鸡粪和羊粪混合发酵对堆肥优势细菌演替和碳氮损失的影响

Effects of mixed fermentation of chicken manure and sheep manure on the dominant bacteria succession and loss of carbon and nitrogen in compost

摘要

目的 通过探讨不同原料组合如何影响堆肥过程中优势细菌演替进而影响堆肥碳氮损失，为优化堆肥配方、降低堆肥碳氮损失提供理论依据。 方法 以鸡粪、羊粪和玉米秸秆为原料，以鸡粪、羊粪不同比例混合进行堆肥试验，研究了不同配比堆肥对腐熟度特性、养分含量及碳氮损失的影响，并对优势细菌与碳氮损失进行冗余分析。 结果 鸡粪堆肥中的碳氮损失远高于羊粪堆肥；相对于鸡粪堆肥，鸡粪和羊粪混合堆肥可以显著降低堆肥过程的碳氮损失，以鸡粪∶羊粪=1∶3处理效果最好，碳氮损失分别降低了15.63%、57.88%；优势微生物菌群与碳氮损失的冗余分析表明，鸡粪∶羊粪=1∶3处理显著促进了木质纤维素降解和具有固氮功能的细菌丰度，抑制了氨化与反硝化功能的细菌丰度。 结论 鸡粪堆肥过程中加入一定量羊粪，可以改善微生物菌群，降低鸡粪堆肥过程的碳氮损失，提高堆肥质量。

Abstract

Objective This study explored how different raw material combinations changed the succession of dominant bacteria and the loss of carbon and nitrogen in compost，laying a theoretical foundation for optimizing compost formula and reducing carbon and nitrogen loss in compost. Method Chicken manure，sheep manure and corn stalk were used as raw materials in this experiment，and chicken manure and sheep manure were mixed in different proportions for composting test.The characteristics of compost maturity，nutrient content and the loss of carbon and nitrogen in compost were determined，followed by redundancy analysis between the succession of dominant bacteria and carbon/nitrogen loss. Result It was showed that the loss of carbon and nitrogen in chicken manure compost was much more than that in sheep manure compost； and compared with chicken manure compost，the mixed compost of chicken manure and sheep manure could significantly reduce the loss of carbon and nitrogen in the composting process.In the treatment that chicken manure and sheep manure were mixed at the ratio of 1∶3，the losses of carbon and nitrogen were reduced by 15.63% and 57.88%，respectively.The redundancy analysis between dominant microbial flora and carbon and nitrogen loss showed that the treatment （i.e.，chicken manure∶sheep manure =1∶3） significantly promoted the abundances of both lignocellulose-degradation and nitrogen-fixation bacteria，and inhibited the abundances of both ammoniating and denitrifying bacteria. Conclusion It was suggested that adding a certain amount of sheep manure to chicken manure in the composting process could improve the microbial flora and reduce the carbon and nitrogen loss in the chicken manure compost，and thus improve the compost quality.

Graphical abstract

关键词

畜禽粪便 / 堆肥 / 碳氮损失 / 微生物

Key words

livestock manure / compost / loss of carbon and nitrogen / microorganisms

随着人们对肉蛋类的需求增加，畜禽养殖的粪污排放量也显著增加^［1］，据报道2017年中国畜禽粪污产生量约38亿t，秸秆产量可达7亿t^［2］，畜禽粪污的不及时和不当处理将会给大气、土壤和水体环境造成严重污染，并对人类及动物健康形成潜在风险^［3］。然而畜禽粪便中含有丰富的氮磷钾和微量元素等营养成分，是一个巨大的资源库，而高温好氧堆肥技术不仅可以有效解决环境污染问题，而且能够转化为优质的有机肥料^［4］；不仅可以有效地减少化肥的施用，还能增加土壤有机质，实现农田的可持续发展^［5］。堆肥化是微生物作用下对有机物进行矿化和腐殖化的耦合过程^［6］，矿化过程中大量有机物质被微生物转化为NH₃、N₂O、CH₄和CO₂等气体，不仅造成空气污染，而且造成养分损失，降低堆肥质量^［7］。研究表明NH₃挥发导致的氮素损失可达总氮损失的32.3%~50.0%^［8］。堆肥过程中碳氮损失受原料性质（养分含量、C/N和颗粒大小等）和堆肥条件（温度、水分含量和通气等）的共同影响^［9］，而不同畜禽粪便的理化性质和微生物种群存在极大差异。

