大麦叶斑病菌侵染过程及几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性变化的研究

Study on infection process of Bipolaris sorokiniana on barley leaf and the resulting changes of chitinase and β-1，3-glucanase activities

摘要

目的 探究叶斑病菌Bipolaris sorokiniana对大麦叶片的侵染过程。 方法 以大麦感病品种蒙啤1号（MP1）和抗病品种蒙啤3号（MP3）为材料，接菌后，并在不同时间采集MP1发病叶片制做切片，结合石蜡切片和扫描电镜观察叶斑病病原菌对大麦叶片的侵染过程。 结果 接菌后，MP1和MP3中的CHT和β-1，3-GA的活性均高于对照，且MP3中的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性要高于MP1。孢子在接种12~24 h后开始萌发，顶端长出长短不一的芽管；接种36 h后，菌丝伸长且向细胞间隙处直接侵入大麦叶片表皮细胞内，组织内部的孢子主要分布在维管束中；接种4~5 d后，菌丝快速产生分枝，呈网状扩散，叶片表面形成密集的菌丝网，叶片外部出现明显病斑；接种7~14 d后，叶片表皮的孢子明显减少，在维管束组织中存在孢子。 结论 病原菌从细胞间隙侵入可能是该病侵入的主要途径，孢子萌发后形成菌丝进入组织，再向其他部位蔓延，病原菌侵入后期寄主表面菌丝形成网状结构。

Abstract

Objective The study aimed at exploring the infection process of Bipolaris sorokiniana on barley leaves. Method The susceptible barley variety Mengpi1（MP1） and disease-resistant variety Mengpi3（MP3） were employed as materials.After inoculation，the diseased leaves of MP1 at different times were collected to make slices，followed by observing the infection process of leaf spot pathogen on barley leaves by paraffin section and scanning electron microscope. Result The activities of CHT and β-1，3-GA in both MP1 and MP3 inoculated with B.sorokiniana were higher than those in the control，and the activities of chitinase and β-1，3-glucanase in MP3 were higher than those in MP1.Observed with paraffin section and electron microscope，the spores began to germinate 12-24 hs after inoculation，with the germ tubes of different lengths growing on the top.At 36hs after inoculation，the hyphae elongated and directly invaded into the epidermal cells of barley leaves through the intercellular space，and the spores inside the tissue were mainly distributed in the vascular bundles.Four to five days after inoculation，the hyphae quickly branched and spread in a net-like manner，and the dense hyphae nets formed on the leaf surface and the disease spots could be obviously observed outside the leaves.One or two weeks after inoculation，the spores in the leave epidermis significantly declined，while there existed mycelium and spores in the vascular tissue. Conclusion The invasion of pathogenic bacteria through the intercellular space might be the main way of the disease infection.After spore germination，the hyphae formed and invaded into tissues，and then spread to other parts.The hyphae on the surface of the host formed a network structure in the late stage of pathogen invasion.

Graphical abstract

关键词

大麦 / 叶斑病 / 酶活性 / 石蜡切片 / 扫描电镜

Key words

barley / Bipolaris sorokiniana / enzyme activity / paraffin section / scanning electron microscope

大麦（Hordeum vulgare L.）是全球温带气候中最古老、最重要的栽培谷物之一 ^［1］。大麦的产量及种植面积仅次于小麦、玉米和水稻，是位居全球第四的禾谷类作物^［2］。大麦种植历史悠久，广泛分布在世界各地，同时也是我国干旱、半干旱区和部分高寒地区最主要的栽培作物^［3］。大麦因其栽培管理方便、生育期短、蛋白质含量高、蛋白质多样性低、生产成本低等优点，在我国大部分地区均有种植，目前在谷物、饲料、酒精原料、医药工业和保健食品加工等相关领域广泛应用，成为了全世界栽培及生产的重要禾谷类作物之一^［4］。在大麦生长发育过程中，病虫害种类很多，其中以大麦条纹病、网斑病、叶斑病最典型，均可造成大麦产量的重大损失及大麦品质的降低，叶斑病已成为大麦的重要病害之一。

