豌豆CBF基因家族的生物信息学及低温胁迫下的表达分析

Bioinformatics and expression analysis of pea CBF gene family under low temperature stress

摘要

目的 为了更加全面地探究CBF基因家族在豌豆中的进化及生物学特征。 方法 通过生物信息学方法从基因家族鉴定、结构分析、蛋白基本理化性质、亚细胞定位、染色体定位、顺式作用元件、蛋白质相互作用与表达分析等方面，对豌豆PsCBF基因家族进行系统鉴定和分子特征分析。 结果 在豌豆中共鉴定出21个PsCBF基因，染色体定位显示18个PsCBF基因分布在1、2、4、6与7号染色体上，其余3个未组装到染色体上（PsCBF19~PsCBF21）。21个PsCBF基因编码蛋白的氨基酸数在123（PsCBF09）~349（PsCBF11），且均属于疏水性蛋白。亚细胞定位预测显示18个PsCBF基因（85.71%）定位在细胞核上，二级结构主要以无规则延伸为主。蛋白基序显示同一类群的基因都具相似的保守基序特征且该家族成员包含1~7个保守基序；同一类群的基因也具有相似的基因结构，且该家族基因含1~2个外显子。PsCBF基因启动子区分析表明其含有多种顺势作用元件，在激素反应，组织特异表达以及逆境响应中起作用。蛋白聚类网络图显示其蛋白可能在豌豆应对非生物胁迫中起调节作用。此外，本研究发现低温胁迫后K₂SiO₃处理下大部分PsCBF基因的表达发生显著变化。 结论 本研究结果将为进一步分析豌豆PsCBF转录因子调控碗豆生物学过程及功能、碗豆抗寒的分子鉴定以及抗寒资源创新利用研究提供参考依据。

Abstract

Objective The study was conducted to explore the evolutionary and biological characteristics of CBF gene family in pea. Method bioinformatics methods were used to systematically and molecularly identify the pea PsCBF gene family in terms of gene family identification，structural analysis，physical and chemical properties of protein，subcellular location，chromosome location，cis-acting elements，and protein interactions and expression. Result Twenty-one PsCBF genes were totally identified in pea，and it was showed that 18 PsCBF genes were distributed on chromosomes 1，2，4，6 and 7 through chromosomal location，and the other three genes did not equipped on chromosomes.The 21 PsCBF genes encoded proteins with amino acid numbers ranging from 123 (PsCBF09) to 349 (PsCBF11)，which all belonged to hydrophobic proteins.The prediction of subcellular location showed that 18 PsCBF genes (85.71%) were located on the nucleus，and the secondary structure mainly exhibited random extension.Protein motifs showed that the genes in the same group had similar characteristics of conservative motif，and the family members contained 1-7 conserved motifs; and also they had similar gene structure with 1-2 exons.By the promoter-region analysis of PsCBF gene，it was showed that the promoter contained a variety of cis-acting elements，which played a role in hormone response，tissue-specific expression and stress response.The protein clustering network diagram showed that its protein might play a regulatory role in pea's response to abiotic stress.In addition，it was found that the expression of most PsCBF genes changed significantly under K₂SiO₃ stress. Conclusion The results of this study will provide a reference for further analysis of the mechanism and biological function of PsCBF in regulating the biological processes of pea, the molecular identification of cold resistance of pea,and the research on the innovative utilization of cold resistance resources.

Graphical abstract

关键词

豌豆 / CBF基因家族 / 生物信息学分析 / 基因表达分析

Key words

pea / CBF gene family / bioinformatics / gene expression analysis

豌豆（Pisum sativum L.）是豆科一年生攀援草本，它在全球范围内种植面积约259万hm²，平均产量约为7.7 t/hm²，它包含大量和微量营养素，使其成为满足全球数百万营养不良人群饮食需求的宝贵食物来源。然而在西北种植的豌豆容易受到非生物胁迫的影响，特别是低温、盐碱及干旱的影响。因此，需要我们加强对耐寒、抗冻性强的豌豆品种的选育研究。

