美洲南瓜抗白粉品种筛选及其与生理指标的相关性

Screening of powdery mildew-resistant varieties of Cucurbita pepo and its correlation with physiological traits

摘要

目的 建立美洲南瓜抗白粉病评价指标，筛选抗性较强的品种。 方法 试验以14个美洲南瓜品种为试材，基于病情指数、抗性划分标准和生理指标测定了不同南瓜品种对白粉病的抗性效果，并筛选出抗病品种。 结果 筛选出抗病品种1个、中抗品种5个、感病品种6个和极感品种2个。抗病品种叶片中脯氨酸（Pro）含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）含量、丙二醛（MDA）含量、蜡质含量均高于感病品种，可溶性蛋白（SP）含量低于感病品种，其中蜡质含量、MDA含量、Pro含量、PAL含量与病情指数呈负相关关系，SP含量与病情指数呈正相关关系。 结论 蜡质含量、SP含量、Pro含量、PAL含量、MDA含量均可作为美洲南瓜白粉病抗性品种抗性评价指标。根据病情指数和生理生化指标，JPG2015-44和JPG2015-12为美洲南瓜白粉病抗病品种。

Abstract

Objective This study aimed to establish evaluation indicators for the resistance of Cucurbita pepo to powdery mildew and to screen varieties with stronger resistance. Method In this study，14 varieties of Cucurbita pepo were selected and tested for the resistance to powdery mildew based on disease index，resistance classification standard and physiological index. Result According to the results，one resistant variety，five medium resistant varieties，six susceptible varieties and two extremely susceptible varieties were verified among the 14 cultivars of Cucurbita pepo.The contents of proline （Pro），phenylalanine ammoniase （PAL），malondialdehyde （MDA） and wax in leaves of resistant varieties were higher than those of susceptible varieties，while the contents of soluble protein （SP） were lower than those of susceptible varieties.The contents of wax，MDA，Pro and PAL were negatively correlated with the disease index.SP content was positively correlated with the disease index. Conclusion It was suggested that wax content，SP content，Pro content，PAL content and MDA content can be used as the indexes for resistance evaluation of Cucurbita pepo varieties to powdery mildew.According to the disease index and physiological and biochemical indexes，JPG2015-44 and JPG2015-12 were powdery mildew-resistant varieties of Cucurbita pepo.

Graphical abstract

关键词

美洲南瓜 / 白粉病 / 抗性品种筛选 / 生理指标 / 相关性

Key words

Cucurbita pepo / powdery mildew / resistant variety screening / physiological indicator / correlation

美洲南瓜（Cucurbita pepo）为一年生蔓生草本植物，其具有栽培技术简便、生长周期短、适应能力强、营养丰富、经济效益显著等优点，在我国广泛栽培^［1］。位于甘肃省河西走廊地区东端的武威市是甘肃省重要的农业区及瓜类作物研发和生产基地，美洲南瓜已发展成为当地重要的经济作物之一，但是病害的普遍发生成为制约美洲南瓜产业发展的关键因素之一，其中美洲南瓜白粉病已成为发生最严重的病害之一。

目前，化学防治仍是美洲南瓜白粉病的主要防治方法，但长期使用化学农药，导致病原菌抗药性增加，致使化学药剂施用量增加，进而导致一系列环境安全问题，如污染环境和危害人畜健康等^［2］。因此，寻找安全高效的防治措施已成为美洲南瓜产业健康发展的必然趋势，其中抗病品种的选育和推广是防治植物病害最有效、简便的途径，如预防甜瓜白粉病最有效的方法是选育抗病品种^［3］。

