饲粮中添加不同水平花椒籽对育肥猪脂肪酸组成和FABP1基因组织表达的影响

Effects of different supplemental levels of Zanthoxylum bungeanum seeds on fatty acid composition and tissue expression of the FABP1 gene in fattening pigs

摘要

目的 探究饲粮中添加不同水平花椒籽对育肥猪脂肪酸组成和肝脏型脂肪酸结合蛋白基因（FABP1）组织表达水平的影响。 方法 试验选择288头3月龄体质量相当且健康的杜×长×大三元育肥猪，随机分为4组，分别用花椒籽代替基础饲粮中0%（对照组）、2.5%（Ⅰ组）、5%（Ⅱ组）和7.5%（Ⅲ组）玉米进行饲喂，试验期100 d，试验结束后采集育肥猪肝脏、背肌和肾周组织测定脂肪酸含量，利用荧光定量qPCR检测FABP1基因在育肥猪各组织中的表达特征。 结果 添加花椒籽显著改善育肥猪背肌和肝脏中SFAs、MUFAs和PUFAs水平，试验I组背肌和肝脏SFAs显著升高（P<0.05），试验Ⅱ组背肌、肝脏和肾周PUFAs显著升高（P<0.05）；猪FABP1基因CDS全长383 bp，共编码127个氨基酸，与参考序列相比，其编码区第53位T突变为A；FABP1基因在花椒籽饲喂育肥猪的肝、脾、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、盲肠和背肌组织均显著上调表达（P<0.05），在肾脏中显著下调表达（P<0.05），试验II组脾脏、空肠、直肠和背肌中FABP1基因的表达量显著高于其他组（P<0.05）。 结论 饲粮中添加花椒籽显著改善育肥猪脂肪酸组成，提高各组织FABP1基因的表达量，这有利于育肥猪的脂肪沉积和肉质改善。

Abstract

Objective This study aimed to investigate the fatty acid composition and tissue expression levels of the liver type fatty acid binding protein gene（FABP1） in fattening pigs fed different levels of Zanthoxylum bungeanum seeds. Method A total of 288 healthy three⁃month⁃old Duroc×Landrace×Yorkshire fattening pigs with the same body weight were randomly selected and divided into 4 groups fed the basal diet with Zanthoxylumbungeanum seeds replacing 0%（control group），2.5%（group Ⅰ），5%（group Ⅱ） and 7.5%（group Ⅲ） corn，respectively.The experiment lasted 100 days.At the end of the experiment，the liver，back muscle and perirenal tissues of the fattening pigs were collected to test the fatty acid content，and the expression characteristics of the FABP1 gene of the fattening pigs were also detected by RT-qPCR. Result The levels of SFAs，MUFAs and PUFAs in back muscle and liver of fattening pigs were significantly improved by dietary supplementation with Zanthoxylum bungeanum seeds，and SFAs of back muscle and liver were significantly increased in group I than that in others （P<0.05），PUFAs of back muscle，liver and perirenal were significantly increased in group II than that in others （P<0.05）.The CDS of the FABP1 gene was 383 bp in length and encoded 127 amino acids，compared with the reference sequence，the T in the 53rd position of the coding region was mutated to A，resulting in the missense mutation.The expression levels of FABP1 gene were significantly upregulated in liver，spleen，duodenum，jejunum，ileum，colon，rectum，cecum and back muscle of fattening pigs after feeding Zanthoxylum bungeanum seeds （P<0.05），while significantly downregulated in kidney （P<0.05）.The expression levels of FABP1 gene were significantly higher in spleen，jejunum，rectum and back muscle than that in other tissues （P<0.05）. Conclusion The addition of Zanthoxylumbungeanum seeds could significantly improve fatty acid composition and increase tissue expression of the FABP1 gene in fattening pigs，which is beneficial for fat deposition and meat quality improvement in finishing pigs.

