用，Schupp等 ^［9］的研究表明，可以用其他二价碱土金属离子和过渡金属离子，例如Mg²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺取代Ca²⁺产生类似的水凝胶，而采用Al³⁺和Fe³⁺会产生不可膨胀和非塑性的团聚体，这些结果表明，金属离子和羧基之间的相互作用更可能是静电作用力，而不是配位键。库仑定律清楚地表明电荷和离子半径是静电力的2个基本因素。在这种情况下，Al³⁺和Fe³⁺的超小离子半径可能是产生团聚体的原因。因此，具有较大离子半径的三价金属离子可以提供合适的静电作用力^［10］。钆离子是1种半径较大的三价稀土离子，由于核外具有7个未成对电子，表现出很强的顺磁性，能够最大程度的增强核磁共振成像的信号强度而被广泛用作临床检测中T₁型造影剂。临床中使用的造影剂分为T₁型造影剂和T₂型造影剂，T₁型造影剂是指通过降低组织周围水分子中质子的纵向弛豫时间进而增强磁共振信号的造影剂，T₂型造影剂是指通过降低组织周围水分子中质子的横向弛豫时间进而增强磁共振信号的造影剂。大量基于钆的T₁型造影剂被设计并成功制备，然而，目前钆基造影剂仍然面临着纵向弛豫率低和生物毒性等问题。因此设计制备弛豫性能较高、生物相容性良好的钆基造影剂具有重要意义^［11］。

硅藻土是由生活在海洋或湖泊中藻类的残骸在水底沉积，经过多年的成岩作用而形成的一种具有多孔结构生物硅质沉积岩，其主要成分为SiO₂^［12］；膨润土是以蒙脱石为主要成分的黏土矿物，还含有少量石英和伊利石等矿物^［13］；凹凸棒石是具有特殊结构、形态、物理化学性质的镁铝硅酸盐黏土矿物^［14-15］，其2层硅氧四面体之间夹杂着一层铝氧八面体，而在硅氧四面体条带间形成了与链平行的水分子通道，所以与硅藻土和膨润土相比，凹凸棒石具有更大的比表面积和吸附能力，同时还具有理想的胶体性能和耐热性能，使其在黏土矿物学、材料科学、物理化学、土壤科学以及环境工程等诸多领域得到广泛的重视，尤其是凹凸棒石作为载体与纳米金属氧化物复合制备催化剂、作为增强材料与有机高分子材料复合以及制备结构自组装材料等，具有巨大的潜在应用前景^［16-17］。

因此，受生物矿化过程的启发，本研究开发了一种简单快速的方法，以凹凸棒石（ATP）、碳酸钠（Na₂CO₃）、六水硝酸钆（Gd（NO₃）₃·6H₂O）和聚丙烯酸（PAA）为原料，将钆离子（Gd³⁺）和聚丙烯酸成功的负载于凹凸棒石表面，最后对ATP-PAA-Gd的形貌、结构、细胞毒性和造影剂性能进行了详细的表征。

1 材料与方法

1.1 材料

凹凸棒石（ATP）购自江苏凹凸棒国际有限公司；六水硝酸钆（Gd（NO₃）₃·6H₂O，99%）购买于上海源叶生物科技有限公司；聚丙烯酸（PAA）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM培养基，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐 （MTT）；胎牛血清（FBS）购买于北京索莱宝科技有限公司；DMSO和碳酸钠（Na₂CO₃）购自天津恒兴化学试剂制造有限公司；去离子水（H₂O）实验室自制。

1.2 PAA-Gd和Na₂CO₃溶液的制备

准确称取4组0.86 g PAA和0.9 g Gd（NO₃）₃·6H₂O分别置于4个烧杯中，分别向4个烧杯中加入20 mL蒸馏水，搅拌使其溶解，得到PAA-Gd溶液。另取4个烧杯均加入0.318 g Na₂CO₃和30 mL蒸馏水搅拌溶解，得到0.1 mol/L Na₂CO₃溶液。

