工业大麻种子及苗期性别鉴定方法的研究

Sex determination methods for seeds and seedlings of Cannabis sativa

摘要

目的 探究工业大麻在生产实践中减少雄株比例，提高雌株比例的方法。 方法 通过形态学观察法、生理代谢差异比较、化学物质鉴定法及DNA分子标记鉴定法对工业大麻的种子及未进行性别分化的苗期叶片进行性别鉴定。 结果 通过测定雌雄工业大麻叶片中的NADH和TTCH含量发现，雌雄性工业大麻叶片的NADH和TTCH含量差异明显。通过显色反应发现，甲基红染色20 h后，雄麻变为紫红色，雌麻变为黄褐色。溴麝香草酚蓝染色12 h后，雌麻变为草绿色，雄麻变为天蓝色。快蓝B盐染色20 h后，雌叶表层纤毛变成淡红色，雄叶纤毛仍为无色透明态。通过特异性序列OPV-08和SCAR1可鉴定工业大麻种子及苗期的雌雄性。 结论 形态学观察法、生理代谢差异比较、化学物质鉴定法及DNA分子标记鉴定法（特异性序列OPV-08和SCAR1）可用于工业大麻的性别鉴定。

Abstract

Objective Research into methods of reducing the proportion of male plants and increasing the proportion of increase the proportion of female plants in industrial hemp production practices. Method The seeds and seedling leaves of industrial hemp without sex differentiation were identified by morphological observation，comparison of physiological and metabolic differences，chemical identification and DNA molecular marker identification. Result By measuring the levels of NADH and TTC in the leaves of male and female industrial hemp，it was found that the levels of NADH and TTCH in the leaves of male and female industrial hemp were significantly different.By the color reaction，after methyl red staining for 20 hours，it was found that the male hemp changed to purple red and the female hemp changed to yellowish brown.After 12 hours of bromothymol blue staining，the female hemp turned grass green and the male hemp turned sky blue.After 20 hours of rapid blue B salt staining，the cilia on the surface of the female leaves turned light red，while the cilia of the male leaves were still colorless and transparent. Conclusion Morphological observation，comparison of physiological and metabolic differences，chemical identification and DNA molecular marker identification （specific sequences OPV-08 and SCAR1） can be used for sex identification of industrial hemp.

Graphical abstract

关键词

工业大麻 / 雌雄鉴定 / 形态学观察 / 代谢差异 / 化学物质鉴定 / 分子标记鉴定

Key words

Cannabis sativa L. / identification of females and males / morphological observation / metabolic differences / chemical identification / identification of molecular markers

大麻（ Cannabis sativa L.），又名汉麻，是木兰纲（Magnoliopsida）荨麻目（Urticales）大麻科（Cannabinaceae）大麻属（Cannabis）一年生草本植物。大麻被认为是人类已知的最古老的作物之一，大麻里面含有大量精神活性成分四氢大麻酚（THC），能够起到致幻作用，其THC含量在5%~20%，更高的可以达到25%~30%^［1-2］。工业大麻又名汉麻，是指四氢大麻酚（THC）含量低于0.3%的大麻品种，是无毒品利用价值的一个品种类型^［3］。

工业大麻种子富含优质蛋白质和不饱和脂肪酸，具有降压调脂、改善消化系统等功效^［4］，其茎秆所含的大麻纤维具有吸湿、散湿、透气等特点，是很好的纺织、造纸和建筑原材料。大麻植株分离得到的黄酮类化合物具有抗菌性、抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤等生物活性^［5］，以及其花、叶中的活性物质如大麻二酚（CBD）广泛应用于医药和化妆品领域，具有重要的生产开发价值^［6-14］。