研究表明，病原菌侵染寄主植物组织后，会激发植物体内一系列复杂的防御体系，使植物产生抗病性反应，如产生各种酶和生理生化物质在调控植物抗病过程中扮演重要角色^［4］。戎福喜等^［5］研究表明，黄瓜抗病品系叶片的蜡质含量越高，抗性越强。郭铭等^［6］报道，脯氨酸（Pro）含量与大麦对抗条纹病抗性呈正相关。甜瓜叶片中苯丙氨酸（PAL）含量、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量等与白粉病抗性也存在着显著的相关性^［7］。西瓜抗枯萎病的品种叶片中PAL活性高于感病品种^［8］。同时，植物器官衰老或在逆境情况下，往往发生膜脂过氧化作用产生MDA，MDA的积累会对膜和细胞造成一定的伤害。黄鑫芦等^［9］研究表明，葛拟锈病感病品种的MDA活性高于抗病品种且增幅更大。但是，目前有关美洲南瓜抗白粉品种及抗性评价指标筛选方面的研究较少。

因此，本研究以14个美洲南瓜品种为试材，基于病情指数、抗性划分标准、生理指标筛选和测定不同南瓜品种对白粉病的抗性效果，旨在筛选出对白粉病抗性较强的美洲南瓜品种及抗性评价指标，为美洲南瓜白粉病绿色防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试试剂盒

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性检测试剂盒、可溶性蛋白（SP）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）活性检测试剂盒、脯氨酸（Pro）活性检测试剂盒均购自上海优选生物科技有限公司。

1.1.2 供试品种

供试14个品种美洲南瓜由甘肃省武威金苹果有限责任公司育种基地提供，分别编号为JPG2015-12、JPG2015-14、JPG2015-17、JPG 2015-18、JPG2015-23、JPG2015-25、JPG2015-33、JPG2015-35、JPG2015-37、JPG2015-39、JPG2015-41、JPG2015-42、JPG2015-44、JPG2015-45。

1.2 白粉病发病率及病情指数调查

于2019年6月上旬在甘肃武威金苹果有限责任公司自然发病的美洲南瓜播种田内进行美洲南瓜白粉病调查。共选取了14个美洲南瓜品种，在每个品种小区内采用5点取样法调查，每个样点调查20株美洲南瓜植株，每个植株调查5片叶片，病情分级标准参照王建设等 ^［10-11］ 的方法，具体如下：0级：无病症；1级：叶正面病斑面积<30%，叶背面无病斑；3级：叶正面病斑面积>30%，叶背面病斑面积<10%；5级：叶正面病斑面积>30%，叶背面病斑面积>10%，叶柄上出现少量病斑；7级：叶正面覆盖霉层，叶背面的病斑面积>10%，叶柄上有较多病斑，主茎上出现少量病斑；9级：叶正面覆盖霉层，叶背面的病斑面积>10%，叶柄上有较多病斑，主茎上覆盖霉层。

发病率和病情指数计算公式分别为：

发病率（%）= 发病叶片数/调查总叶片数×100%

病情指数=\frac{\sum (\mathrm{各级}\mathrm{病叶}\mathrm{数}\times \mathrm{病级}\mathrm{数})}{\mathrm{调查}\mathrm{总叶}\mathrm{片数}\times \mathrm{最高}\mathrm{级代}\mathrm{表值}}×100

1.3 美洲南瓜白粉病不同抗性品种筛选

根据病情指数及群体抗病性划分标准，筛选出对白粉病菌不同抗性的美洲南瓜品种。群体抗病性划分标准参照郑坤等^［12］的方法，具体如下：免疫（I）：病情指数为0；抗病（R）：病情指数在20.00以下；中抗（MR）：病情指数在20.01~40.00；感病（S）：病情指数在40.01~60.00；极感（ES）：病情指数在 60.00以上。

1.4 美洲南瓜不同抗性品种生理指标测定

根据1.3抗性鉴定结果，选择9个对白粉病不同抗感类型的美洲南瓜品种作为研究材料，进行以下相关生理生化指标测定。采集发病的叶片带回甘肃农业大学植物病理实验室，进行剪取、称质量、锡箔纸包裹、液氮速冻等处理，最后将样本放入-80 ℃冰箱超低温保存，用于相关指标的测定。蜡质含量的测定参照曹素芳等^［13］的方法，可溶性蛋白（SP）含量、脯氨酸（Pro）含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）含量和丙二醛（MDA）含量测定参照其相应的试剂盒说明书操作。