1.3 n-ATP-PAA-Gd溶液的制备

将其中3个PAA-Gd溶液中分别加入80、800、1 600 mg凹凸棒石，将4组溶液置于冰浴中细胞破碎5 min，搅拌6 h，然后将Na₂CO₃溶液逐滴缓慢加入4组溶液，8 000 r/min下离心10 min分离混合物，去除上清液，用蒸馏水洗沉淀3次，最后分散于40 mL蒸馏水中，得到n-ATP-PAA-Gd（n=0、1、2、3，分别代表未加入凹凸棒石、加入80、800、1 600 mg凹凸棒石），取20 mL冷冻干燥72 h，得到固体样品。

1.4 测试与表征

使用iS50 FT-IR（Nicolet公司）分光光度计进行傅里叶红外变换光谱表征。用Netzsch STA 409 PC analyzer热重分析仪以10 ℃/min的升温速度，从25 ℃到900 ℃对样品进行热重分析。ATP-PAA-Gd的粒度和Zeta电位由Zeta粒度分析仪（SALD，2300，SHIMADZU）在室温下测得。在XRD-6100（日本岛津）对ATP-PAA-Gd样品进行表征。由JEM-2100（日本株式会社）在200 kV条件下得到TEM图像。酶标仪（RT-6100）深圳市雷杜生命科技有限公司。采用电感耦合等离子体（ICPPLASMA 1000）测量法测定了基体中Gd³⁺的解离量。样品的纵向弛豫时间（T₁）和横向弛豫时间（T₂）加权图像使用了医用1.0 T小动物磁共振成像仪 （上海寰彤科教设备有限公司）。

1.5 细胞毒性试验

为了研究ATP-PAA-Gd的生物相容性，对其进行MTT测试。人脐静脉内皮细胞Huvec用DMEM培养基培养，每个培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素，链霉素0.1 mg/mL，将细胞保存在5% CO₂，37 ℃的培养箱中培养。通过MTT法用Huvec细胞评估ATP-PAA-Gd的细胞毒性。通常将100 μL用DMEM培养基培养的Huvec（5×10³/孔）细胞接入96孔板中，并培养过夜使细胞贴壁生长。然后加入不同浓度的（25、50、100、200、400 μg/L） ATP-PAA-Gd溶液培养48 h后，每孔加入20 μL MTT （5 mg/mL） 在培养箱中孵化，4 h后取出96孔板的培养基并每孔加入150 μL DMSO 震荡10 min，在490 nm的酶标仪下记录其吸光度（D） 来评估细胞毒性。

存活率（%）=\frac{\mathrm{试验}\mathrm{组}D\mathrm{平均}\mathrm{值}-\mathrm{空白}\mathrm{组}D\mathrm{平均}\mathrm{值}}{\mathrm{空白}\mathrm{组}D\mathrm{平均}\mathrm{值}}×100%

2 结果与分析

2.1 制备与表征

首先对PAA、ATP、n-ATP-PAA-Gd进行了傅里叶红外光谱表征，如图1所示，从ATP的曲线可以看出，在3 600 cm^-1处的吸收峰属于Si-OH的振动^［18-19］，而3 440和1 630 cm^-1为配位水和沸石水中羟基的的伸缩振动。975 cm^-1处的吸收峰则对应Si-O-Mg的伸缩振动^［20-21］。在PAA的红外图谱中，3 300 cm^-1处的吸收峰归属于羟基的伸缩振动，1 560 cm^-1和1 405 cm^-1的吸收峰分别属于COO^-和C=C的伸缩振动。ATP和PAA物理混合物中2种组分的特征峰没有明显变化，表明混合过程没有新化学键形成。生物矿化反应后形成的复合材料在1 640 cm^-1出现碳酸根的伸缩振动峰，而1 492 cm^-1的吸收峰则归属于PAA上羧基在反应往后向低频区发生移动而产生的。复合物中在650~800 cm^-1范围观察到PAA上C-C和C-O键的伸缩振动，且随着复合物中凹凸棒石含量的增加而明显减弱。