多数大麻为雌雄异株，少数雌雄同株。因雄麻纤维质量优于雌麻，在生产上，若以收获纤维为目的，则期望主要种植雄麻，若以收获籽粒为目的，则期望主要栽培雌麻。雌株的CBD远高于雄株，但授粉后CBD含量则减少60%，若需获得较高含量的CBD，则需在大麻授粉前鉴别雌雄，剔除雄株。但是，目前尚无准确鉴定工业大麻种子性别的方法，幼苗期也较难分辨，且工业大麻的性别表达受多种因素影响，如温度、光周期、激素、重金属盐等都能诱导大麻性别表达。不能根据收获目的使大麻雌雄株合理搭配，严重制约了工业大麻产业的发展，大麻的产业化发展一直受到性别问题的困扰^［4］。本研究基于前人利用形态观察法、DNA分子标记鉴定法，生理指标比较法，有机溶剂染色等方法对大麻性别鉴定的研究基础，从分子及生理水平对工业大麻种期及苗期进行性别鉴定，并筛选可用于工业大麻的性别鉴定方法，期望为工业大麻的农业生产提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以工业大麻龙麻5号种子及苗期叶片为试验材料，试验材料由黑龙江省泰来农业推广站提供。利用种子的形态特征初步筛选雌雄工业大麻进行种植，在四叶期采摘叶片进行分子鉴定试验，确定性别后进行标注，取雌雄两组工业大麻幼苗各30株，待植株进一步发育后，采摘叶片进行生理指标测定。待分化出性别表征后，确定性别检验鉴别结果。

1.2 方法

挑选饱满的龙麻5号种子，用土质疏松肥沃的砂壤土和蛭石3∶1比例混合进行种植，置于工业大麻基地育苗棚中25 ℃下进行萌发^［15］。在发育的不同阶段采摘试验样本进行试验，多余样本用液氮速冻并保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.1 工业大麻植株的分子鉴定

随机选取已知性别的工业大麻叶片样本，利用SDS法^［16］提取样本基因组DNA，使用超微量核酸蛋白测定仪NP2000c测定DNA浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于4 ℃保存备用。雌、雄工业大麻各随机选取10个有效样品进行单株鉴定，参照姜颖等^［17］、强晓霞等 ^［18］的文献选取雄性引物OPV-08、SCAR1进行PCR鉴定。

OPV-08引物序列为OPV-08F：5′-GGACGG CGTTCCAAACGA-3′，OPV-08R：5′-GGACGG CGTTCCAAACGA-3′，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系总体积为25.0 µL，其中Mix酶为12.5 µL，DNA模板为1.0 µL，OPV-08F为0.5 µL，OPV-08R为0.5 µL，ddH₂O为10.5 µL。反应条件为94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 1 min；36 ℃复性1 min；72 ℃延伸2 min，共进行35个循环，最后72 ℃终延伸5 min。

SCAR1引物序列为SCAR1F：5′-AGGAGGG AACAGGATTTAGCC-3′，SCAR1R：5′-TGCC TTCGTCTTCCTCCTTG-3′。反应体系总体积为 20.0 µL，其中Mix酶为7.0 µL，DNA为2.0 µL，SCAR1F为1.0 µL，SCAR1R为1.0 µL，ddH₂O为9.0 µL。反应条件为 94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，36 ℃复性1 min，72 ℃延伸 2 min，进行35个循环；最后72 ℃终延伸5 min。

1.2.2 工业大麻种子形态观察与分子鉴定

为验证种子形态鉴定对工业大麻雌雄性别鉴定的准确性，根据工业大麻种子的种皮颜色初步将种子分为3类，分别为a深色有花纹、b浅色有花纹和c浅色无花纹，具体如图1所示。各随机选取10粒种子，称质量并记录相关数据。用SDS法提取DNA，利用引物OPV-08和SCAR1进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像仪检测结果。