冷冻胁迫作为限制植物生长和生产的主要环境因素，严重影响植物的生长发育。当植物受到低温胁迫时，诱导一系列抗性相关基因，例如C-重复结合因子（CBF）和COR^［1］，CBF/脱水响应元件结合（DREB1）蛋白已被鉴定为冷驯化中的关键转录因子，CBF基因家族属于AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive element-binding factor）型转录激活因子，AP2/ERF家族包含一个高度保守的 AP2结构域，它拥有一个60个氨基酸的DNA结合域，其能够特异性识别和结合启动子中的 CRT/DRE 顺式作用元件，激活应激反应基因的表达，从而提高植物的低温抗性^［2］。据报道，低温胁迫拟南芥AP2型转录因子CBFs的表达被激活^［3］。CBF作为转录活化剂，特异性地识别和结合启动子中的CRT / DRE CIS作用元件，以激活应激响应基因的表达，从而提高植物抗低温^［4］。一类CBF基因，CBF/DREB1能够与顺式作用元件CRT/DRE结合从而激活下游冷响应性COR（冷调节）基因的表达，这导致植物耐寒性^［5］。CBF/DREB1由上游转录因子调节，包括CBF表达1诱导剂（Inducer of CBF expression 1，ICE1）。 ICE1-CBF冷应激途径也分别由转录因子CAMTA3和ICE1调节。拟南芥ICE1在正常温度下是无活性的，当植物暴露于低温时，ICE1的表达被激活，并且ICE1蛋白质与ICE1-box结合从而诱导CBF基因的表达^［6］。CBF1也是COR冷响应基因的转录激活物，其可以特异性地与核心元素CRT/DRE结合并促进下游COR基因的表达，导致激活植物抗性的机制^［7］。CBF基因在植物中高度保守。拟南芥中6个CBF基因家族成员：DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2、DREB1A/CBF3、DREB1D/CBF4、CBF5、CBF6，每个成员均在单独的途径上起作用^［8］。AtCBF1、AtCBF2与AtCBF3具有相同的AP2结构域，也称为DREB1B，DREB1C和DREB1A，这3个基因起源于一个共同的祖先，彼此密切相关，且都定位在4号染色体上^［9］，这3个CBF成员具有不同的作用，通过不同途径响应冷胁迫。而AtCBF4与AtCBF1~AtCBF3的同源性相对较低，且位于5号染色体上，它不能被低温诱导，但可以响应干旱和ABA。AtDDF1和AtDDF2在盐胁迫中起作用^［10］。目前，在多个物种中已经鉴定了CBF基因家族成员并且对其功能进行了研究，包括玉米、水稻、大麦、小麦与油菜^［11-15］。

研究表明CBF基因在低温及干旱胁迫中起着关键作用，CBF基因的过表达显著提高了桦木（Birch）的抗寒性^［16］。在冷胁迫下，过表达拟南芥CBF3基因可以增加木薯、烟草、水稻、油菜和地被石竹中脯氨酸的积累，减少丙二醛的产生以及电解质外渗，从而增强它们的抗寒性^［17-20］。虽然CBF转录因子家族在多个物种中被鉴定出来并且功能已经得到了验证，但豌豆中还尚未见CBF基因的报道，其在低温胁迫下的表达 有待进一步研究。因此，本研究通过对豌豆CBF基因家族成员的分析，为豌豆CBF基因功能研究和抗性育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验材料冬豌豆（冬豌7号）与春豌豆（陇豌6号）来自于省部共建干旱生境作物学国家重点实验室（甘肃农业大学），在人工气候室中培养，栽培基质为蛭石、珍珠岩和泥炭土（体积比为1∶3∶9）。生长条件设定为：25 ℃/20 ℃（白天/晚上），光照12 h，湿度为60%，光合有效辐射为700 μmol/（m²·s）。培养至有10~16片叶的豌豆苗为试验材料，进行不同处理（表1）。在处理5 d后收集豌豆叶片用于后续试验。

