几种农业废弃物还田对烟草根结线虫病的防治效果

Efficacy of several agricultural wastes returned to the field to control root-knot nematodes in tobacco

摘要

目的 为筛选出防治根结线虫病的有效农业废弃有机物。 方法 选择湖北宣恩烟区根结线虫病发生严重的烟田，以施化学肥料作CK（对照），选用稻壳、烟草秸秆、稻壳+谷糠、烟草秸秆生物有机肥、茶枯等5组不同农业废弃物还田（15 000 kg/hm²）为处理，对根结线虫病防治效果及其土壤酶活性、根系微生物群落的影响进行了研究。 结果 与对照相比，农业废弃物还田后烟株发病率和病情指数均不同程度降低，下降幅度在15.38%~76.91%和70.83%~93.78%，其中处理T₁（稻壳）和处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）的病情指数显著低于对照（P<0.05）。土壤保肥能力增强，有机质含量和碱解氮均呈现不同程度的增加。土壤蔗糖酶活性、脲酶活性显著增加，较对照分别提高了16.65%~73.38%、5.89%~105.88%；磷酸酶活性也有增加的趋势，处理T₅（茶枯）增加幅度达25%。改变了土壤微生物群落结构和丰度，处理T₄（烟草秸秆生物有机肥）微生物门类最丰富，放线菌门（Actinobacteria）在处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）、T₂（烟草秸秆）中相对丰度较高；微生物群类LEFSE差异性分析结果表明，处理T₁（稻壳）中特异微生物群类是根瘤菌科（Rhizobiaceae）。 结论 说明5种农业废弃物还田均能降低根结线虫病的发生程度，使土壤保肥能力增强，较好的改善土壤酶活性和微生物群落结构，其中处理T₁（稻壳）15 000 kg/hm²还田防治效果最好。

Abstract

Objective To screen for agricultural waste that could effectively control root-knot nematode. Method Chemical fertilizers were used as a control， and the effects of five different agricultural wastes such as rice husk， tobacco straw，rice husk and chaff， tobacco straw organic fertilizer and tea cake （15 000 kg/hm²） on root-knot nematode disease， soil enzyme activity and root microbial community were investigated in the tobacco field with severe root-knot nematode disease in Xuan'en，Hubei. Result Tobacco plant incidence and disease index were reduced after the return of agricultural wastes， and the decline rates were 15.38%~76.91% and 70.83%~93.78%，respectively， the disease index of which treatment T₁ （rice husk） and T₃ （rice husk and chaff） were significantly lower than that of CK 93.77% and 89.57%. The soil fertility retention capacity was improved that the content of organic matter and alkali-hydrolysable nitrogen were increased to different degrees. The soil invertase activity and urease activity increased significantly， which were 16.65%~73.38% and 5.89%~105.88% higher than that of the control； the phosphatase activity also had an increasing trend， and the increase rate of treatment T₅ （tea cake） was up to 25%. The soil microbial community structure and composition were changed that the T₄ （tobacco straw bioorganic fertilizer） treatment had the most abundant microbial phylum， and the relative abundance of Actinobacteria were higher in the T₃ （rice husk and chaff） and T₂ （tobacco straw） treatments； the results of the difference analysis of the microbial group LEFSE showed that the specific microbial group in the T₁ （rice husk） treatment was Rhizobiaceae. Conclusion The occurrence of root-knot nematode disease can be reduced，and soil enzyme activity and microbial community structure can be better improved by recycling the five kinds of agricultural wastes， and the treatment of T₁ （rice husk） is the best of all.