Graphical abstract

关键词

花椒籽 / 育肥猪 / 脂肪酸 / FABP1基因 / 组织表达

Key words

Zanthoxylumbungeanum seeds / fattening pigs / fatty acid / FABP1 gene / tissue expression

我国是猪肉生产和消费大国，2021年猪肉总产量超过4 900万t^［1］，但随着养殖数量的不断增加，饲料需求量也在不断增加，饲料匮乏问题日益严重，因此开发新的饲料资源迫在眉睫。我国是一个花椒（Zanthoxylumbungeanum）种植大国，全国种植面积约167万hm²，2018年产量达40万t以上^［2］。将花椒外皮作为香料利用后会产生大量的副产品花椒籽，研究发现花椒籽中含有大量的粗蛋白、油脂、粗纤维和脂肪酸等，且花椒籽中的脂肪酸主要由油酸、亚油酸和α亚麻酸组成^［2］，营养价值丰富，因此，将花椒籽作为饲料原料既能缓解我国目前饲料紧缺的问题，又能使资源高效利用，保护环境。

脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein）属细胞内脂质结合蛋白超家族^［3］，主要存在于脊椎动物和非脊椎动物细胞质中^［4］，可分为肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP，又称FABP1）、肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP，又称FABP2）、心脏型脂肪酸结合蛋白 （H-FABP，又称FABP3）、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（A-FABP，又称FABP4）4种常见类型^［5］，所有FABP成员保守性较强^［6］，FABPs能够以非共价键的形式特异性结合长链脂肪酸，并将脂肪酸转运到线粒体、内质网和细胞核，有效地促进酯化反应，合成三酰甘油，参与脂类代谢等^［7］，具有促进游离脂肪酸吸收和细胞内转运的功能^［3，8］。与其他脂肪酸结合蛋白不同，FABP1是膜周边蛋白，其分子中心含高亲和力结合位点，β折叠稳定性较强^［9］，能通过共价键形式结合长链脂肪酸，也是唯一能结合2分子脂肪酸的一种脂肪酸结合蛋白^［3］。因此，FABP1作为脂质代谢的重要调节因子，在调节脂肪储存和分布中发挥着重要作用。

基于此，本试验通过添加不同水平花椒籽替代玉米饲粮饲喂育肥猪，研究添加花椒籽对育肥猪肝、背肌和肾周组织脂肪酸的影响，克隆猪FABP1基因的CDS区，并采用RT-qPCR方法研究饲料中添加不同比例花椒对育肥猪FABP1基因组织表达的影响，以期为调节猪的脂肪酸水平和改善肉质提供理论依据，并为将来开发利用花椒籽作为饲料来源等相关研究提供参考。

１ 材料与方法

1.1 饲粮配方及营养水平

饲粮配方、营养水平以及花椒籽中脂肪酸组成详见梁永飞等^［10］的《花椒籽替代不同比例玉米对育肥猪生长性能和肉品质的影响》一文。

1.2 样品采集

本试验将288头3月龄体质量相当且健康的杜×长×大三元育肥猪随机分为4个组，每组4次重复，每重复18头，试验组采用花椒籽代替饲粮中2.5%（Ⅰ组）、5%（Ⅱ组）、7.5%（Ⅲ组）的玉米进行饲喂，对照组采用标准日粮饲喂，试验期100 d。饲喂试验结束后，屠宰猪只。根据试验目的，采集猪的心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、盲肠和背最长肌，液氮速冻，-80 ℃超低温冰箱保存用于荧光定量PCR检测，同时采集猪左侧胴体背最长肌、肝脏和肾周脂肪-20 ℃保存，用于脂肪酸测定。

1.3 主要试剂

脂肪酸测定试剂：乙醚、石油醚、盐酸、乙醇、正己烷、三氟化硼甲醇、氢氧化钠等。

PCR扩增相关试剂：反转录试剂盒和pMD™19-T Vector（购自TaKaRa公司），DNA凝胶回收试剂盒（购自北京擎科生物科技有限公司），2×Taq PCR Master Mix、DH5α感受态细胞和组织基因组DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司），SYBR^® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒（购自北京擎科生物科技有限公司）。

1.4 脂肪酸的测定提取及测定

按照梁永飞等^［10］的方法，对背肌、肝脏和肾周组织样品进行处理，提取脂肪酸，并进行脂肪的皂化和脂肪酸甲酯化反应，利用色谱柱HP-88（100 m×0.25 mm×0.2 μm）检测各样品中的脂肪酸组成及含量。

1.5 引物设计与合成

在NCBI GenBank中获得猪FABP1基因（登录号：NM_001004046.2）序列，设计该基因完整编码区的特异性扩增引物和荧光定量PCR引物，利用DNAMAN对设计的引物进行验证，并送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成，引物信息见表1。