1.2.3 工业大麻雌雄幼苗生理代谢差异鉴定

TTC鉴定雌雄法参照强晓霞等 ^［18］的试验方法。NADH鉴定雌雄法：称取待测叶片0.5 g，加入5 mL冰冷的0.8 mol/L HClO₄，冰浴中研磨成匀浆，1 000 r/min离心10 min，上清液经单层滤纸过滤；取2 mL滤液，加入蒸馏水2 mL，混匀后得到提取液，利用雌、雄大麻叶片提取液在485 nm处的吸光值计算出TTCH含量，在340 nm处的吸光度值计算出NADH含量。

1.2.4 工业大麻雌雄幼苗化学物质鉴定

根据不同性别工业大麻叶片对不同化学试剂显色不同来区分雌雄幼苗。分别取10组雌雄麻叶片进行试验，方法如下：

1） 利用甲基红溶液进行性别鉴定。使用0.1% 甲基红溶液对浸提幼叶的上清液进行染色，对雌雄麻进行区分。分别剪取已知雌雄的植株幼叶，流水冲洗，吸干表面水分，称0.5 g幼叶，加10 mL蒸馏水、研磨成匀浆，室温浸提1 h后，于4 000 r/min离心5 min，上清液备用。取上清液1 mL，加入2 mL 0.1%甲基红溶液，32 ℃水浴保温，20 h后观察雌雄株颜色变化。

2） 利用溴麝香草酚蓝溶液进行性别鉴定。吸取2 mL工业大麻雌、雄性叶片提取液，加入4倍体积的0.1% 溴麝香草酚蓝（BTB）溶液，混匀置于30 ℃恒温水浴中保温，12 h后测定溶液580 nm的吸光度值，并观察记录雌株和雄株提取液的颜色变化。

3） 利用快蓝B盐溶液进行性别鉴定。取雌、雄工业大麻新鲜叶片，用双面刀片切成薄片，置于快蓝B盐溶液中染色20 h后制成装片，用光学显微镜观察叶片表面纤毛的染色情况。

2 结果与分析

2.1 工业大麻叶片雄性特异性引物的验证

本试验所用基因组DNA的A₂₆₀/A₂₈₀值均在1.7~2.0，A₂₆₀/A₂₃₀值均>2.0，说明提取的DNA纯度较高，无蛋白质和无机盐污染。利用雄性特异性序列OPV-08和SCAR1对工业大麻雌雄株进行验证，结果如图2-A~B所示。从图2-A中可看出，所有雄性植株叶片材料在869 bp处均出现特异性条带，雌株未出现特异性条带；图2-B中所有雄性植株叶片材料在750 bp处均出现特异性条带，雌株未出现特异性条带。与预期结果一致，说明2种引物可以用于工业大麻雌雄株鉴定。

2.2 工业大麻种子形态质量特征及雄性特异性引物的验证

工业大麻不同形态种子的质量特征如图3所示。以OPV-08和SCAR1为引物对种子的分子标记鉴定结果见图4。以雄性引物OPV-08的PCR结果中，a型种子中有2粒出现特异性条带，b型种子中有1粒出现特异性条带，c型种子中有8粒出现特异性条带；以雄性引物SCAR1的PCR结果中，a型种子中有1粒出现特异性条带，b型种子中4粒出现特异性条带，c型种子中有9粒出现特异性条带。

2.3 生理代谢差异法鉴定结果

TTCH含量及NADH含量结果见图5。可以看出，工业大麻雌株TTCH含量髙于雄株。对30株苗期工业大麻的TTCH值分析后发现，11株数值在35.0以下皆为雄性；19株在35.0以上，其中4株为雄性，15株为雌性。利用SPSS软件进行独立样本t检验分析得出，雌雄性TTCH含量检验结果为t=7.125，P=0.002，差异达到极显著水平；雌雄性NADH含量检验分析结果为t=-52.563，P=0.013，差异达到显著水平。雌、雄麻的TTCH含量变化范围分别为（35.87±0.22）和（34.33±0.86）μg/mL；雌、雄麻的NADH含量变化范围分别为（1.41±0.39）和（14.40±0.95）μg/mL。