1.2 豌豆CBF转录因子家族基因的鉴定

为了鉴定豌豆中的CBF基因，通过URGI基因组数据库（https：//urgi.versailles.inra.fr/Species/Pisum）下载豌豆基因组数据，使用Pfam（http：//pfam.xfam.org/family/PF00010）在线工具下载CBF转录因子的隐马尔科夫模型，基于Hmmer 3.2.1 软件（http：//www.hmmer.org/），以E≤0.1为标准在豌豆数据库中搜索并鉴定豌豆CBF基因家族成员。同时将鉴定所得基因的氨基酸序列通过在线工具Pfam（http：//pfam.xfam.org/family）、SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）以及NCBI CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）综合进行 CBF蛋白质保守结构域预测，记录保守结构域位置信息，除去不含CBF 结构域的基因。

1.3 豌豆CBF转录因子的基本理化性质分析

通过在线软件ExPaSy（https：//web.expasy.org/protparam/）对豌豆CBF转录因子进行氨基酸数量、分子量、等电点、蛋白疏水性、不稳定指数及脂肪酸指数预测分析。二级结构的预测通过在线工具[e-mail]（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html），豌豆CBF蛋白亚细胞定位通过PSORTb v.3.0^［21］ （https：//www.psort.org/psortb/index.html） 进行预测分析。磷酸化位点通过NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 进行预测。

1.4 CBF基因家族系统发育树的构建及染色体的定位

基于鉴定筛选的拟南芥中6个CBF基因家族成员以及马铃薯中10个CBF基因家族成员，通过MEGAX^［22］软件，采取邻近法构建系统发育树。进化树的美化使用在线软件Evolview^［23］（http：//120.202.110.254：8280/evolvi ew）。TBtools软件^［24］进行PsCBF基因的染色体定位。

1.5 基本基序、基因结构、启动子元件与蛋白互作分析

在线工具MEME （http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html）搜索基因的Motif。GSDS（Gene structure display server）（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）搜索基因结构，然后通过TBtools软件绘制基因结构+进化树+基本基序图。用PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺势作用原件分析。STRING version 10 （http：//string-db.org） 进行 PsCBF蛋白互作网络分析。

1.6 实时荧光定量PCR

利用植物总RNA提取试剂盒提取不同处理下豌豆幼苗叶片的PsCBF基因组总RNA，进行实时荧光定量分析。采用 cDNA合成试剂盒合成 cDNA。RT-qPCR（Real time-quantitative pcr）是在瑞士罗氏公司的 LightCycler480 II上使用 AceQ®qPCR SYBR Green Master Mix进行的。以豌豆肌动蛋白（PSActin：Psat1g052320.1）基因作为内参。利用2^-ΔΔCt法确定了基因的相对丰度。试验设3次生物学重复。所有的引物都是由Primer 5.0设计的。

2 结果与分析

2.1 基本理化性质分析与二级结构的预测分析

在豌豆中鉴定出21个CBF家族成员，并命名为PsCBF01~PsCBF21。由表2可得，该家族基因编码的氨基酸数为123（PsCBF09）~349（PsCBF11），分子量为13 901.23（PsCBF09）~39 787.61（PsCBF11），20个PSCBF（除PsCBF15）基因编码蛋白的等电点小于7，说明20个PsCBF蛋白为酸性蛋白。不稳定指数在36.69（PsCBF18）~66.11（PsCBF18），脂肪酸指数在51.45（PsCBF19）~74.81（PsCBF11）。21个PsCBF基因编码蛋白的平均疏水性值均小于0，说明它们均属于亲水性蛋白。

此外，本研究预测了21个PsCBF基因编码蛋白的二级结构。由表 3可知，该家族蛋白的二级结构均由螺旋，延伸链及无规则卷曲组成。在17个PsCBF蛋白中二级结构的比例存在无规则延伸>螺旋>延伸链。同时，无规则延伸在20个PsCBF蛋白中所占的比例均最大。亚细胞定位预测显示18个PsCBF基因（85.71%）定位在细胞核上，2个PsCBF基因定位在细胞质中，1个PsCBF基因定位在微体中。多磷酸化位点在蛋白质翻译后修饰水平上发挥着重大作用^［25］，因此分析了该家族蛋白的磷酸化，由下表可得21个CBF蛋白的磷酸化个数在29（PsCBF16）~83（PsCBF15）。

