紫草素可抑制在RAW264.7巨噬细胞和斑马鱼幼虫中由脂多糖诱导的炎症反应

Shikonin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW 264.7 macrophages and zebrafish larvae

摘要

目的 通过巨噬细胞和斑马鱼这2种模型来评价紫草素的抗炎作用。 方法 首先使用细胞计数试剂盒检测紫草素对细胞活性的影响，然后将巨噬细胞分为空白对照组、脂多糖组（（LPS 1μg/mL）、LPS（1 μg/mL）+紫草素（0.3、1.5、3 μg/mL））组和紫草素（3 μg/mL）组。采用一氧化氮产生法和酶联免疫吸附法检测促炎因子和促炎细胞介质的含量。在斑马鱼试验中，检测紫草素对斑马鱼胚胎的毒性，并通过存活率、体型、心率和体长等结果，选择合适的紫草素浓度 （0.001、0.01、0.1 μg/mL） 进行后续试验。在转基因斑马鱼卵黄囊中注射2 nL LPS （2 mg/mL）建立炎症模型，测定紫草素处理后卵黄囊中2种细胞（巨噬细胞和中性粒细胞）的募集情况、测定紫草素对脂多糖诱导的斑马鱼心跳的影响。 结果 在细胞研究中，与仅经LPS处理的细胞相比，紫草素的加入可以减少促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的积累。同时，紫草素还能抑制一氧化氮的分泌量，抑制率可达50%。斑马鱼的研究表明，紫草素有效地减少了卵黄囊中两种细胞的大量聚集，最高抑制率为73.3%，也减轻了LPS引起的斑马鱼心率增加的症状。 结论 紫草素可通过抑制巨噬细胞和中性粒细胞的升高来减轻炎症作用，是一种潜在的天然抗炎活性物质，有望进一步发展成为巨噬细胞和中性粒细胞的阻滞剂。

Abstract

Objective The research aimed to evaluate the anti-inflammatory effect of shikonin through macrophage assay and zebrafish assay. Method First，the cell counting kit was used to test the activity of shikonin on cells，and then macrophages were divided into control group，LPS （1 μg/mL） group，LPS（1 μg/mL） plus shikonin （0.3，1.5，3 μg/mL） group，and shikonin （3 μg/mL） group.The levels of pro-inflammatory factors and pro-inflammatory cell mediators were determined by nitric oxide production assay and enzyme-linked immunosorbent assay.In the zebrafish experiment，the toxicity of shikonin to zebrafish embryos was tested，and the appropriate shikonin concentration （0.001，0.01，0.1 μg/mL） was selected for the follow-up experiment by the results of survival rate，body shape，heart rate，and body length.The inflammation model was then established by microinjection of 2nL LPS （2 mg/mL） into the yolk sac of transgenic zebrafish.The recruitment of two types of cells （macrophages and neutrophils） in the yolk sac was measured after treatment with shikonin，and then the effect of shikonin on the heartbeat of LPS-induced zebrafish was measured. Result In cell research，the addition of shikonin could reduce the accumulation of the pro-inflammatory cytokines tumour necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） compared to the cells treated with LPS alone.It could also inhibit the secretion of nitric oxide （NO），and the inhibition rate can reach 50%.Research on zebrafish showed that shikonin effectively reduced the mass aggregation of two types of cells in the yolk sac，and the highest inhibition rate was 73.3%.Shikonin also reduced the LPS-induced increase in heart rate. Conclusion Shikonin could alleviate the effects of inflammation by inhibiting the proliferation of macrophages and neutrophils.It is a potential natural anti-inflammatory and is expected to develop into a macrophage and neutrophil blocker.

Graphical abstract

关键词

紫草素 / 脂多糖 / 巨噬细胞 / 中性粒细胞 / 斑马鱼 / 抗炎作用

Key words

shikonin / lipopolysaccharide / macrophages / neutrophils / zebrafish / anti-inflammation

炎症是一种参与激活生理和病理免疫系统的防御过程，是身体对外界刺激的一种防御性反应，它具有高度调节和自我限制的特点，一般对身体有保护作用^［1］。但是严重的炎症反应可导致慢性炎症，如动脉粥样硬化、神经炎症、炎症性肠病，甚至癌症^［2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一种有效的免疫调节剂，作用于Toll样受体（ toll like receptor，TLR4），进而刺激巨噬细胞和中性粒细胞释放促炎细胞因子TNF-α、IL-6和炎症因子NO^［3-5］。炎症介质和细胞因子的大量分泌会激活许多与炎症相关的信号通路，导致有害的后果^［6-7］。因此，我们可以通过调节相关细胞因子来阻断巨噬细胞和中性粒细胞的激活，这是一种较好的缓解炎症性疾病的潜在治疗方法^［8］。综上所述，有必要开发出能够抑制中性粒细胞和巨噬细胞活化的抗炎药物来预防和治疗各种炎症性疾病。