1.6 全基因组DNA的提取及PCR扩增

采用组织基因组DNA提取试剂盒提取背肌组织全基因组DNA，经微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整性，检测合格后保存于-20 ℃备用。

采用普通PCR扩增猪FABP1基因的CDS区，PCR扩增采用20 μL反应体系：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix10 μL，无菌无酶水6 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30ｓ，58 ℃退火30ｓ，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。

1.7 基因克隆及测序

将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳（180 V，20 min）检测后，在凝胶成像仪上观察，挑选扩增产物片段大小与目的片段一致且条带清晰明亮的PCR产物，利用DP209-02凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段。将纯化产物连接到PMD19-T载体，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞；待反应完成后，将菌液均匀涂抹于含有氨苄青霉素（Amp+）、X-Gal的LB固体培养基，37 ℃培养16 h。挑取白色单菌落送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司测序。

1.8 RNA提取及反转录

采用TrizoL法提取各组织中的总RNA，并反转录成cDNA，反应条件为：42 ℃，2 min；37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存。待反应完成后，测定cDNA浓度和纯度，-20 ℃保存。

1.9 荧光定量PCR检测

以育肥猪心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、盲肠和背肌组织cDNA作为模板，使用SYBR^® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒，利用荧光定量仪检测FABP1基因在育肥猪各组织的表达量，以GAPDH作为内参，每个样品做3个重复，采用2^-△△Ct法计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 花椒籽部分替代玉米对育肥猪不同组织脂肪酸组成的影响

对花椒籽代替不同比例玉米饲粮饲喂育肥猪的背肌、肝脏和肾脏组织的脂肪酸含量进行测定，结果见表2~4。

在背肌组织中，试验Ⅱ、Ⅲ组的饱和脂肪酸（SFAs）显著低于对照组和试验Ⅰ组（P<0.05），但不饱和脂肪酸（UFAs）显著高于对照组和试验Ⅰ组（P<0.05），试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组单不饱和脂肪酸（MUFAs）和n-6多不饱和脂肪酸（n-6 PUFAs）均显著高于对照组（P<0.05），但是多不饱和脂肪酸（PUFAs）和n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）与对照组差异不显著（P>0.05）（表2）。

在肝脏组织中，试验Ⅰ组SFAs极显著高于其他组（P<0.01），但其UFAs显著低于其他组（P<0.05），试验Ⅱ、Ⅲ组和对照组之间差异不显著（P>0.05）；试验Ⅱ、Ⅲ组的PUFAs（包括n-6 PUFAs和n-3 PUFAs）均显著高于试验Ⅰ组（P<0.05）（表3）。

在肾周组织中，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和对照组的SFAs、UFAs、MUFAs和n-3 PUFAs差异均不显著（P>0.05），但试验Ⅱ、Ⅲ组的PUFAs显著高于试验Ⅰ组和对照组（P<0.05），试验Ⅲ组的n-6 PUFAs显著高于试验Ⅰ、Ⅱ组（P<0.05），极显著高于对照组（P<0.01）（表4）。

2.2 育肥猪FABP1基因的PCR扩增

以育肥猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，明亮，该扩增片段约400 bp，与预期目的片段大小相符（图1）。

2.3 测序结果分析

经克隆测序后获得育肥猪FABP1基因完整的CDS区序列，序列长度为383 bp，编码127个氨基酸。该序列与参考序列的同源性为99.7%，且CDS区第53位点处的T突变为A（图2），导致第18位苯丙氨酸突变为酪氨酸（图3）。

2.4 FABP1基因在育肥猪各组织中的表达谱

采用RT-qPCR方法检测猪FABP1基因的组织表达谱，结果如图4所示。FABP1基因在猪12个组织内都有表达，说明该基因表达广泛，但FABP1在各组织中的表达水平有差异，FABP1基因在肝脏和肠道组织中高表达，在肺脏和背肌中呈低表达。