2.2 系统发育进化树

为了探索CBF家族的进化关系和分类，本研究利用拟南芥，茶树与豌豆的CBF蛋白的氨基酸序列构建了系统发育树。结果如图1所示，这些CBF基因可以分为4个亚组，A组包含5个豌豆PsCBF基因，B组包含5个豌豆PsCBF基因，3个茶树CsCBF基因以及2个AtDDF基因，C组包含7个茶树CsCBF基因，D组包含4个AtCBF基因与11个豌豆PsCBF基因。此外，可以观察到在豌豆中存在6对旁系同源基因（PsCBF01/ PsCBF03、PsCBF05/ PsCBF07、PsCBF08/PsCBF09、PsCBF11/PsCB F12、PsCBF13/PsCBF14及PsCBF19/ PsCBF20），但是这并不存在直系同源基因对。

2.3 豌豆CBF基因家族染色体的定位

如图 2所示，通过豌豆GFF文件，将豌豆CBF家族成员的18个基因定位在染色体上，其余3个基因（PsCBF19，PsCBF20与PsCBF21）尚未组装到豌豆染色体上。其中1号染色体分布基因最多，存在10个CBF家族基因；其次为4号染色体上存在3个PsCBF基因，2号与6号染色体上分别存在2个PsCBF基因，7号染色体上存在1个PsCBF基因。

2.4 基因结构及保守基序分析

外显子-内含子的基因结构在基因行使功能中发挥着关键作用，外显子内多样性不仅是基因家族演化的重要组成部分，而且可能影响其表达。如图3所示，基因结构分析表明，18个PsCBF基因在5'和3'末端均具有末端非编码序列（Untranslation regions，UTRS），PsCBF20基因在5'末端具有UTRS，PsCBF16与PsCBF19基因在末端均不具有UTRS。此外，19个PsCBF基因具有1个外显子（90.48%），且外显子的长度均不同，2个PsCBF基因（PsCBF16与PsCBF19）具有两个外显子，第二个外显子的长度较短。

为了进一步了解PsCBF蛋白之间的系统关系，预测了10个保守的PsCBF蛋白的保守基序（图4）。我们发现位于同一亚族中的基因具有相似的保守基序，21个PsCBF蛋白具有的Motif个数为1~7。Motif 1在PsCBF蛋白中高度保守，它存在于21个PsCBF蛋白中。此外，Motif 5在14个PsCBF蛋白的3末端高度保守。部分基序具有基因特异性，Motif 8 存在于PsCBF08、PsCBF09、PsCBF10、PsCBF15与PsCBF18中，Motif 9存在于PsCBF11、PsCBF12、PsCBF13与PsCBF14中，Motif 10存在于PsCBF13与PsCBF14中。

2.5 启动子元件的分析

启动子的结构影响启动子的亲和力，从而影响基因表达水平。在PsCBF基因的上游启动子区鉴定到了24个与胁迫响应元件（LTR，MBS，TC-rich repeats及WUN-motif），激素响应元件（ABRE，AuxRE-core，TGA-element）以及组织特异表达元件（ARE，MBSI，O2-site及HD-Zip 1）。这些元件在启动子区不均匀的分布（图5），ABRE，CGTCA，TGACG-motif及ARE元件几乎存在于所有的PsCBF基因上游。其中，LTR响应低温，MBS响应干旱；ABRE响应脱落酸，AuxRE、AuxRR-core与TGA-element响应生长素，TGACG-motif与CGTCA-motif响应茉莉酸甲酯，TATC-box与GARE-motif响应赤霉素，TCA-element 响应水杨酸；ARE是厌氧诱导所必须的，GCN4_motif与胚乳特异表达有关，O2-site与玉米醇代谢有关。PsCBF17含有最多的顺势元件（31个），其次是PsCBF20（20个），PsCBF03含有最少的顺势元件（5个）。这些结果表明PsCBF基因不仅参与激素诱导，还在一些非生物胁迫中起作用。