大麦叶斑病（spot blotch）是由麦根平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）引起的一类叶部真菌病害，该病原菌的分生孢子在光学显微镜下其形态一般呈梭形^［5］，可危害多种禾本科作物的叶、芽及根等部位并造成作物的根腐病和叶斑病等其他病害，使作物穗粒数、千粒质量下降，降低谷物的质量和市场价值^［6］。大麦叶斑病多在气候温暖潮湿的地区爆发流行，如东欧、非洲局部地区、美洲及中东等地区多发 ^［7］。在中国，该病害最早发生于内蒙古自治区东部及东北地区，严重时可使其产量减少20%左右。在2011~2013年，该病害在呼伦贝尔市大量爆发，使得该地区的大麦产量损失了15%~30%，严重制约了该市经济的发展^［5］。当植物受到真菌、细菌等病原菌侵害时，无论抗病或感病品种植物体内的一系列防御酶酶活性会发生变化，其中β-1，3-葡聚糖酶（PR-2家族）和几丁质酶（PR-3家族）是植物中研究最多、特征最明确的防御相关蛋白^［8-10］。几丁质酶（CHT）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-GA）早就被认为是植物抗真菌防御的一种，参与植物对真菌病原体的抗性，两者协同可降解真菌细胞壁，起水解作用，强烈抑制许多病原真菌的生长^［11-13］。有人认为植物几丁质酶是对含有几丁质的病原体的防御反应，而β-1，3-葡聚糖广泛分布于各种植物组织中_，可以从致病真菌的菌丝壁释放诱导活性葡聚糖低聚物，从而诱导其自身的合成以及其他参与植物外蛋白和细胞壁沉积的防御相关酶的合成，β-1，3-葡聚糖酶也可作为筛选品种的生化标记^［14-17］。郭焕强等^［7］在鉴定78个大麦主栽生产品种和骨干亲本试验中发现，蒙啤1号抗叶斑病菌的能力弱于蒙啤3号；黄志磊等^［3］通过在不同生育时期叶斑病菌对蒙啤1号和蒙啤3号进行11个生理指标的测定，发现两个品种抗性不同，对叶斑病侵染的反应也有所差异。目前研究大麦叶斑病主要集中在抗性鉴定、抗性品种筛选及病虫害防治等方面，对菌株Bipolaris sorokiniana接种蒙啤1号和蒙啤3号后，植物体内与防御相关酶活性的变化及叶斑病菌侵染寄主植株组织内部变化过程的研究相对较少，在研究患病组织超微结构的变化过程中缺乏系统性，不够详细全面，因此成为人们研究的热点^［18］。袁强等^［18］发现叶斑病菌通过气孔传递到仙客来叶片组织内部，继而扩大侵染；薛春生等^［19］发现新月弯孢菌通过气孔或细胞间隙的方式侵入到玉米叶片组织内部；而对叶斑病病菌在大麦叶片上的侵染和发育过程仍不清楚。叶斑病菌侵染大麦叶片的过程及生理指标测定的研究可更好地了解抗性的生理和分子机制将有助于抗性的改善，也有利于深入探究该病原菌与寄主互作机制^［20］。

本研究以2份大麦品种感病品种蒙啤1号（MP1）和抗病品种蒙啤3号（MP3）及致病菌株Z14485为材料，对大麦叶片中CHT和β-1，3-GA的活性进行测定分析，同时结合石蜡切片技术与扫描电镜技术对大麦叶斑病病原菌侵染过程进行了显微观察。通过对2种防御酶活性的变化和侵染过程的观察研究，了解大麦叶斑病菌侵染初期抗病的生理机制和该病原菌侵染机制，为进一步研究大麦叶斑病的发生、传播及防治提供理论依据，同时也为大麦抗病性鉴定和研究其他真菌与寄主植物互作提供参考和思路^［20］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大麦品种：大麦感病品种蒙啤1号和大麦抗病品种蒙啤3号（由甘肃农业大学麦类课题组提供）。

供试菌株：大麦叶斑病菌Bipolaris sorokiniana菌株选用甘肃农业大学麦类实验室Z14485菌株（由省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室麦类种质创新课题组提供）。

主要试剂：5%次氯酸钠溶液；50%FAA固定液；1%畨红；0.5%固绿；蜡块；二甲苯；无水乙醇等。

1.2 大麦叶斑病人工接种

先进行土壤灭菌。将营养土、沙土放入高压灭菌锅中，温度在50 ℃以上均可，持续30 min左右，将大部分的细菌、真菌等杀灭，排除其他病虫害的发生。将土、沙、蛭石以3∶1∶1混合均匀，分装至直径为10 cm的花盆；用5%次氯酸钠溶液对大麦种子进行消毒，时长约10 min，然后用蒸馏水冲洗4次，直至无刺鼻气味后在培养皿中萌发。将发芽的种子种植于直径10 cm的小花盆内，放置人工气候室内培养，保持温度20~23 ℃；当幼苗长至三叶期时，先将接菌植株用蒸馏水清洗，将叶片表面的蜡质层轻轻擦拭，然后取1 L制备好的孢子悬浮液喷洒在叶片上，浓度为1×10⁵个/mL（0.25% Tween 20），接种后保证室内湿度90%~100%、温度22 ℃，且黑暗保湿24 h，以确保植株发病；对照则是不接菌在相同条件下生长^［21］。每个品种的处理组和对照组均设3次重复。