Graphical abstract

关键词

农业废弃物 / 还田 / 根结线虫病 / 防治效果 / 酶活性 / 微生物群落

Key words

agricultural waste / returning / root-knot nematode disease / effect / enzyme activity / microbial community

植物寄生线虫是植物侵染性病害的重要病原物之一，据估计，在全球每年造成的作物产量损失高达1730亿美元^［1］。烟草根结线虫病是典型的土传性病害，发生范围广、危害严重、防治难度较大^［2-4］，是许多国家和地区烟草生产的限制因素之一^［5］，在我国主要烟区均有发生，对湖北省烤烟生产的影响呈现日益增加的趋势^［6］。国外从根结线虫的生物学特性、发病规律与土壤条件的关系等方面开展了研究^［7-8］，并通过培育抗根结线虫农作物品种、生物防治等科学手段抑制或减轻根结线虫的发生^［9-10］。国内在根结线虫田间发生规律、土壤性状对根结线虫病发生等级影响以及如何防治等方面开展了系列的研究^{［6，11-13］}。据报道^［14］，土壤改良也能有效防治根结线虫。向土壤中添加绿肥、工业废料等有机物质，可以提高土壤肥力，改良土壤微生物群落结构，或分泌杀线虫的化合物等，从而防治根结线虫。农作物秸秆是农业生产的副产品，也是工农业生产的重要生物资源^［15］。秸秆的利用方式主要为直接还田或作为燃料、饲料、工业原料等，其中秸秆还田是最方便、成本最低的选择^［16］。有研究表明^［17-21］，作物秸秆既是改善土壤肥力状况的重要措施，也是调控土壤微生物和土壤酶活性的物质条件。据报道^［22-23］，施用茶籽饼、生态炭等防治根结线虫效果明显，并对土壤根系微生物和酶活性产生了显著的影响。

稻壳、烟草秸秆、谷糠、茶枯等农业废弃物是湖北省恩施州主要的农作物副产品，目前关于对比多种农业废弃物还田防治烟草根结线虫病方面的研究鲜有报道，本研究选取湖北省重要的烤烟种植产区—恩施州宣恩县为试验地点，研究上述五种农业废弃物还田后对烟草根结线虫病的防治效果以及对土壤酶活性、微生物群落结构变化，以筛选出有效防治根结线虫病的农业废弃物种类，为有效防治烟草根结线虫病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验地概况

试验于2018~2019年开展。试验点位于湖北省宣恩县椒园镇水井坳村3组，海拔1 070 m，N 29°58′41″，E 109°22′35″，常年种植烤烟，烟草根结线虫危害严重，土壤中根结线虫数量达到150 条/g。试验田地势平坦，土壤为山地黄棕壤。土壤基础养分状况：有机质含量25.95 g/kg，碱解氮含量137.55 mg/kg，速效钾含量148.52 mg/kg，有效磷含量22.60 mg/kg。供试烟草（Nicotiana tabacum L.）为当地主栽品种云烟87。

1.2 试验设计

试验设6个处理，CK：施化学肥料；T₁：稻壳；T₂：烟草秸秆；T₃：稻壳∶谷糠=1∶1；T₄：烟草秸秆生物有机肥；T₅：茶枯。各处理N、P₂O₅和K₂O施用量分别为97.5、195、292.5 kg/hm²。还田废弃物用量均为15 000 kg/hm²（主要养分含量见表1），不足的养分用化学肥料［烟草专用复合肥（N、P₂O5、K₂O质量分数分别为8%、16%、24%或10%、10%、20%）、普钙（P₂O₅质量分数12%）和硫酸钾（K₂O质量分数50%）补足。随机区组排列，重复3次，小区长8.25 m、宽4.8 m，株距55 cm，行距120 cm，5月1日移栽。废弃物还田方法：2018年3月份将经过灭菌、充分发酵腐熟处理的试验用稻壳、谷糠等均匀撒到田间，并结合春耕晒垡翻压到土中。

1.3 样品采集

烟叶成熟采收后，各小区随机选取5株，挖出根系，除去表面较大土壤团块及根系上松散粘附的土壤颗粒，用干净的毛刷刷取根系上粘附的约2 mm的根际土。将采集的根周土过16目网筛去除植物碎片，均匀混合后收集在无菌自封袋中，分装成3份，在4 ℃下储存并立即转移到实验室。