2.6 蛋白质相互作用网络分析

为了进一步研究豌豆PsCBF蛋白间的关系以及它们的调节功能，以拟南芥为模板，构建了豌豆PsCBF间的互作网络图（图6），结果显示21个豌豆PsCBF蛋白均出现在已知的拟南芥蛋白互作网络图中，这暗示可以通过已知功能的拟南芥AtCBF基因预测未知豌豆PsCBF基因的功能。由图5可知，AtDREB1A与10个PsCBF基因高度相似（PsCBF01、PsCBF02、PsCBF04-PsCBF07、PsCBF17、PsCBF 19-PsCBF21），研究表明，AtDREB1A在植物抵御盐胁迫与干旱胁迫中起着关键作用。AtCBF4与5个PsCBF基因序列高度相似（PsCBF03与PsCBF11-PsCBF14），AtCBF4在植物耐旱中起着关键作用。AtERF1与PsCBF10基因序列高度相似。AtESE1与2个PsCBF基因序列高度相似（PsCBF08与PsCBF09）。AtRAP2.11与2个PsCBF基因序列高度相似（PsCBF15与PsCBF18），RAP2.11 在低 K ⁺ 条件下调节 AtHAK5 表达，并且还通过调节低 K⁺ 信号级联中的其他基因促进对低钾条件的协调响应^［26］。

2.7 RT-qPCR分析外源硅酸钾处理对低温胁迫下豌豆幼苗CBF家族基因表达的影响

利用qRT-PCR分析了外源硅酸钾处理对低温胁迫下2个豌豆品种幼苗CBF家族基因表达情况。结果如图7所示，冬豌豆品种中，低温胁迫下9个基因的表达量呈现显著增加的形式（PsCBF01、PsCBF02、PsCBF08、PsCBF11、PsCBF12、PsCBF17- PsCBF20），其中PsCBF10与PsCBF12强烈响应低温胁迫，而其余12个PsCBF基因的表达在低温与对照间不存在显著差异。同时低温胁迫后不同浓度K₂SiO₃处理下，21个PsCBF基因的表达量均发生了显著变化，其中11个基因（PsCBF01~PsCBF03、PsCBF05、PsCBF06、PsCBF10、PsCBF11、PsCBF13、PsCBF14、PsCBF17与PsCBF20）在50 mmol/L的K₂SiO₃下表达量最高，且均显著高于低温处理下的表达，说明一定浓度的K₂SiO₃可以诱导低温胁迫下CBF基因的表达，从而提高豌豆幼苗的抗寒性。春豌豆品种中，与对照相比，只有部分基因（PsCBF09、PsCBF11-PsCBF14、与PsCBF17~PsCBF19）的表达量在低温胁迫下发生了极显著的增加。部分基因（PsCBF01、PsCBF03、PsCBF07、PsCBF08、PsCBF10与PsCBF16）在低温胁迫后与对照相比表达水平没有发生显著变化，也存在部分基因（PsCBF02、PsCBF04、PsCBF05、PsCBF06、PsCBF15、PsCBF20与PsCBF21）在低温胁迫后表达水平低于对照。而在低温胁迫后不同浓度K₂SiO₃处理下，大部分基因的表达量发生了显著的变化，其中PsCBF09与PsCBF16基因的变化最明显。由此可知，不管冬豌豆还是春豌豆，一定浓度的K₂SiO₃均可以诱导其低温胁迫下PsCBF基因发生显著变化，从而应对低温胁迫。

3 讨论

低温是主要的非生物因子，限制作物生产率。当植物受到冷应激时，CBF/DREB转录因子被触发并调节12%的冷响应转录组，显示出在耐寒性的重要作用^［27］。CBF/DREB1基因首先在拟南芥中被鉴定为冷驯化的关键转录因子，在拟南芥中，CBF1、 CBF2和CBF3也称为DREB1b、DREB1c和DREB1a，当植物暴露在低温下时，它们分别迅速诱导出约130个基因，CBF1~CBF3基因的过量表达可以提高转基因植株的耐寒性^［28-29］。并且目前已经报道了在许多植物物种中CBF同系物及其对提高抗冻性的贡献^［30］。到目前为止，尚未见豌豆中CBF基因的报道，在本研究中，在豌豆中共鉴定出21个CBF 直系同源基因，比拟南芥多15个，这可能是物种间基因组大小差异和CBF基因扩增程度不同所导致的。系统发育进化表明在豌豆CBF家族中存在6对旁系同源基因，这可能是基因在进化的过程中发生了复制现象。此外，研究表明转录因子必须在细胞核中才能执行其功能^［31］，本研究预测显示18个CBFs基因定位于细胞核中，说明大多数PsCBFs作为核蛋白主要在细胞核中起作用。