1.5 数据处理

采用Excel 2007软件进行数据的整理，应用SPASS 19.0软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 美洲南瓜白粉病发病程度调查及抗病品种筛选

如表1所示，美洲南瓜抗病品种平均发病率为83.97%，整体上小于感病品种（平均发病率94.08%）。其中，中抗品种JPG2015-45的发病率最小，为76.0%，极感品种JPG2015-18发病率最高，达到97.8%。病情指数随抗性的减弱呈上升趋势，抗病品种JPG2015-44病情指数最小，为18.37，极感品种JPG2015-18病情指数最大，达到68.96。抗病品种的病情指数显著小于感病品种（P<0.05）。

根据群体抗病性划分标准，对14个美洲南瓜品种的抗性划分如下：免疫（I）：无。抗病（R）：JPG2015-44。中抗（MR）：JPG2015-12、JPG2015-17、JPG2015-33、JPG2015-35、 JPG2015-45。感病（S）：JPG2015-14、JPG2015-23、JPG2015-25、JPG2015-39、 JPG2015-41、JPG2015-42。极感（ES）：JPG2015-18、 JPG2015-37（表1）。

2.2 美洲南瓜对白粉病抗性反应中生化指标测定

2.2.1 叶片蜡质含量与美洲南瓜白粉病抗性关系

由图1可知，美洲南瓜抗病品种的蜡质含量高于感病品种，其中抗病品种JPG2015-44的蜡质含量最高，为5.731 mg/g，感病品种JPG2015-23的蜡质含量最低，为2.489 mg/g。不同白粉病抗性品种间叶片蜡质含量无明显差异。相关性分析可知，蜡质含量与病情指数呈负相关关系，相关系数r=-0.575，即蜡质含量高低与病情指数呈负相关关系，蜡质含量越高的品种，病情指数越低，其抗病性越强。

2.2.2 叶片中丙二醛（MDA）含量与美洲南瓜白粉病抗性关系分析

由图2可知，美洲南瓜抗病品种叶片中丙二醛（MDA）的含量高于感病品种，其中，中抗品种JPG2015-12 MDA的含量最高，达到0.060 μmol/g，感病品种JPG2015-37 MDA的含量最低，仅为0.021 μmol/g。经方差分析，美洲南瓜感病品种与抗性品种之间MDA含量差异显著（P<0.05）且不同抗性品种叶片中MDA的含量与病情指数呈负相关，相关系数r=-0.740*，即MDA含量高低与病情指数呈负相关关系，MDA含量越高的品种，病情指数越低，其抗病性越强。

2.2.3 叶片可溶性蛋白（SP）含量与美洲南瓜白粉病抗性关系

美洲南瓜感病品种叶片中可溶性蛋白（SP）平均含量（34.89 mg/g）整体比抗病品种中SP平均含量高36.3%，其中极感品种JPG2015-37叶片的SP含量最高，为51.59 mg/g，抗病品种JPG2015-12叶片的SP含量最低，为12.67 mg/g，其中，抗病品种JPG2015-12的SP含量和感病品种JPG2015-37、JPG2015-18在0.05水平上均存在显著差异（P<0.05）。相关性分析可知，美洲南瓜不同抗性品种叶片中SP含量与病情指数呈正相关（r=0.760*）。由此说明，叶片内SP含量与南瓜品种抗性呈负相关关系，SP含量越低，病情指数越低，抗性越强（图3）。

2.2.4 叶片脯氨酸（Pro）含量与美洲南瓜白粉病抗性关系

抗病品种JPG2015-12叶片的脯氨酸（Pro）含量最高，为358.007 μg/g，感病品种JPG2015-25叶片的Pro含量最低，为141.159 μg/g。感病品种中Pro平均含量（180.008 μg/g）低于抗病品种（249.601 μg/g），其中，抗病品种JPG2015-12和感病品种及极感品种在0.05水平上均存在显著差异。由相关性分析得知，Pro含量与病情指数成负相关关系（r=-0.681*）。由此说明，叶片内Pro含量与美洲南瓜品种抗性呈正相关关系，Pro含量越高，病情指数越低，抗性越强。