图2为ATP、PAA、n-ATP-PAA-Gd的热重量曲线。当温度从25 ℃升高到100 ℃左右时，所有样品均出现约为7%的质量损失，这是由于样品中吸附水分的损失导致的。纯的ATP样品在100~700 ℃之间失质量约为11.4%，这是由于高温导致ATP中的结晶水损失造成的^［22］，而纯的PAA在此区间几乎完全失质量，这是由于聚合物的氧化、碳化和燃烧引起的^［23］。随着ATP的添加量逐渐增加n=1，2，3，复合材料的失质量百分数逐渐减少，分别为66.92%，76.50%，79.92%，这与样品中可热降解的PAA的相对含量逐渐降低有关。

如图3为ATP、PAA、n-ATP-PAA-Gd粒度分布，纯的PAA和ATP的粒度大小约为120 nm，而矿化反应形成的复合材料的粒度增加到约为300~370 nm，证明ATP与PAA成功结合分布系数均在0.1~0.4之间，表明ATP在形成的复合材料中分散均匀，且形成复合材料在溶液中较为匀一。在孵育4 d的测试中，所有样品的粒度随时间变化不明显，展示出良好的稳定性。样品的电位测试结果如图4所示，所有样品的均为负值，这有利于材料在血液和生物体内的循环并发挥活性。复合物的电位同样随着时间的变化较小，表现出较好的稳定性^［24］。

如图5是纯的ATP和n-ATP-PAA-Gd复合物的XRD图谱。纯的ATP分别在2θ=值13.7°、16.3°、19.8°、21.5°和35.7°出现（200）、（130）、（040）、（310）和（102）晶面^［25］。其中，ATP在2θ＝26.9°的衍射峰是石英的特征峰，表明ATP中含有一定的石英砂。在没有凹凸棒石添加的复合物中，在2θ=11.60°、15.53°、19.11°、22.67°、29.82°和35.05°分别对应Gd₂（CO₃）₃·H₂O的（002），（101），（020），（103），（123）和（220）晶面^［25］，加入ATP后形成的复合物中则观察到了以上2种成分的特征峰。ATP的特征衍射峰随着添加量的增多而逐渐增强，而Gd₂（CO₃）₃·H₂O的峰则逐渐减弱，这是由组分相对含量的变化所引起的。

纯ATP和复合材料的透射电镜图片如图6所示，纯的凹凸棒石呈现出典型的棒晶束形貌，棒晶长度达到了数十微米，而直径约为20 μm左右，晶束的团聚较为明显。对于未加入凹凸棒的样品0-ATP-PAA-Gd，可以看出经过生物矿化后，形成的复合材料呈现典型的线条状纤维结构，长度约为500 nm，而直径仅有5~6 nm，同时伴随有少量的纳米球形结构。当凹凸棒石的加入量为80 mg时（1-ATP-PAA-Gd），矿化形成的PAA-Gd纤维与凹凸棒均匀的融合在一起，此时PAA-Gd的纤维结构仍然保持完整，且在复合物中占主要成分。随着凹凸棒石的含量进一步增加，矿化产物的比例逐渐下降，图中凹凸棒石的形貌越来越明显，较多的PAA-Gd纤维负载于凹凸棒石的表面，分布较为均匀，且随着凹凸棒石添加量的增加，复合材料的分散性明显提高，复合物中凹凸棒石的棒晶结构保持完好，这有利于环境中水分子的渗透，从而提高材料的弛豫性能，结果表明成功制备了n-ATP-PAA-Gd。