进一步对添加不同水平花椒籽替代玉米饲喂育肥猪的各组织中FABP1基因的表达水平进行检测，结果发现：与对照组相比，FABP1基因在花椒籽饲喂育肥猪的肝脏、脾脏、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、盲肠和背肌组织中的表达水平均显著上调表达（P<0.05），但在肾脏的表达水平极显著下降（P<0.01）；FABP1基因在试验I组心脏和肺脏组织中的表达与对照组差异不显著（P>0.05），但在试验II组肺脏组织表达极显著升高（P<0.01），在试验III组肺脏组织表达极显著降低（P<0.01） （图5）。

3 讨论

花椒籽营养价值较高，其油脂、蛋白质、粗纤维、蜡质及水分等含量分别为27.1%、18.7%、30.23%、8%~12%和10%左右。此外，花椒籽中含有丰富的不饱和脂肪酸，具有调节机体血脂水平、改善并防止脂质过氧化等功能，尤其在调节脂质代谢方面发挥着重要作用。脂肪酸结合蛋白是一类低分子量的胞浆蛋白质，主要存在于肠黏膜以及其他利用脂肪酸的组织中^［11］，能特异结合游离脂肪酸和其他疏水配基，参与细胞内脂肪酸的运输，并将脂肪酸从细胞膜运送到一定位置进行甘油三酯和磷脂的合成以及脂肪酸氧化，促进酯化反应^［12］。脂肪酸结合蛋白还可通过防止细胞内游离脂肪酸堆积起到解毒作用^［13］。FABP1能够结合配体参与细胞内信号转导，并且在脂肪酸摄取、转运和代谢中发挥重要作用^［14］。

本研究首先对不同水平花椒籽替代玉米饲喂育肥猪的肝脏、背肌和肾周组织的脂肪酸进行检测，发现花椒籽对于提高猪背肌中MUFAs和n-6 PUFAs含量具有良好效果，同时对降低SFAs含量和n-6/n-3比例有一定作用；此外，花椒籽还可以提高猪背肌UFAs和PUFAs、肝脏组织中n-3 PUFAs的含量，背肌和肝脏是脂肪酸代谢和脂质沉积的主要部位，其脂肪酸含量升高可能与花椒籽中PUFAs的含量高有关。花椒籽饲喂还能显著提高育肥猪肾周组织中PUFAs和n-6 PUFAs含量，但是对SFAs、UFAs、MUFAs的影响不显著，说明饲料中添加花椒籽可以有效改善猪肝脏、背最长肌肉及肾周组织多不饱和脂肪酸的转化与分配，提升猪肉营养价值和肉品质。

陈桂莲等^［12］对辽宁黑猪、丹育黑猪、杜洛克、长白猪、大白猪等7个品系肌内脂肪进行了研究，发现FABP1基因可能是影响猪肌内脂肪含量的主效基因或者是与主效基因紧密连锁的标记基因，且FABP1的核酸序列和氨基酸序列在不同品系猪中具有高度的保守性^［15］。王启贵等^［16］研究了鸡 L-FABP基因5'上游区的遗传多样性，发现该位点存在单核苷酸突变位点，且该突变位点对鸡的腹脂重和腹脂率有显著影响。本研究对三元育肥猪FABP1基因CDS区进行了克隆测序，发现FABP1基因的CDS区序列全长为383 bp，编码127个氨基酸，其CDS区第53位点处发生了T→A的突变，导致其编码氨基酸的第18位苯丙氨酸突变为酪氨酸^［17-19］，但是该突变是否与脂肪酸合成转运相关，有待进一步研究。

FABP1蛋白通过参与细胞脂肪酸的吸收和运输以及脂肪酸代谢平衡的调节，促进细胞内和细胞间信号传递以维持细胞脂质稳态，对调节脂肪储存和分布具有重要作用^［20］。研究报道，FABP1基因在黔北麻羊的肝脏和十二指肠中的表达最为丰富^［21］，在犊牛和奶牛中十二指肠和空肠中的表达水平较其他肠段要高^［22］。俞英等^［23］研究发现FABP1基因高表达导致杂种鸡的脂肪沉积高于亲本纯种鸡。姜延志等^［13］研究发现FABP1在猪各组织中均表达，且在肝脏中表达量最高。与这些研究结果相似，本研究发现FABP1基因广泛表达于育肥猪的各个组织，其中在肝脏和小肠的表达量较高，在背肌中表达量较低^［17-18］，这可能与小肠内脂质的吸收、肝脏内脂类转运以及脂蛋白代谢等关系。本试验还对FABP1基因在花椒籽替代不同比例玉米饲粮饲喂育肥猪各组织的表达情况进行了检测，与基础饲料饲喂相比，除了心脏和肺脏组织外，FABP1基因在试验Ⅰ、ⅠⅠ和ⅠⅠⅠ组其它组织中的表达量均极显著升高（P<0.01）。FABP1能够对脂肪沉积起到调控作用，参与甘油三酯生成过程，提高甘油三酯沉积从而使肌间脂肪（IMF）含量增多^［24］。本研究结果说明花椒籽能通过影响FABP1基因的表达调控育肥猪脂肪酸的吸收和代谢。