目前，通常使用非甾体抗炎药来治疗炎症。然而，这些药物的使用会带来一些严重的副作用^［9-10］。许多统计数据表明，天然化合物具有多种生物活性，并受到了广泛的关注^［11］。紫草素（SK，图1）是一种从中草药中提取的有效的天然化合物^［12-13］。经过国内外数十年的研究，已证明它具有抗菌^［14］、抗病毒^［15］、抗氧化^［16-17］、抗肿瘤^［18］等多种功能。近年来，其抗炎药理特性引起了研究的兴趣。最近的一项研究表明，紫草素通过抑制NF-κB信号通路和ERK磷酸化来抑制LPS诱导的BV₂小胶质细胞^［19］；CAO等^［20］在研究中证实了紫草素对黑色素瘤活性的抑制作用。在研究药物抗炎活性试验中，通常会选择用LPS构建炎症模型；此外，巨噬细胞RAW264.7是一种应用非常普遍的评价药物对炎症反应抑制作用的细胞株。因此，本研究将用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，评价SK的抗炎活性及其作用机制。

斑马鱼具有高透明度、低维护成本，它和人类基因之间有87%的相似性，已经成为一种有价值的脊椎动物模型生物^［21-22］。在许多药物发现和毒理学研究中，斑马鱼已被用作模式生物，并得到了公众的广泛认可^［23］。此外，斑马鱼胚胎的光学透明度可实现体内炎症的非侵入性和动态成像。而转基因斑马鱼在具备一般斑马鱼的特点之外，还因其携带荧光可以清楚的观察到荧光细胞的聚集情况。目前，证明紫草素药物作用的文献中还未见使用斑马鱼模糊生物，因此本研究引入转基因斑马鱼进行体内试验。

本研究将结合体外试验和体内试验探究紫草素的抗炎活性。先进行体外试验，通过LPS作用于RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，探究紫草素对由LPS诱导的促炎细胞因子和炎性介质TNF-α、IL-6和NO含量的干预作用；同时，结合体内试验，利用转基因斑马鱼研究紫草素在减少斑马鱼卵黄囊中巨噬细胞和中性粒细胞数量和降低心率方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫草素（CAS517-89-5）购自美伦生物技术有限公司，纯度大于99%。转基因斑马鱼（Tg（lyz：DsRed2）和Tg（mpeg1：EGFP））购自国家斑马鱼资源中心。RAW264.7巨噬细胞购自国家细胞资源中心。24/96孔板来自美国康宁公司。NaCl，KCl，CaCl₂和MgSO₄均来自国药控股化学试剂有限公司。二甲基亚砜（DMSO）购自罗恩化工科技有限公司。DMEM、LPS （Escherichia coli 0111：B4）、PS、胰酶、PBS和FBS均来自Sigma-Aldrich。CCK-8来源于日本东仁化工公司。TNF-α和IL-6检测试剂盒来自联科生物技术有限公司。Griess试剂来自碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

BB150二氧化碳恒温培养箱购自赛默飞公司；AE2000T倒置生物显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司；YNERGY2 多功能酶标仪购自伯腾仪器有限公司（ 美国） ；CT14RD 高速冷冻离心机购自上海天美生化仪器设备工程有限公司；荧光显微镜和显微注射体视显微镜均来自蔡司公司。

1.3 细胞的培养和存活率的测量

细胞放在含有1%青霉素-链霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM培养皿，并将其置于37 ℃含有5% CO₂的培养箱中培养。RAW264.7巨噬细胞（1×10⁴个/孔）置于96孔板中，37 ℃培养24 h，然后用浓度为0.15、0.3、1.5、3、6、12 μg/mL的紫草素孵育24 h。每孔放入10% CCK8溶液，在37 ℃下避光培养30 min。取细胞上清液，用酶标仪测量450 nm处的吸光度值，然后计算细胞活力。

1.4 NO含量的测量

RAW264.7细胞以密度1×10⁵个/孔接种到24孔板中，培养24 h。模型组仅用1 μg/mL的LPS作用。在给药组中，提前1 h加入不同浓度的紫草素（0.3、1.5、3 μg/mL）培养，然后加入1 μg/mL的LPS共培养24 h。从孔板中取50 μL细胞培养基，室温下与50 μL Griess I和50 μL Griess II按顺序混合，整个过程应保持连续。将处理后的孔板放入酶标仪，在540 nm处测量D值。用亚硝酸盐标准品制作标准曲线，将D值带入标准曲线计算，得到相应的NO浓度。