外显子/内含子基因结构的多样性在基因家族成员的进化中起着重要作用。本研究鉴定出的21个PsCBF基因含有外显子的数目为1~2，其中19个PsCBF基因含有1个外显子，表明该物种在进化的过程中具有一定的保守性。此外，PsCBF家族基因属于典型的内含子缺失型，因此在响应环境刺激时，能够短时间内启动基因表达。一些密切相关的PsCBF成员具有相似的结构，这可能意味着这些 CBF 蛋白的功能相似。 每个分支中特定序列的存在可能具有特定功能。大多数CBF蛋白在基因结构和基序组成方面的相似性与CBF基因家族的系统发育分析一致。不同进化分支之间这些特征的差异表明CBF成员的功能多样化。

植物基因启动子是重要的顺式作用元件，位于启动子密码子的上游，是基因转录的控制中心^［32］。本研究CBF基因启动子具有许多与生长和应激反应相关的顺式作用元件，包括低温、干旱、高温，以及渗透胁迫响应元素、光响应元素、植物激素、脱落酸、赤霉素、MeJA、水杨酸和乙烯响应元素。其中应激反应元件：20个MBS（参与干旱诱导的顺式作用元件）、2个WUN-motif，14个TC-rich repeats和9个 LTR，表明CBF基因启动子可能参与了豌豆的生长、发育和抗逆性。这类似于之前关于红树林的报告^［33］。表明PsCBF基因受多种因素的调控，包括非生物胁迫、生物胁迫和生长发育等。基因结构和特征分析结果表明21个PsCBF基因在应对非生物胁迫时可能具有不同的生物学功能。基因通过相互作用网络实现其生物学功能和信号转导途径。因此，研究与基因家族相关的潜在相互作用网络有助于理解基因功能^［34］。本研究中，观察到AtDREB1A（AtCBF3）与10个PsCBF基因高度同源（PsCBF01、PsCBF02、PsCBF04~PsCBF05、PsCBF07、PsCBF 17、PsCBF19、PsCBF20与PsCBF21），DREB1B（AtCBF1）与PsCBF16基因高度同源。而AtCBF1与AtCBF3在提高植物耐寒中发挥着关键的作用^［35］。因此，推测9个PsCBF基因（与拟南芥CBF基因同源的基因）具有相似的功能。

CBF基因家族成员普遍存在于各种生物中，通过调控下游冷应答基因COR参与非生物胁迫的生长发育，在植物对低温胁迫的反应中发挥着关键作用^［36］。例如，AtCBF1~AtCBF3和OsDRE1A能够快速响应低温胁迫^［37］。本研究发现，PsCBF基因家族成员在低温胁迫处理和低温胁迫下K₂SiO₃处理的表达特征不同。在低温条件下，部分基因的表达量发生明显的变化，强烈响应低温胁迫。研究表明AtCBF1~AtCBF3基因的表达在低温下诱导2 h 后达到高峰^［38］。此外，本研究发现不同浓度K₂SiO₃在很大程度上均能诱导PsCBF家族基因的表达，说明一定浓度的K₂SiO₃可以在一定程度上诱导豌豆CBF基因的表达，从而应对低温胁迫对豌豆幼苗所造成的损伤。

总之，本研究鉴定出了21个豌豆PsCBF基因，并通过分析其基本理化性质、系统发育树、保守基序以及基因结构解释其分类及进化关系。启动子区研究与相互作用网络分析证实了PsCBF基因对逆境反应的关键作用。此外，本研究发现低温胁迫后K₂SiO₃处理下大部分PsCBF基因的表达发生显著变化。本研究结果对今后PsCBF基因的功能鉴定和豌豆良种选育具有一定的参考价值。

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基金资助

甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室开放基金课题项目(GSCS-2020-06)

甘肃省科技计划项目(21JR7RA835)

国家现代农业产业技术体系项目(CARS-12)

甘肃省教育科技创新项目(2022A-054)

省部共建干旱生境作物学国家重点实验室（甘肃农业大学）主任基金课题项目(GSCS-2020-Z1)