2.4 化学物质鉴定法结果

2.4.1 甲基红溶液鉴定法结果

未染色前提取液颜色见图6-A，雌性工业大麻叶片提取液呈草绿色，雄性工业大麻叶片提取液，呈嫩绿色。经0.1%甲基红溶液染色后提取液颜色见图6-B。雌性工业大麻提取液颜色变为黄褐色，雄性提取液颜色变为紫红色。10组雌雄叶片均有显色反应。

2.4.2 溴麝香草酚蓝溶液（BTB）鉴定法结果

经BTB溶液染色后，雌、雄株提取液的颜色变化如图6-C所示，雌性大麻提取液为草绿色，雄性大麻提取液为天蓝色。各组均有显色反应。

2.4.3 快蓝B盐溶液鉴定法结果

经快蓝B盐溶液染色后，利用光学显微镜观察结果如图6-D所示。各组均呈现出雌性叶片表层纤毛被染成淡红色，雄性叶片纤毛仍呈现无色透明态。

3 讨论与结论

工业大麻性别鉴定的方法有很多，从鉴定物质大小角度来看，可大致分为分子鉴定和生理学鉴定两类。分子鉴定是利用特异性引物进行标记的一种方法，Mandolino等^［19］利用RAPD 技术从大麻中获得1个400 bp与雄性表型相关的标记，这种标记在不同品种工业大麻中是相对恒定的。陈其军等^［20］利用S401引物扩增得到长度约为2 500 bp的雄性相关片段，其利用RAPD片段得到的雄性DNA标记序列含有多个分散的重复序列，试验结果具有一定的不确定性。李仕金等^［21］利用200条RAPD随机引物进行扩增，引物S208扩增得到1条大小为429 bp与大麻雄性相关的特异条带。郭丽等^［22］利用AFLP标记技术获得1条可用于大麻早期田间性别鉴定的734 bp雄性特异条带。Ottó Törjék等 ^［23］利用RAPD分析技术获得1条长度为151 bp雄性特异条带。Shao H等^［24］利用15个RAPD随机引物进行扩增，引物OPA-04和OPF-05扩增得到3个雌性相关片段，由于提取的DNA样本较小，结果条带显示很弱，不易观察。宋书娟等^［25］利用RAPD技术从不同地区的大麻中获得一个820 bp与雌性表型相关的标记，具有一定代表性。综合文献表明在测定结果的准确性方面，SCAR技术较RAPD技术更符合预期。

本研究在DNA分子标记鉴定试验前期，选用Mandolino等^［19］发现的400 bp大麻雄性相关标记引物，结果显示雌雄麻材料均在500 bp处显现条带，且不具有差异性；选用陈其军等^［20］发现的2 500 bp的雄性相关引物，测定结果均无条带产生；在使用强晓霞等 ^［18］发现的雄性特异性引物SCAR323，雌雄麻均在350 bp处有条带，且不具差异性；使用宋书娟等^［22］发现的雌性特异性引物OPX-09发现，雌雄麻材料在820 bp处均显现条带，不具有差异性；选用Ottó Törjék等^［25］发现的长度为151 bp雄性特异引物进行试验，测定结果雌雄麻均无条带产生。通过预试验筛选引物，仅有姜颖等^［17］和强晓霞等^［18］开发的大麻雄性特异性引物OPV-08和SCAR1两种引物对本研究所用工业大麻的验证具有差异性，孙哲等 ^［26］的研究也验证了OPV-08引物鉴别工业大麻雌雄性的可靠性。结果显示，雄性叶片材料分别在869 bp和750 bp处出现特异性条带，雌性叶片材料均未在特定区域出现特异性条带，与预期结果一致，说明2种引物可以用来鉴定工业大麻雌雄株。