2.2.5 叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性与抗病性的关系

如图5所示，对白粉病抗性不同的美洲南瓜品种其叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性也有不同，随品种抗白粉病能力减弱，叶片中PAL活性也呈现降低的趋势。美洲南瓜抗病品种的PAL活性显著高于感病品种（P<0.05），其中中抗品种JPG2015-12的PAL活性最高，达到185.47 U/（g·min），比抗病品种JPG2015-44的PAL活性增加了9.30%；感病品种JPG2015-25的PAL活性最低，仅为83.87 U/（g·min） ，比JPG2015-12的PAL活性降低了54.80%。且中抗品种JPG2015-12与其他美洲南瓜品种间PAL活性均存在显著差异（P<0.05）。经过相关性分析可知，PAL活性与病情指数呈负相关关系（r=-0.652*），即PAL含量高低与病情指数呈负相关关系，PAL含量越高的品种，病情指数越低，其抗病性越强。

3 讨论

叶片蜡质层是抵御和延迟病原菌入侵的有力结构屏障。曹素芳等^［13］研究表明，梨树抗病品种蜡质含量显著高于感病品种。本试验亦得到相似研究结果，蜡质含量与病情指数呈负相关关系，美洲南瓜抗病品种蜡质含量均高于感病品种。

可溶性蛋白可反映寄主体内各种氮代谢及植物-病原菌互作中生理生化反应强度^［14］。有研究指出在病原菌的入侵中会抑制植物内蛋白降解酶活性或增加植物体蛋白合成酶的活性，通常感病植物组织细胞内可溶性蛋白（SP）含量增加，即感病品种SP含量高于抗病品种^［15］。本试验结果发现美洲南瓜叶片中SP含量与白粉病抗性呈负相关，SP含量越低，抗性越强。

脯氨酸（Pro）是植物体内一种重要的渗透调节物质，在抗白粉病红三叶无性系筛选及其抗性生理研究中发现随着抗病性减弱，游离Pro降低，免疫植株游离Pro含量是高感植株的2倍^［16］。刘会宁等^［17］在研究生理生化指标与葡萄抗白粉病的关系中发现葡萄叶片中Pro含量与抗病性呈正相关，本试验结果表明Pro含量与美洲南瓜白粉病抗性呈正相关，Pro含量越高，南瓜植株抗病性越强。

相关研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和丙二醛（MDA）含量可以准确反映植物遭受逆境伤害的程度，含量越高，伤害程度越大，抗逆境的程度越大^［18-19］。曹燕燕等^［20］研究发现不同甜瓜品种的抗病性与PAL含量呈正相关关系，PAL含量越高，抗病性越强。董文科等^［21］研究发现不同草地早熟禾品种的抗病性与MDA含量呈正相关关系，MDA含量越高，抗病性越强。本研究发现美洲南瓜抗性品种MDA含量和PAL含量均明显高于感病品种，这与张梅等^［22］研究 MDA含量对草莓抗白粉病的影响结论相似，但许珂^［23］等对籽用美洲南瓜叶片对白粉病菌的抗逆生理研究中发现，抗病品种PAL含量高于感病品种，而感病品种MDA含量高于抗病品种，这与本研究结果有所不同。这可能与植株中酚类物质氧化程度有关。

4 结论

本试验筛选获得美洲南瓜白粉病抗病品种2个，分别为JPG2015-44，JPG2015-12，并且蜡质含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、苯丙氨酸解氨酶含量均可作为美洲南瓜白粉病不同抗性品种筛选的参考指标。

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基金资助

2021 年甘肃省教育厅度青年博士基金项目(2021QB-025)

甘肃农业大学科技创新基金项目(GAU-XKJS-2018-156)

国家自然科学基金项目(31460518)