2.2 MTT及体外MRI

复合材料中Gd离子的含量对核磁共振造影的造影性能有很大的影响，利用ICP-MS结合标准曲线法准确测试了所有样品中钆离子的的含量，以5%的硝酸溶液作为溶剂，首先配制了浓度为5、10、25、50、100 μg/L的Gd³⁺标准溶液，于ICP-MS上测试上述标准溶液的吸收强度，并绘制标准曲线，如图7，可以看出所绘制的标准曲线R²值为0.999 8，表现出很好的线性相关性。然后将所配制的一定质量的n-ATP-PAA-Gd溶液用同样的方法进行测试，将其吸收强度带入标准曲线，准确获得复合物溶液中钆离子的浓度，并计算出样品中钆的百分含量如图7中表格所示。在未添加ATP的样品中钆的含量约为17.73%，且含量随着ATP添加量逐渐增多（n=1，2，3）而降低，其含量分别为15.53%、9.75%、6.91%。

以人脐静脉内皮细胞（Huvec）为模型测试了所制备复合材料的体外毒性，结果如图8所示，可以看出在不同钆离子浓度的复合物溶液中孵育48 h后，低浓度时Huvec细胞的存活率基本与对照组相同，高达100%，当浓度大于100 μg/L时细胞活力才出现略微的下降，在浓度高达400 μg/L时，细胞存活率仍高达85%以上，所有材料均表现出较低的细胞毒性。

所制备的复合物的体外核磁共振造影成像如图9所示，钆离子的浓度设置为25、50、100、200、400 μg/L，以蒸馏水作为对照，可以看出T₁、T₂加权图像都随着Gd³⁺浓度的增大而逐渐变亮，这是由于钆离子的含量越多，被缩短了弛豫时间的水分子就越多，图像就越亮。同时可以发现T₁图像的增亮程度要高于T₂图像，说明所制备的复合材料可作为T₁造影剂。以2-ATP-PAA-Gd作为代表，测试了各个浓度的纵向（T₁）和横向（T₂）弛豫时间，并分别以1/T₁和1/T₂对Gd³⁺浓度作图，进行线性拟合，则拟合曲线斜率即对应为纵向（r₁）和横向（r₂）弛豫率，结果如图10所示，该复合物的纵向（r₁）和横向（r₂）弛豫率分别为5.47和20.19 mmol/（L·S），r₂/r₁的比值低至3.69^［26-27］，目前普遍研究认为当该数值小于10时，相应的材料可作为T₁型的造影剂。

3 讨论

凹凸棒石由于成本低且生物相容性好被广泛应用生物医用材料的设计和制备中，Zhu^［28］的研究团队以凹凸棒石等原料合成了一种具有发光生物成像和T₂加权磁共振成像能力的钌纳米复合材料atta@Fe₃O₄@Ru NC，其横向弛豫率r₂为120.81 mmol/（L·S）。Zhao等 ^［29］利用单宁酸与Gd³⁺形成的配位聚合物，在凹凸棒土表面简单方便地包覆了单宁酸钆。凹凸棒石-单宁酸钆复合材料将聚乙烯醇引入其中，成功制备了凹凸棒石-单宁酸钆-聚乙烯醇（ATP@Gd@PVA），所制备的ATP@ Gd@ PVA有良好的生物相容性，纵向弛豫率和横向弛豫率分别为59.56、340.81 mmol/（L·S），有望作为新型的T₁型造影剂被广泛应用。Mitchell等 ^［30］为了寻找安全、高效、经济的造影剂，在造影剂中引入不同浓度的果胶酸高岭土和凹凸棒石用于磁共振成像，结果表明凹凸棒石的引入可以大大降低T₁和T₂弛豫时间，弛豫率比原来高出大约一个数量级。