本试验还发现添加花椒籽的育肥猪心脏、肝脏、十二指肠和结肠组织中FABP1基因的表达量随着花椒籽添加量增加而呈下降趋势，回肠和盲肠组织中FABP1基因的表达量随着花椒籽添加量的增加而呈上升趋势，表明FABP1基因表达量降低导致其与脂肪酸结合能力下降，引起甘油三脂总量下降，影响脂肪酸吸收和肝脏磷脂扩散，推测其原因可能是花椒籽较丰富的脂肪酸，超过了组织吸收的最大量。而本研究中试验II组的脾脏、空肠、直肠和背肌组织中FABP1基因的表达量均高于其他组，这个结果说明饲粮中添加5%花椒籽可能是育肥猪最适宜添加水平。有学者报道了金华猪回肠组织FABP1基因表达和背膘厚呈正相关，FABP1基因敲除小鼠的肝脏和肠组织的β-氧化作用减弱，其肠道的脂质分泌量也显著地下降。在本试验中，FABP1基因在肝脏、肠道和背肌组织中的高表达，高表达FABP1基因通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPAR-α）的活性^［25-29］。PPAR-α主要在脂肪酸分解代谢率高的肝脏、背肌和肠道组织等高度表达，能诱导线粒体和过氧化物酶体氧化水平，活化的PPAR-α可以促进脂蛋白酯酶合成，进而促进甘油三脂分解成脂肪酸，同时正反馈调节促进FABP1基因的表达，并介导脂肪酸由胞质转运至多种细胞器，如线粒体（mitochondria）、过氧化物酶体（peroxisomes）、内质网（endoplasmic reticulum）、细胞核（nucleus）和脂滴，引起细胞质内非脂化脂肪酸浓度升高，诱导线粒体和过氧化物酶体等氧化水平刺激脂肪酸的分解代谢，并在肠道组织吸收利用^［9］。结合本试验结果，花椒籽中高脂肪酸可能激活了育肥猪脂肪酸合成代谢通路，进一步通过调控不同组织FABP1基因的表达水平，介导组织脂肪酸的转运和分解代谢，最终影响了育肥猪组织中脂肪酸的组成及含量。

本试验探讨了利用花椒籽替代玉米饲喂100 d且满足出栏屠宰体质量的杜长大三元猪的脂肪酸组成和FABP1基因的表达变化，研究结果说明花椒籽确实可显著改善育肥猪背肌、肝脏和肾周组织的脂肪酸含量，并可能通过影响FABP1基因的表达调节脂肪沉积。但是，本试验结果是否受到花椒籽替代玉米饲喂时间及育肥猪出栏体质量的影响，有待进一步研究。

4 结论

本试验对添加不同比例花椒籽饲喂的育肥猪脂肪酸组成和FABP1基因的表达进行了分析，结果发现添加花椒籽能显著改善育肥猪背肌、肝脏和肾周组织的脂肪酸含量，5%花椒籽饲喂育肥猪的背肌、肝脏和肾周PUFAs显著升高；花椒籽饲喂显著提高猪FABP1基因在猪肝、脾、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、盲肠和背肌组织的表达量，且在添加5%花椒籽饲喂育肥猪的脾脏、空肠、直肠和背肌中，FABP1基因的表达量显著高于其他组。饲粮中添加花椒籽有利于提高猪肉脂肪酸含量，促进脂肪沉积，本研究结果可为将来开发利用花椒籽作为饲料改善猪肉品质提供理论依据。

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基金资助

甘肃省科技创新项目(GSSYLXM-02)

甘肃省青年基金项目(20JR5RA005)