目前，大多数研究是以单种畜禽粪便为原料进行试验，而对于多种畜禽粪便混合堆肥对堆肥碳氮损失影响报道还鲜少。而不同原料由于来源不同，动物食性不同，导致不同种类畜禽粪便中养分含量和优势微生物菌群不同^［10］。前期试验发现，鸡粪和羊粪相比，鸡粪堆肥具有更强的臭味，所以推测可能鸡粪堆肥过程损失更多的碳氮。因此，本试验以鸡粪和羊粪为原料，以不同配比进行堆肥，探讨鸡粪羊粪混合堆肥对碳氮损失的影响，同时通过基因测序探究混合堆肥中优势菌群的演替，了解不同原料堆肥过程中的主要优势微生物类群，通过优势微生物群落与堆肥碳氮损失之间的相关性分析，阐明混合堆肥中优势菌群的变化对堆肥碳氮损失的影响，为减少堆肥过程中的碳氮损失、提高堆肥质量、科学合理配比生产堆肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用原料鸡粪、羊粪、玉米秸秆均取自甘肃省会宁县养殖场，玉米秸秆粉碎至1 cm左右。各原料的理化性质见表1。

1.2 试验设计

堆肥试验于2020年9月27日~2020年10月18日进行，本试验共设置4个处理，分别为A（鸡粪）、B（羊粪）、C（鸡粪∶羊粪=1∶3）和D（鸡粪∶羊粪=3∶1）。4个处理均用玉米秸秆调至C/N为（25±1）∶1，堆体的含水量控制在（60±1）%，然后混匀装箱（规格为60 cm×60 cm×45 cm的泡沫箱），敞口放置在校园带彩钢板顶的室外进行堆肥，每个处理重复3次。在堆肥后的第0、3、6、9、12、15、21天采集堆肥样品。样品采集前先称质量，然后混合均匀取样。每个样品分成3部分，新鲜样品在4 ℃下储存，用以电导率（EC）、pH值和种子发芽指数（GI）分析；风干样品粉碎过0.1 mm筛，进行氮磷钾和有机质含量测定；真空包装的样品存储在-80 ℃冰箱中用于高通量测序（只有A、B和C处理样品用于测序），将第0天（升温期，用Ⅰ表示）、第6天（高温期，用Ⅱ表示）、第21天（腐熟期，用Ⅲ表示） 的样品送至北京百迈客生物技术有限公司进行基因测序。

1.3 理化指标测定

1.3.1 温度、含水率及pH、EC、GI的测定

每天上午9点和下午3点用温度计记录各堆心及环境温度，并取平均值；采用烘干法测定含水率。准确称取堆肥样品 5.0 g于体积为 100 mL的烧杯中，加蒸馏水50 mL，放入转速为 180 r/min的摇床上振荡90 min，取出静置10 min，然后用 pH 计和电导仪分别测定pH和EC ^［11］。取各堆肥样品5.00 g与蒸馏水按1∶10的比例充分混匀，于摇床振荡2 h，吸取10 mL溶液用转速为3 000 r/min的离心机离心10 min，吸取5 mL上清液加入已铺有滤纸的培养皿中，在滤纸上整齐摆放大小一致的小白菜种子30粒，以蒸馏水为对照，将培养皿放入25 ℃的培养箱中培养2 d，计算每个培养皿中种子的发芽率，用游标卡尺测量小白菜种子的根长，根据以下公式计算发芽指数^［12］：

GI=R_a×L_a/（R_b×L_b）

式中：R_a为样品的发芽率，L_a为样品的总根长（cm），R_b空白的发芽率，L_b为空白的总根长（cm）。

1.3.2 氮、磷、钾和有机质（OM）含量的测定

凯氏定氮法测定氮含量，吸光光度法测定磷含量，火焰光度法测定钾含量，重铬酸钾容量法测定有机质含量，具体方法参照中华人民共和国农业行业标准（NY/T525-2021）有机肥料行业标准^［13］。

1.3.3 堆肥碳氮损失计算

碳损失（［C-loss］）和氮损失（［N-loss］）按照下式计算^［11］：

［C-loss_（i）=［PM_i+1×（1-MC_i+1）×TOC_i+1-PM_i×（1-MC_i）×TOC_i］/TOC₀

［N-loss_（i）］=［PM_i+1×（1-MC_i+1）×TN_i+1-PM_i×（1-MC_i）×TN_i］/TN₀

式中：PM为堆体质量（kg），MC为含水量，TOC为总有机碳含量（g/kg），TN为全氮含量（g/kg），i=1~7，代表采样次数。

1.4 DNA提取和基因组测序

DNA按照VAHTS^®Universal Plus DNA Library Pren Kit for Illumina（ND617-C3-02）试剂盒采用CTAB法提取，使用Qbiut （invitrogen，Qubit 3.0，Qubit TM dsDNA HS Assay Kit）和1%琼脂糖凝胶对DNA进行浓度和完整性检测，取10 ng基因组DNA进行基因组酶切打断和末端修复，用纯化磁珠（VAHTS TM DNA Clean Beads，目录号：N411-03）将连接产物纯化，用引物3'-AGATCGGAAGA GCACACGTCTGAACTCCAGTCAC，5'-AGAT CGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT对纯化产物进行PCR扩增，扩增产物进行纯化、定量形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用illuminanovaseq6000 （SanDiego）上机测序。