本研究以利用碳酸钠、六水硝酸钆和聚丙烯酸能够模拟生物矿化的方式形成复合材料的原理，将毒性低生物相容性好且具有棒状结构的凹凸棒石引入到复合材料中，利用钆离子的顺磁性而将复合物用作核磁共振成像造影剂。傅里叶红外光谱分析和对比可以看出复合物中分别出现了ATP在975 cm^-1处和PAA在1 405 cm^-1处的吸收峰，表明PAA在与Gd³⁺发生生物矿化后，成功的与ATP进行复合，并且975 cm^-1处的吸收峰随着ATP含量的增加而增大。为了进一步验证复合物的生物矿化形成过程，将ATP和PAA简单物理混合后的产物（ATP-PAA）也进行了测试，可以看出该混合物在730 cm^-1处和850 cm^-1处出现-CH₂的摇摆弯曲振动吸收，1 405 cm^-1处COO^-微弱的伸缩振动，说明简单的物理混合和矿化反应后的产物并不相同。从热重曲线可以发现所有样品均在100 ℃左右失去表面吸附水出现约8%的质量损失，300 ℃左右失质量3%~17%可能与PAA的碳化和氧化有关，最后的600 ℃左右缓慢失质量可以归结于碳化PAA的燃烧，800 ℃煅烧后0-ATP-PAA-Gd、1-ATP-PAA-Gd、2-ATP-PAA-Gd和3-ATP-PAA-Gd分别失质量38.12%、33.54%、23.93%和21.06%，失质量比例逐渐降低，这是由于随着复合物中ATP的含量逐渐增加，导致PAA的相对含量降低，

从复合物的XRD图谱可以看出样品在衍射峰27.7°处差异显著，样品0-ATP-PAA-Gd中由于未加ATP，因此该样品的曲线上没有ATP的特征衍射峰，而其他样品均在27.7°处的衍射峰面积逐渐增大，表明ATP结合于这3种材料中，而粒度分析结果显示，复合材料的粒度并没有因为ATP的含量增加而出现明显的变化，表明ATP均匀的分散于复合材料中，且复合材料的粒度在孵育4 d后并未出现显著性的改变，表现出良好的稳定性，复合物的粒度均大于纯ATP和PAA也证明ATP与PAA成功结合。Zeta电位测试结果也显示复合物的电位不随孵育时间的延长而出现显著性的浮动，这与粒度测试的结果一致。

透射电镜的测试揭示无ATP添加时，PAA和碳酸钆在生物矿化后形成的复合材料成现细长的纤维状，加入ATP后，三者相互结合，ATP在复合材料中分散均匀，随着ATP的添加量增多，复合材料中PAA和碳酸钆形成的纤维负载于ATP的棒晶束表面，ATP的结构保持较为完整，这将增大复合材料的比表面积，有利于更多水分子与钆离子接触，从而增加材料的弛豫性能。

ICP-MS精确测定了样品中钆离子的含量，复合物中钆离子的相对含量随着样品中ATP加入量的增加而逐渐降低。MTT试验结果表明复合材料即使在钆离子的浓度高达400 μg/L时仍然对Huvec细胞没有明显的毒性，展示出良好的生物应用前景，这有利于复合材料的生物应用。体外弛豫测试结果显示所有复合物均表现出良好的造影性能，T₁和T₂图像的亮度均随着浓度的升高而逐渐增加，其中2-ATP-PAA-Gd的纵向弛豫率为5.47 mmol/（L·S），高于目前临床用造影剂（4.0 mmol/（L·S）），表现出良好的造影属性。

4 结论

利用PAA与碳酸钆之间能够以生物矿化的方式形成复合物的性质，将毒性低、生物相容性好的凹凸棒石引入发到上述复合材料中，成功制备了ATP-PAA-Gd 3元复合材料。表征结果显示凹凸棒石的引入并未影响矿化反应的发生，复合物中3种组分均匀结合，凹凸棒石的棒晶结构保持完好，复合材料的稳定性较好，对人正常细胞显示出可忽略的毒性。其中2-ATP-PAA-Gd的纵向弛豫率r₁为5.47 mmol/（L·S），横向弛豫率r₂为20.19 mmol/（L·S）且r₂/r₁=3.69，有望作为新型的T₁型造影剂。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31860472)

甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA511)

甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金项目(GSAU-STS-2018-15)