1.3 大麦石蜡切片样品处理

分别于0、3、12、24、36、48、72 h及7 d采样，取1 cm左右的大麦叶片充分浸泡50%FAA固定液中固定12 h以上，后续脱水透明、浸蜡包埋、修片和切片（切片厚度约4~5 μm）、粘片、脱蜡、染色与封片等步骤参照王跃华等的方法^［22］，最后利用光学显微镜观察并拍照。

1.4 扫描电子显微镜观察的样品处理

待大麦三叶期接菌，分别于接种后0、3、12、24、36、48、72 h及5、7 d随机切取接种叶片进行扫描电镜显微镜观察大麦叶表皮。样品经固定、漂洗、梯度脱水、临界点干燥、黏台、喷金后通过电子显微镜观察并拍照（仪器由甘肃省兰州化物所提供）。

1.5 酶活性测定

β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性测定方法均按照酶活试剂盒（Solarbio，北京）中的说明书进行测定。

2 结果与分析

2.1 叶斑病对不同抗性品种大麦CHT和β-1，3-GA活性的影响

接菌后，在不同时间对MP1和MP3的大麦叶片采样进行酶活性的测定。结果显示：在一定时间内，大麦叶斑病使感病品种和抗性品种大麦中的几丁质酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性较对照均呈上升趋势，且抗性品种（MP3）的酶活性比感病品种（MP1）的酶活性增加显著（图1-A和图1-B）。接菌后各时间内，β-1，3-GA活性呈先下降后上升趋势，但感病品种（MP1）处理组的β-1，3-GA活性均低于抗性品种（MP3）的酶活性，差异显著（图1-A）；在致病力菌株作用下，从12~48 h抗性品种（MP3）处理组的CHT活性高于感病品种（MP1）处理组，差异较小（图1-B）。其中β-1，3-葡聚糖酶活性比几丁质酶活性高且变化明显，因此占主导地位。感病品种（MP1）对致病性菌株酶活性不显著，但与CK相比显著。这也证明了大麦叶斑病可以诱导大麦体内CHT和β-1，3-GA活性变化，当受病原菌侵染时，抗病材料比感病材料反应更快，更早刺激CHT和GLU酶系统做出反应，有效抵御孢子等病原菌的入侵，而感病材料的酶系统相对反应较弱，这也是造成感病材料易被侵染的原因之一。

2.2 病原菌侵染大麦叶片的过程

图2表明，发现叶斑病菌侵染大麦叶片时，上表皮受侵染的症状较下表皮明显，病原菌通过叶片表皮侵入叶片内部，在病原菌的作用下叶片表皮细胞及角质层均受到破坏。石蜡切片表明，接种12~24 h后，可以在叶片组织内观察到孢子，但并未发现菌丝体，推测可能是切片时将散落的孢子带入造成，结合扫描电镜结果并不能说明此时病原菌在组织内产孢；接种36 h后，病原菌侵入组织内产孢，孢子分布在输导组织及叶肉细胞中；接种3 d后，菌丝体存在维管束中，孢子分布在叶肉细胞及叶脉内；接种7 d后，孢子的形态发生变化，集中分布在叶脉；孢子主要分布在维管束组织中，表明病原菌可能是通过菌丝侵入叶片，然后进入组织产孢，再向其他部位延伸（图3）。

2.3 叶斑病侵染过程的显微观察

通过扫描电镜观察不同时间点病原菌侵染的大麦叶片，进一步确定病原菌的侵染过程。正常叶片表皮保卫细胞饱满、形状规则，排列紧密（图4-A）。接菌3 h后孢子还未萌发（图4-B），在接菌12~24 h侵染初期，少数孢子已经萌发，从一端伸展形成长短不一的芽管，附着在叶片的表皮上，芽管形成后并不立即侵入叶片组织，而是沿着叶片表面上扩展伸长，有些孢子散落在细胞间隙（图4-C~F）。接种36 h后这些菌丝快速生长产生分枝并大量繁殖，且菌丝向细胞间隙直接侵入，此时病原菌可能在组织内产生孢子，形成菌丝，再向其他部位蔓延（图4-G）。接菌48~72 h后可观察到表皮结构逐渐遭到破坏，芽管上方膨大，菌丝周围出现一些分泌物，有孢子两端都伸出芽管。此时侵染菌丝也可能直接穿透细胞壁，从而破坏叶片内部组织（图4-H~I）。接种4~5 d后，菌丝在细胞间隙处纵横交错且在表面形成密集的菌丝网，叶片表皮症状明显（图4-J~L）。接种7~14 d后，菌丝在细胞间扩展蔓延，叶片表面形成一些孔口，表皮细胞破坏严重，此时叶片外部出现成片的棕色椭圆形斑点，随时间的推移，病斑点扩大，叶片逐渐出现枯死和变黄的现象。