1.5 数据处理

本试验理化指标数据采用Excel 2019进行折线图和柱状图绘制。测序数据根据与Non-Redundant Protein Database数据库比对的非冗余基因序列的物种信息得到样本的物种组成和相对丰度，用Python绘制物种组成柱状图，使用Spearman相关性算法进行微生物与碳氮损失的相关性热图绘制和冗余分析（RDA）。

2 结果与分析

2.1 混合堆肥对腐熟度特性的影响

4个处理的腐熟度相关指标如图1所示。4个处理均在第2天进入高温期（≥55 ℃），并持续5 d以上。A、B、C、D的最高温分别为68.3 ℃、67.6 ℃、69.75 ℃、68.16 ℃，A处理的高温期持续时间更长一些。4个处理含水率随着堆肥进入高温期迅速下降，至堆肥结束时各处理分别下降至28.63%、29.24%、26.09%、31.13%，在整个堆肥过程中D混合堆肥的含水率始终高于A、B和C。4个处理的pH呈先下降再上升再下降的趋势，A、D的pH始终高于B、C，4个处理的pH整体略有下降至堆肥结束时都维持在7.5左右，满足微生物生长繁殖适宜的弱碱性环境和堆肥最适pH范围。4个处理EC值随有机物矿化呈上升趋势，堆肥前期上升较快而后趋于稳定，A、D的EC值始终高于B、C，这与鸡粪中更多的盐分和铵有关，至堆肥结束时各处理EC值均低于4 ms/cm的腐熟标准，B和C的EC增幅（50.17%、50%）均高于A和D（27.87%、37.42%）。GI是反映堆肥腐熟度的可靠指标，随着堆肥进程的推进，4个处理的 GI快速升高，堆肥结束时各处理GI均达到80%以上，B、C处理的GI总是高于A、D处理，这可能跟鸡粪含有较高的氨和盐分有关，通过以上指标可以看出4个处理经过21 d堆肥都达到了腐熟的标准。

2.2 混合堆肥对氮、磷、钾和有机质含量的影响

4个处理的氮、磷、钾和有机质含量变化如图2。4个处理的氮含量分别增加了7.5%、4.65%、25.15%和35.22%，磷、钾分别增加了64.69%、66.15%、73.44%、67.76%和52.35%、47.84%、68.91%、55.12%。堆肥结束时，4个处理的氮、磷、钾总量均超过5%的有机肥料标准。D处理的氮、磷、钾含量均最高，且C、D处理的氮、磷、钾增幅均大于A、B处理。4个处理的有机质含量分别降低了23.44%、17.63%、18.85%和21.49%，A和D的有机质含量降幅大于B和C。

2.3 混合堆肥对碳氮损失的影响

各处理碳氮损失如图3、4个处理累积碳损失分别为：54.84%、33.89%、46.27%和60.39%，累积氮损失分别为43.26%、16.04%、18.22%和31.78%，B处理的碳氮损失均最少。相比于A处理，C和D的氮损失分别降低了57.88%、26.54%，C的碳损失降低了15.63%，C处理降低碳氮损失效果更显著，这与堆肥中碳氮转化相关的微生物数量和活性密切相关。

2.4 混合堆肥对优势菌群的影响

微生物是好氧堆肥过程的主要驱动力，微生物数量和活性的变化直接影响堆肥腐熟进程和碳氮损失。门水平上（图4-A），3个处理的优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），但是堆肥过程中各个菌门的相对丰度变化较大。厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）先升高后下降，而拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）与之相反。C处理相比A显著提高了变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）丰度，相比B显著提高了厚壁菌门（Firmicutes）丰度。

属水平的丰度变化更有利于解释堆肥中微生物活动的作用，各处理To30属水平的丰度变化如图4-B。堆肥初期各处理菌属组成丰度差异较大，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和芽孢杆菌属（Bacillus）是3个处理共同的优势属；拟杆菌属（Bacteroides）、梭菌属（Clostridium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和肠球菌属（Enterococcus）主要存在于A中，黄单胞菌属（Luteimonas）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、糖单孢菌属（Saccharomonospora）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和短状杆菌属（Brachybacterium）等主要存在于B中，Planifilum、棒状杆菌属（Corynebacterium）主要存在于C中。C显著提高了拟杆菌属、Planifilum、棒状杆菌属和梭菌属的丰度，显著降低了微杆菌属（Microbacterium）和极小单胞菌属（Pusillimonas）的丰度。