《齐民要术》《农政全书》及《图经本草》等古书中都记载，颜色较黑、籽粒饱满的种子多为雌麻，颜色较浅，籽粒较轻的种子多为雄麻。为验证前人通过形态学鉴别的准确性，以及验证分子标记鉴定是否可应用于种期鉴定，将不同形态的种子分为3类，提取种子DNA，分别利用特异性引物OPV-08和SCAR1进行分子标记试验，结果表明分子标记鉴定法可以鉴别工业大麻种期的雌雄性。但从结果中也可看出，两种引物的鉴定结果有所差别，这可能是由于种子内部的酶活性、次生代谢物质及内源激素含量水平等的不稳定，从而导致个体间雌雄性存在差异，与工业大麻种期雌雄性分化的不确定性有关^［27］，从而导致试验结果与预期结果不一致。可见，传统鉴别工业大麻种子雌雄性的方法具有一定可靠性，但也具有缺陷性，而分子水平鉴定方法更具准确性。

通过测定雌雄工业大麻的TTCH含量和NADH值，经分析比较可发现，雌、雄性材料具有明显差异，且差异显著，本试验测定雌雄工业大麻的NADH值结果与强晓霞等 ^［18］测定大麻的试验数据有所差异，可能是品种差异所导致，且存在极少数大麻的NADH值与其性别结果相反，因此，NADH法具有一定的误差性，但最终试验结论一致。可以说明TTC法和NADH法都可用于工业大麻的雌雄性鉴定。

甲基红溶液染色法结果显示，提取液经32 ℃染色20 h后，雌性呈现黄褐色，雄性呈现紫红色，具有明显差异，与彭子模等^［28］的试验结果雄性植株为黄褐色，雌性植株为黄绿色的预期结果不完全一致。其中，通过对比雌雄性叶片提取液颜色，雌性提取液呈深绿色，雄性提取液呈浅绿色，这与谷雨田等^［29］雌株叶片短而宽，叶色深绿；雄株叶片长而尖，叶色浅绿的观察结果相一致。在嗅麝酚蓝溶液染色鉴定试验中，经30 ℃染色10 h后，雌性工业大麻提取液呈草绿色；雄性大麻提取液呈天蓝色，具有明显色差，这与绞股蓝雌株提取液为黄色，雄株为绿色的试验结果有一定的差异^［30］，也说明嗅麝酚蓝溶液染色法可用于工业大麻的雌雄性鉴定。快蓝B盐染色鉴定法试验结果显示，雌性工业大麻纤毛被染成明显的红色，雄性大麻纤毛仍呈现出透明无色状态，这与Andre C等^［31］的研究结果一致，结果证明快蓝B盐染色鉴定法可用于鉴别工业大麻的雌雄性。

以上试验结果均表明古籍中对工业大麻种期和苗期的形态学鉴定经验具有一定的理论价值，但也具有一定的缺陷性，而现代分子标记法和生理学鉴定法可以更准确地鉴别工业大麻的雌雄性。对于种期鉴定和苗期鉴定来说，种期的性别鉴定具有一定的困难，植株体内内源激素含量随生长变化，光照、温度、水分、土壤养分、二氧化碳含量等都会对工业大麻性别分化产生不同程度的影响^［27］。植株需经后期的性别诱导才能准确地辨别雌雄性。相对于种期鉴定，苗期工业大麻的分子鉴定和生理学鉴定性别方法更具准确性。生理学鉴定法通过雌雄工业大麻与有机试剂的显色作用，可直观颜色结果，且操作简捷。较分子标记鉴定法中DNA分子量小且存在杂质片段，生理学鉴定法更符合现代工业大麻产业性别鉴定的需要。

综上所述，生理学鉴定法中的甲基红溶液鉴定法、BTB溶液鉴定法和快蓝B盐溶液鉴定法对工业大麻的性别鉴定最准确，同时也最为经济便捷，更适用于农业生产。

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基金资助

黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(135509502)

2021年齐齐哈尔大学研究生创新科研项目(YJSCX2021019)