3 讨论

CHT和β-1，3-GA等一些与抗病相关的酶普遍存在于高等植物体内。真菌细胞壁的主要成分是葡聚糖和几丁质，当植物受到病原菌侵害时，植物体内产生的β-1，3-GA和CHT对病原菌有防卫反应，二者协同降解真菌细胞壁起水解酶作用，CHT和β-1，3-GA的结合对真菌生长有强烈的抑制作用^［23］。史娟等^［24］在研究葡萄霜霉病菌中发现该病菌能促使葡萄叶片中β-1，3-GA和CHT 活性的提高，并且发现这两种酶活性增高的幅度及速度与品种的抗病性表现出正相关；龙艳玲等^［25］在柑桔褐斑病菌侵染柑桔的研究中发现，接种后，柑桔体内的CHT和β-1，3-GA活性抗病种质的增幅高于高感种质，并且抗病种质的防御酶活性升高迅速。本试验对接种后所测得的CHT和β-1，3-GA活性中发现，在接种12 h后随时间的推移，感病品种和抗病品种酶活性整体都呈上升的趋势；β-1，3-GA在抗病品种中具有较高的活性，而在感病品种中具有较低的活性。这一结果与上述等人的研究结果相似，从而进一步证实了叶斑病病原菌能诱导大麦体内β-1，3-GA活性明显增高，且占主导地位。

真菌侵染植物叶片的过程主要通过孢子在寄主表面萌发产生芽管，芽管不断伸长，形成附着胞、侵染垫、侵染钉等一些特殊结构，吸附在寄主表面，从而实现入侵，具体过程与菌株和寄主不同有关^{［18，26-27］}。薛春生等^［19］在新月弯孢菌对玉米叶片上的侵染过程中发现，接种后孢子先萌发，然后菌丝通过气孔或细胞间隙进入表皮细胞，在细胞间扩展，侵染后期侵染丝在叶片表皮形成网状结构。而本研究在对叶斑病病原菌侵染大麦叶片的过程中发现，接种12 h后分生孢子从一端萌发并形成长短不一的芽管；接种36 h后菌丝通过细胞间隙进入表皮细胞内；接种48 h后芽管上膨大，形成一种特殊结构；接种3 d后菌丝快速沿叶表皮伸展，并不断产生分枝；接种4 d后菌丝在表面形成密集的网状结构。植物病原菌在侵染寄主时，会形成一些特殊结构，以达到入侵寄主的目的。袁强等^［18］在观察仙客来叶斑病病原菌侵染过程中，发现菌丝在气孔周围形成一些特殊的侵染结构（如侵染初期，由菌丝构成较小的塞和钉状结构；随侵入时间的延长，这些结构逐渐变成较大的锥和柱等不规则结构）。本试验观察过程中虽未发现塞、钉状结构但也存在侵染的特殊结构，即在接种48 h后芽管附近有特殊结构形成（菌丝顶端略有膨大）；接种4 d后侵染菌丝在叶片表面形成网状结构，这与上述文献的研究结果基本一致。苏丹等^［28］在白头翁叶斑病菌研究过程中发现，芽管大多向细胞间隙进入，即使菌丝附着在气孔上，也未见有菌丝伸入气孔，这与本试验结果一致。这一现象可能与侵染材料及菌株不同有关，所以表现的侵染特征也不同。通过观察石蜡切片发现，孢子和菌丝多聚集在输导组织中，推测病原菌侵入后在韧皮部产孢，使侵染继续扩大。

由于大麦品种抗性不同，因此当叶斑病病原菌侵染时，其发病时间、孢子萌发时间及被侵染细胞的变化会存在差异。本试验选用感病品种为接种材料，更有利于孢子萌发、发育和繁殖，可以更好地了解大麦叶斑病病菌侵染过程并观察此过程形成的一些特殊发育结构。因此结合不同的大麦品种抗性，进一步观察寄主与病菌互作过程中二者细胞内部的超微结构变化情况，为深入探究叶斑病病原菌对大麦的侵染过程及其他真菌病害的防控提供理论依据 ^［29］。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960426)

国家现代农业产业技术体系项目(CARS-05-04B-2)

甘肃省重大专项项目(17ZD2NA016)

甘肃省现代农业产业技术体系特色作物岗位专家项目(GARS-TSZ-2)

甘肃省教育厅产业支撑计划项目(2021CYZC-12)