1.4 测定内容与方法

1.4.1 烟草根结线虫病的发病情况调查

在烟叶成熟采收结束后，按照烟草病虫害分级及调查方法GB/T 23222-2008^［24］，采用小区普查的方式，调查各处理发病情况，挖开垄体并整体拔出烟株调查各田块烟株根结线虫发病情况和发病程度（0 级、1 级、3 级、5 级、7 级、9 级），统计病情指数和防治效果。

烟田烟草植株根结指数分级标准：

0 级：根部正常；1 级：1/4 以下根上有少量根结；

3 级：1/4 至1/3 根上有少量根结；

5 级：1/3 至1/2 根上有根结；

7 级：1/2 以上根上有根结，少量次生根上有根结；

9 级：所有根上（包括次生根）长满根结。

发病率（%）＝病株数/调查总株数×100%

病情指数=［Σ（各级病株数×该病级值）］/（调查总株数×最高级值）×100

防治效果（%）=［（空白对照区病情指数-处理区病情指数）/空白对照区病情指数］×100%

1.4.2 土壤化学指标与酶活性测定

参照鲍士旦^［25］的方法进行土壤化学指标的测定。参照文献^［26］进行脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定；参照杨兰芳等^［27］的方法进行过氧化氢酶活性检测，以每克土壤分解过氧化氢的毫克数表示。

1.4.3 微生物基因测序

土壤微生物基因测序采用第二代高通量测序技术，利用多样性基因测序对烟株土壤样本进行细菌（16S rRNA）^［28］和真菌（18SrRNA）^［29］序列检测。

土壤微生物基因组总DNA采用Fast DNA^® SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc.USA）试剂盒提取。各样品DNA提取物存于-20 ℃备用。扩增细菌16S rRNA的V₃~V₄可变区，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR反应体系：土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5 μL，Forward引物和 Reverse引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFiHotStartReadyMix 12.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。PCR 产物经纯化、质检建立测序文库，再对文库进行文库纯化、质检后，送上海伯豪生物技术有限公司，采用MiSeq sequencer（Illumina）进行测序。采用Mothur（http：//www.mothur.org/）软件将测序序列去重复，与已知数据库GreenGene、Silva比对，去除嵌合体序列和线粒体、叶绿体序列。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件进行数据整理，使用DPS 7.05 软件对数据做Tukey法差异显著性检验。测序分析通过去除所含低质量碱基的reads，采用Bowtie2软件过滤掉来源于宿主的 reads等手段得到可用于后续分析的有效数据（clean data）。对于Clean Data，使用 SOAP denovo 组装软件进行组装分析（assembly analysis ），组装生成的Scaftigs，过滤掉500 bp以下的片段，并进行统计分析和后续基因预测。

2 结果与分析

2.1 农业废弃物还田对烟草根结线虫防控效果

由表2可知，农业废弃物还田后烟株田间发病率和病情指数均呈现不同程度降低，下降幅度分别在15.38%~76.91%和70.83%~93.78%，其中处理T₁（稻壳）和处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）与CK（施化学肥料）差异达显著水平，处理T₅（茶枯）次之，处理T₂（烟草秸秆）和处理T₄（烟草秸秆生物有机肥）效果较为一般。表明施用含有稻壳或者茶枯的废弃物还田后能够在一定程度上降低烟草根结线虫病的发病率和病情指数。

2.2 农业废弃物还田对土壤主要化学指标的影响

土壤主要化学指标表3显示，pH值在处理T₁（稻壳）、T₂（烟草秸秆）、T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）中增加，T₄（烟草秸秆生物有机肥）、T₅（茶枯）中降低，有机质含量和碱解氮均呈现增加的趋势，以处理T₅（茶枯）增加幅度较大，分别较对照增幅为11.95%和24.17%，说明农业废弃物还田能使土壤保肥能力增强。有效磷含量在处理T₁（稻壳）、T₂（烟草秸秆）中下降，在处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）、T₄（烟草秸秆生物有机肥）、T₅（茶枯）中增加，T₄（烟草秸秆生物有机肥）增加幅度最大为20.65%，速效钾含量呈下降趋势。各处理之间主要化学性状含量差异不显著。