1.5 促炎细胞因子含量的测量

从上述培养基中取出部分细胞上清，使用ELISA试剂盒，根据说明书测定TNF-α和IL-6的浓度。

1.6 斑马鱼的饲养

斑马鱼饲养在温度为28 ℃，盐度为0.03%~0.04%，pH为7.2~7.6的循环水箱系统中，每天早晚喂食草履虫。成年斑马鱼按雌性比例1∶1放在配鱼缸中，第2天早上打开灯，拔掉隔板，让雌雄斑马鱼自然交配产卵，为了保证胚胎的质量，收集胚胎的过程应尽可能控制在30 min范围内。将获得的胚胎保存于E3培养基中（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl₂、0.33 mmol/L MgSO₄溶解在1 L灭菌蒸馏水中），保证每100 mm²放50个胚胎。

1.7 紫草素对斑马鱼胚胎的毒性测量

将紫草素用1/1 000的DMSO溶解，然后用E3培养物稀释至所需的浓度梯度。紫草素浓度设为0、0.001、0.01、0.1、0.4、0.8、1 μg/mL进行毒性试验。将受精后3 d的斑马鱼（dpf）按照每孔10个胚胎置于6孔板中，然后在每个孔中加入5 mL培养液，同时测定不同紫草素浓度作用下斑马鱼的体长。

1.8 斑马鱼炎症模型的建立

斑马鱼胚胎培育2 d后，用荧光显微镜选择有红色和绿光的斑马鱼进行后续试验。选择3dpf的斑马鱼进行显微注射，将2 nL的LPS （2 mg/mL） 注入斑马鱼卵黄囊中建立炎症模型，对照组注射与LPS相同体积的磷酸盐缓冲液。

没有进行模型建立时，转基因斑马鱼卵黄囊部位有且仅有仅有3~5个荧光细胞募集。因此，判断模型建立成功与否的标准即显微注射后卵黄囊部位是否有大量荧光细胞募集情况。

1.9 2种荧光细胞的募集情况

将注射LPS的转基因斑马鱼胚胎置于紫草素浓度为0.001、0.01、0.1 μg/mL的E3培养基中培养24 h，在显微镜下直接观察卵黄囊中荧光细胞的数量。

1.10 斑马鱼心脏跳动率的测量

取上述相同培育条件下的斑马鱼，在显微镜视野下计算1 min斑马鱼的心跳次数，计算心率。

1.11 数据处理

所有数据均以\overline{x}±s表示，重复3次。使用IBM SPSS statistics 30统计软件分析，应用Prism软件绘图，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 细胞存活率

在对药量的合理控制下，紫草素对细胞的毒性几乎不存在。同时，紫草素在体内具有良好的药代动力学和药效学特征。试验结果表明，紫草素在6 μg/mL剂量下具有明显的细胞毒性，细胞存活率仅63.34%；而在剂量≤6 μg/mL下，细胞存活率为87.8%~97.5%，没有明显的细胞毒性。因此，使用浓度为0.3、1.5、3 μg/mL的紫草素进行后续试验。

2.2 紫草素对NO含量的影响

在图3中，空白对照组和仅使用紫草素的组并没有引起NO含量的增加。模型组NO含量为空白对照组的8倍。加入3 μg/mL浓度的紫草素后，对NO含量的抑制率高达50%。

2.3 紫草素对TNF-α和IL-6含量的影响

LPS是一种强大的免疫调节剂，通过作用于细胞TLR4，导致巨噬细胞内的不同通路被激活。被激活的巨噬细胞可产生大量的促炎细胞因子TNF-α和IL-6，进而引发炎症。如此，通过降低TNF-α和IL-6的分泌量来缓解炎症变得至关重要。图4为促炎细胞因子TNF-α和IL-6的含量。图4-A表示TNF-α，图4-B代表IL-6。空白对照组和仅使用紫草素组均未引起TNF-α和IL-6含量的增加，排除了药物会对试验造成干扰和影响。炎症模型构建成功的标准为，模型组中的TNF-α和IL-6水平均显著高于空白对照组。加入紫草素后，随着紫草素浓度的提高，TNF-α和IL-6的分泌量逐渐降低。该结果证明，紫草素可以降低细胞内促炎因子的分泌量，进一步反映出紫草素的抗炎作用。