堆肥进入高温期，裂孢菌属（Thermobifida）和芽孢杆菌属丰度骤增，成为3个处理中最具有优势的菌属。糖单孢菌属、Planifilum、类芽孢杆菌属、嗜热新芽孢杆菌属（Novibacillus）也显著升高，而假单胞菌属、拟杆菌属和不动杆菌属显著下降，证明这些菌属不耐高温。A处理丰度最高的前5个菌属为：芽孢杆菌属（16.10%）、裂孢菌属（13.37%）、类芽孢杆菌属（3.80%）、Planifilum（3.10%）和假纤细芽孢杆菌属（Pseudogracilibacillus）；B处理为：裂孢菌属（18.84%）、芽孢杆菌属（4.34%）、嗜热新芽孢杆菌属（3.98%）、糖单孢菌属（3.96%）和黄单胞菌属（Luteimonas）（2.61%）；C处理为：裂孢菌属（15.98%）、芽孢杆菌属（8.96%）、糖单孢菌属（4.75%）、嗜热新芽孢杆菌属（3.82%）和类芽孢杆菌属（3.61%）。C处理相比于A显著提高了裂孢菌属、黄单胞菌属、鞘氨醇杆菌属、糖单孢菌属、Planifilum、嗜热新芽孢杆菌属和大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）等多种菌属的丰度，降低了芽孢杆菌属和不动杆菌属的丰度。C相比于B处理提高了拟杆菌属、Planifilum、类芽孢杆菌属和大洋芽孢杆菌属等菌属丰度。

堆肥进入降温腐熟期，3个处理丰度较高的前5个菌属相同，均为裂孢菌属（4.19%、7.21%、4.52%）、芽孢杆菌属（4.33%、2.50%、5.02%）、乔治菌属（Georgenia）（6.06%、3.31%、6.81%）、黄单胞菌属（4.04%、5.03%、4.02%）和鞘氨醇杆菌属（6.14%、6.37%、6.28%）。C处理显著提高了芽孢杆菌属、假单胞菌属、糖单孢菌属、Planifilum、大洋芽孢杆菌和短状杆菌属的丰度，降低了土地杆菌属（Parapedobacter）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）和微杆菌属丰度。

2.5 优势菌群与碳氮损失的相关性分析

冗余分析（RDA）是了解物种与环境因子之间相关性的重要手段，图5是各菌属与碳氮损失的相关性分析。结果表明，梭菌属、肠球菌属、乳杆菌属、糖单孢菌属、棒状杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和、拟杆菌属与碳氮损失呈显著负相关，表明促进这些菌属丰度有利于降低碳氮损失。芽孢杆菌属、乔治菌属、微杆菌属、类芽孢杆菌属、极小单胞菌属、假纤细芽孢杆菌属和拟诺卡氏菌属等与碳氮损失呈显著正相关，表明降低这些菌属丰度有利于减少碳氮损失。

3 讨论

3.1 混合堆肥促进堆肥腐熟进程

堆肥过程受原料、温度、pH、通风量、C/N等多因素影响，且不同原料是影响堆体腐熟度的重要因素^［14］，温度是高温好氧堆肥中最重要的指标之一，微生物代谢活动离不开合适的温度，前人研究表明堆肥发酵最适温度在50~65 ℃，且持续5 d以上^［15］，温度过高会加剧碳氮损失，过低则会影响腐熟进程，本试验A的高温时间更长一些，但同时也加剧了碳氮损失。水分是微生物生长繁殖的必要条件之一，有机物氧化分解作用会使水分增加，而堆体的通风和高温导致堆肥含水率持续下降^［16］。研究表明鸡粪和羊粪的pH值一般呈中性或弱碱性，合适的pH在7.5~8.5可以使微生物充分发挥作用减少铵氮损失^［17］。EC反映堆肥中可溶性离子浓度，过高时则会对植物产生毒害作用^［18］，鸡粪的EC值通常大于羊粪^［19］，本试验中A和D的pH、EC均高于B和C，证明鸡粪中含有较高的氨和盐分。种子发芽指数（GI）反映堆肥腐熟进程和毒性变化^［6］。本试验表明，混合堆肥比鸡粪堆肥的GI更高更有利于堆肥腐熟，同时降低了毒害作用。至堆肥结束时，各处理腐熟度相关指标均符合国家有机肥标准，且混合堆肥相比单一原料堆肥更有利于堆肥腐熟进程。