2.3 农业废弃物还田对土壤主要酶活性的影响

土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向^［30］，农业废弃有机物料的施入对土壤酶活性有重要影响（表4）。土壤蔗糖酶活性、脲酶活性明显增加，分别较CK（施化学肥料）提高16.65%~73.38%、5.89%~105.88%；磷酸酶活性有增加的趋势，其中处理T₅（茶枯）增加幅度达25%；过氧化氢酶活性在几个处理中表现规律不一致，处理T₂（烟草秸秆）、T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）下降，处理T₁（稻壳）、T₄（烟草秸秆生物有机肥）、T₅（茶枯）上升，各处理之间差异不显著。说明农业废弃物还田处理对不同种类酶活性的影响不同，对土壤蔗糖酶、脲酶活性和磷酸酶活性有提高的趋势，对过氧化氢酶活性效果不明显。

2.4 农业废弃物还田对土壤微生物群落结构的影响

2.4.1 农业废弃物还田对土壤微生物群落结构门水平上的影响

对各处理土壤微生物测序结果如图1所示，相对丰度排在前8位的有7个细菌的门类、1个真菌的门类，其中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）为细菌的优势类群。废弃物还田后，土壤中酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度呈不同程度下降；拟杆菌门（Bacteroidetes）的平均相对丰度仅为0.42%，以处理T₄（烟草秸秆生物有机肥）最高为1.13%；蓝细菌门（Cyanobacteria）、栖热菌门（Deinococcus_Thermus）、厚壁菌门（Firmicutes）呈增加趋势，其中栖热菌门（Deinococcus_Thermus）为处理T₂（烟草秸秆）、T₄（烟草秸秆生物有机肥）、T₅（茶枯）特有的微生物群落，厚壁菌门（Firmicutes）为处理T₄（烟草秸秆生物有机肥）特有的微生物群落；子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度为0.02%~0.89%，在处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）丰度最高，处理T₅（茶枯）最低。说明不同种类农业废弃物还田后引起了土壤中微生物在门水平上发生了较大的变化。

2.4.2 农业废弃物还田对土壤微生物群落结构属水平上的影响

选取相对丰度排在前10的菌属，其余归为others，见图2。与对照相比，10类菌属在处理T₅（茶枯）中相对丰度升高，为61.76%，其余处理均降低，其中处理T₁（稻壳）、T₂（烟草秸秆）、T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）丰度在55%左右，处理T₄（烟草秸秆生物有机肥）中的相对丰度最低、不足40%。鞘脂菌属（Sphingobium）、类诺卡氏属（Nocardioides）、生丝微菌属（Hyphomicrobiaceae_unclassified）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、贪噬菌属（Variovorax）、壤霉菌属（Agromyces）为各处理的优势菌属。与对照相比，土壤中假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度增加，处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）增加幅度最为明显；贪噬菌属（Variovorax）在处理T₁中相对丰度最大，增幅为42.52%；红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）和中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）相对丰度较低；罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）在处理T₁（稻壳）、T₅（茶枯）表现明显增加，在处理T₂（烟草秸秆）、T₃（稻壳：谷糠=1∶1）、T₄（烟草秸秆生物有机肥）中表现下降的趋势。

2.4.3 不同处理土壤微生物类群LEFSE差异分析

为了找出对不同处理产生显著性作用的物种类群，采用LEFSE方法进行差异性分析（图3 ）。结果表明，在CK（施化学肥料）中起显著作用的微生物群类主要为叶杆菌科（Phyllobacteriaceae）；处理T₁（稻壳）中特异微生物群类主要是根瘤菌科（Rhizobiaceae）；T₄（烟草秸秆生物有机肥）特有的微生物群类为鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）、鞘脂杆菌目（Sphingobacteriales）、微球菌科（Micrococc-aceae）、鞘脂杆菌科无名科（Sphingobacteriales_noname）菌群。