2.4 紫草素对斑马鱼胚胎的毒性

将斑马鱼胚胎置于含有紫草素的E3培养基中，并始终观察其死亡情况。在图5-A中可以看到，斑马鱼胚胎暴露于0.4、0.8、1 μg/mL时均死亡严重。在紫草素浓度为0.001、0.01、0.1 μg/mL的培养基中没有显著斑马鱼胚胎死亡情况。在这个浓度下，斑马鱼胚胎的心率、体长和生长状况均不受影响。因此，SK浓度为0.001、0.01和0.1μg/mL是最合适的试验浓度。（图5-A为6~48 h内的存活率；图5-B为24 h的心跳速率；图5-C为24 h的体长；图5-D为不同浓度紫草素对斑马鱼胚胎发育的影响）。

2.5 紫草素对LPS诱导的中性粒细胞和巨噬细胞募集数量的影响

图6-A和6-C分别表示巨噬细胞和中性粒细胞的募集情况，从图中可以看出对照组斑马鱼卵黄囊中的荧光细胞数量几乎为零，而在LPS诱导后，在卵黄囊中收集了大量的巨噬细胞和中性粒细胞。加入紫草素后，被募集的巨噬细胞和中性粒细胞数量随着紫草素浓度的增加而减少。图6-B和图6-D分别显示了巨噬细胞和中性粒细胞的定量分析。从图6-D可以看出，当紫草素浓度为0.1 μg/mL时，荧光细胞量最多可以从30减少到8左右。上述结果表明，SK可以降低巨噬细胞和中性粒细胞在卵黄囊部位的大量募集；进而反映出，在斑马鱼模型上，紫草素可以抑制由LPS诱发的炎症反应。

2.6 紫草素对LPS诱导后的心脏跳动速率的影响

如图7所示，LPS导致斑马鱼胚胎心跳速率的增加，而紫草素的加入会减轻心跳速率增加的现象，并且心跳速率会随着紫草素浓度的增加而逐渐降低。试验结果表明，SK具有较强的抗炎作用，是一种潜在的天然抗炎活性物质。图7-A为斑马鱼标记Tg（mpeg1：EGFP）基因；图7-B为斑马鱼标记Tg（lyz：DsRed2）基因。

3 讨论

目前，抗炎药物大多为抗生素类，而抗生素的过度使用极易造成耐药性的发生。如今，耐药性问题已经成为21世纪威胁最大的健康类问题。因此，开发出天然活性药物十分迫切。使用草本药物和天然化合物作为治疗疾病和促进健康的辅助手段在世界范围内越来越流行^［24-25］。到目前为止，中草药的使用已经持续了数千年。紫草（Lithospermum erythrorhizon）最早被纪录在《中国草药》中，以Lithospermum，arnebia，onosma等名字命名。长期以来，Lithospermum erythrorhizon作为一种草药在人们的生活中得到了广泛的应用。紫草素作为紫草中重要的活性成分，被证明具有多种药物活性26。因此，本研究将探究紫草素的抗炎活性，以期为开发天然活性药物提供指导作用。

在细胞试验中，如图3~4中所示，LPS的诱导增加了NO、TNF-α和IL-6的分泌量，紫草素的加入显著降低促炎因子和炎症细胞因子的分泌。在Yang等^［27］的研究中表明，紫草素通过减少促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量发挥抑制乳腺炎的作用。由此可知，本研究中紫草素通过降低促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）和炎症因子（NO）的分泌量发挥对LPS诱导的炎症的干预作用。

在转基因斑马鱼试验中，如图6所示，LPS的诱导导致斑马鱼卵黄囊中聚集了大量的巨噬细胞和中性粒细胞，紫草素的加入显著抑制了巨噬细胞和中性粒细胞的募集数量。Rugg和Zhong^［3］在研究中表明，巨噬细胞和中性粒细胞细胞流入炎症部位引起了炎症发作。肖归等^［28］在研究中证明，热休克因子1（HSF1）通过抑制中性粒细胞浸润减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）。Jeong等^［29］使用斑马鱼模型表明岩藻多糖可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的招募。由此可知，紫草素通过抑制巨噬细胞和中性粒细胞的募集数量发挥抗炎活性。如图7中所示，紫草素预处理组明显缓解了LPS引起的斑马鱼心率加快的症状。Wijesinghe等^［30］在研究中表明，5β-Hydroxypalisadin B可以降低由LPS引起的斑马鱼心跳速率加快现象；倪立颖等^［31］在研究中也说明，羊栖菜多酚可以呈浓度依赖性的降低斑马鱼心跳速率加快症状。因此，紫草素通过降低转基因斑马鱼心跳速率发挥抗炎活性。

4 结论

综上可知，紫草素主要是通过减少巨噬细胞和中性粒细胞的浸润以及干预与这2种细胞密切相关的促炎细胞介质和炎症因子来发挥抗炎活性，这将对天然抗炎药物的开发具有指导性意义。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82103844)