3.2 混合堆肥降低堆肥碳氮损失

堆肥中的养分含量是判断堆肥质量的重要依据^［20］。氮素是堆肥中微生物生长代谢的重要营养物质，在堆肥中由于氨化和反硝化作用等造成氮素流失^［21］，而磷和钾性质稳定，不易损失。本研究中氮磷钾含量总体都达到了国家有机肥料标准^［13］，且混合堆肥显著提高了养分含量，D处理效果更显著。有机质是微生物赖以生存和繁殖的基础，有机质的降解程度在一定程度上反映了堆肥进程^［22］，本试验C、D处理有机质降幅小于A，证明混合堆肥可明显减少有机质损失，C效果更好。堆肥中碳氮损失是影响堆肥质量和肥效的重要因素，不仅降低堆肥质量而且污染环境^［23］。而堆肥原料不同造成的碳氮损失也不尽相同，有研究表明堆肥中的碳氮损失约为40%~70%和23.3%~77%^［24］。本研究结果表明，相比于鸡粪堆肥，鸡粪和羊粪混合堆肥显著降低了堆肥过程中的碳氮损失。由此可见，适宜比例的鸡粪和羊粪混合堆肥有助于减少堆肥碳氮损失，提高堆肥养分含量。

3.3 混合堆肥改善优势细菌演替

微生物是影响堆肥腐熟进程和碳氮损失的主要驱动力^［25］。研究表明，厚壁菌门成为高温期优势菌门可能与其中的内孢子具有耐热性有关且厚壁菌门具有水解多糖的功能^［26］，放线菌门具有分解复杂大分子有机物的功能，尤其是木质纤维素的降解，二者均可高温下生长^［11］。裂孢菌属、鞘氨醇杆菌属、糖单孢菌属和Planifilum均具有木质纤维素降解功能，且裂孢菌属是专一的纤维素降解放线菌，该属下的种共产生了5种内切纤维素酶和2种β-木聚糖酶^［27］，它和糖单孢菌属、大洋芽孢杆菌属还被证明有固氮能力^［28］。假单胞菌属和芽孢杆菌属参与木质纤维素降解^［11］。拟杆菌属具有纤维素降解功能，并在蛋白质水解中起重要作用^［29］，棒状杆菌属能够参与硝化作用促进亚硝酸盐的产生^［30］。乔治菌属与NH₄⁺呈正相关，促进氨化作用^［31］。微杆菌属和极小单胞菌属具有反硝化作用^［32］。假单胞菌属、肠球菌属和乳杆菌属参与固氮作用，为堆肥增加氮源^［33］。梭菌属被证明具有固氮能力^［34］，且能分泌多种纤维素和半纤维素酶^［35］。类芽孢杆菌属、假纤细芽孢杆菌属属于反硝化细菌^［36］，芽孢杆菌属既有氨化又有反硝化功能，微杆菌属、拟诺卡氏菌属、极小单胞菌属均可参与反硝化作用^［37］。细菌优势菌群和碳氮损失的相关性分析表明，碳氮损失与固氮类微生物显著负相关，而与氨化、反硝化细菌显著正相关。C处理相对于A处理显著提高了裂孢菌属、鞘氨醇杆菌属、拟杆菌属、糖单孢菌属、Planifilum、大洋芽孢杆菌和棒状杆菌属等促进木质纤维素降解和固氮功能的相关菌群，而抑制了芽孢杆菌属、不动杆菌属、乔治菌属、微杆菌属和极小单胞菌属等具有氨化或反硝化功能的菌属，从而减少了堆肥过程中的碳氮损失。由此可见，适宜比例的鸡粪和羊粪混合堆肥可以显著改善与碳氮转化相关的微生物菌群，促进固氮细菌的生长繁殖，而抑制氨化和反硝化细菌的生长繁殖，从而减少碳氮损失。

4 结论

1） 各处理腐熟度指标和养分含量均达到国家有机肥标准；与鸡粪堆肥相比，鸡粪∶羊粪=1∶3显著降低了堆肥的碳氮损失。

2） 鸡粪∶羊粪=1∶3促进了木质纤维素降解和具有固氮功能的菌属丰度，且抑制了氨化与反硝化功能的细菌丰度，从而减少堆肥碳氮损失。

3） 鸡粪堆肥中加入适量羊粪可以减少碳氮损失，提高堆肥质量。

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基金资助

甘肃省自然科学基金项目(18JR3RA180)

甘肃农业大学学科基金项目(GAU-XKJS-2018-212)