3 讨论

研究结果显示，五种农业废弃物还田后防治根结线虫效果明显，烟株田间发病率和病情指数均呈现不同程度降低，施用含有稻壳的处理T₁（稻壳）和处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）发病率和病情指数均显著下降。并且农业废弃物的还田有效增加土壤中的有机质和碱解氮含量，土壤肥力得以提高。土壤中有机质含量提高，一般都能减轻土传病害的发生^［31］。土壤有机质、碱解氮含量越高，越能为烟株提供充足的养分，从而增强烟株的抵抗力，使烟株免受根结线虫的侵染。此外，土壤中的含氮养分来源之一是由脲酶分解代谢尿素生成的氨，人们普遍认为氨可以减少根结线虫的入侵^［32］。

土壤酶活性受土壤微环境的影响，能有效反映土壤的质量和健康状况^{［20，33］}，轻微的环境改变会使土壤中酶活性发生变化。本试验中稻壳、烟草秸秆、稻壳+谷糠、腐熟的烟草秸秆有机肥及茶枯处理，土壤中蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性明显增加，这与前人的研究结果相似^［34］，其原因可能是上述农业废弃有机物料还田后为微生物代谢提供更多可供分解的植物残体^［21］，进而促进了土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶的产生。

添加不同农业废弃物后，土壤微生物群落结构门水平上增加了蓝细菌门（Cyanobacteria）、栖热菌门（Deinococcus_Thermus）、厚壁菌门（Firmicutes）等微生物群落，还增加了放线菌门（Actinobacteria）相对丰度。这与闫宁等^［35］研究结果一致。说明添加了不同的农业废弃物后，植烟土壤中增加了微生物群落和丰度，可能是由于土壤酶活性越高、土壤微生物丰富度和多样性也越高，活跃的微生物活动与根结线虫竞争营养物质从而抑制了根结线虫的繁殖速度及其活性^［36］。放线菌是植物寄生线虫的重要天敌类群之一，能够产生有抗生或杀线活性的代谢物，破坏线虫体内细胞的正常合成和能量代谢，影响线虫机体正常的生理活动^［14］。处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）病情指数显著低于对照，这跟该处理中放线菌门相对丰度最高可能有直接的关系。假单胞菌属（Pseudomonas）、贪噬菌属（Variovorax）的细菌可能通过多种作用机制抑制根结线虫的活性^［37］，处理T₁（稻壳）中贪噬菌属（Variovorax）、处理T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）中假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度的大幅增加，可能也是引起根结线虫病降低的重要原因。

本研究针对五种不同的农业废弃物还田后，较系统地分析了对根结线虫不同的防治效果、土壤保肥能力、根系一些重要酶活性及微生物群落的变化，归根结底这些变化主要是由于废弃物种类的不同而引起的，这些废弃物种类有中稻壳、烟草秸秆、稻壳+谷糠、腐熟的烟草秸秆有机肥及茶枯，关于茶枯防治根结线虫作用机理较为明确^［23］，因茶饼中含有的茶皂素具有杀虫活性和抑菌活性，被广泛应用于杀灭钉螺等有害软体动物上。而关于稻壳、烟草秸秆及腐熟的烟草秸秆有机肥，本文只对主要营养成分、烟叶收获后土壤根系微生物和酶活进行了检测，这些废弃有机物本身在还田后是否能够释放杀线虫的化合物，或者在分解过程中产生对线虫有杀灭作用的物质并未涉及，下一步推广可能还需要对其作用机制开展深入的研究。

4 结论

总之，在湖北宣恩根结线虫病严重的烟田，农业废弃物还田，能明显增加土壤有机质含量，提高土壤肥力，提高土壤中的关键酶的活性，改善土壤微生物种群结构和相对丰度，起到有效防治根结线虫病的效果。综合比较，处理T₁（稻壳）还田对烟草根结线虫有较好抑制效果，处理T₂（烟草秸秆）、T₃（稻壳∶谷糠=1∶1）效果较为一般。本研究不仅为有效防治烟草根结线虫病提供了理论依据，对于农业废弃物的综合利用也提供了一个新的研究方向。

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基金资助

湖北省局重点项目“烟草根结线虫发生的土壤障碍因子分析及防控技术研究”(027Y2018-001)