啤特果汁发酵工艺优化

Optimization on the fermentation technology of Piteguo juice

摘要

目的 开发啤特果发酵饮料新产品。 方法 以啤特果汁为原料，通过对不同酵母菌和乳酸菌筛选，在确定了发酵顺序的前提下，采用单因素及响应面设计优化了不同发酵阶段的工艺条件。 结果 安琪耐高糖高活性干酵母菌、干酪乳杆菌更适合作为啤特果汁的发酵菌种；在先酵母菌后乳酸菌发酵，酵母菌接种量1.5%、发酵时间40 h、发酵温度28 ℃，乳酸菌接种量5%、发酵时间16 h、发酵温度37 ℃的条件下，啤特果发酵汁总糖可降至（0.986 ±0.008）g/100 mL。 结论 研究结果为低糖啤特果汁饮品的生产提供了参考。

Abstract

Objective The study was conducted to develop a new product of Piteguo fermented beverage. Method Piteguo was used as the raw material，and different yeasts and lactic acid bacterias were screened.Given the sequence of fermentation，the processing conditions at different fermentation stages were optimized by using the single-factor experimental design and response surface methodology. Result The instant and sugar-tolerant dry yeast of Angel and Lactobacillus casei were more suitable for the fermentation of Piteguo juice than others.Under yeast fermentation followed by lactic acid bacteria fermentation，with the conditions as following： yeast inoculation amount of 1.5%，fermenting for 40 h at 28 ℃，and then fermenting for 16 h at 37 ℃ with a Lactobacillus casei inoculation amount of 5%，the total sugar content in the Piteguo juice fermented could drop to （0.986±0.008）g/100 mL. Conclusion The results could provide a reference for the production of low-sugar Piteguo beverage.

Graphical abstract

关键词

啤特果汁 / 酵母菌 / 乳酸菌 / 发酵 / 工艺优化

Key words

Piteguo juice / yeast / lactic acid bacteria / fermentation / process optimization

啤特果属蔷薇科苹果亚科梨属新疆梨系统（Pyrus sinkiangensis），主要生长在海拔2 000 m以上的甘肃山区，已有上千年栽培历史^［1-2］。后熟的啤特果肉厚汁多、酸甜爽口、香气怡人^［3］，属 “甘肃十大名果” 之一^［4-5］，啤特果富含多种维生素、矿质元素、氨基酸、脂肪、果胶、纤维素、蛋白质、游离酸、多糖等，具有软化血管、消渴止咳、养胃润肺、解酒保肝等功能^［6-8］，在食品、医药等方面具有良好应用前景^［9］。啤特果虽味美营养，但不易贮藏^［10］，产品以果汁饮料为主。传统果汁饮料通常含糖量高（包含蔗糖、果糖、葡萄糖等），可溶性固形物含量达10%以上且常伴有甜味剂等的添加，随着人们保健意识的增强，发酵果汁饮料成为时尚新宠^［11-14］。

发酵微生物通过消耗原料中的糖进行自身代谢，促进活性物质产生^［15］，在降糖的同时可提升果汁的营养和功能^［16］，赋予其特殊的风味和口感，增加产品附加值。Yu Y等^［17］、Filannino P等^［18］、Park J B等^［19］研究发现，利用乳酸菌发酵的果汁，其功能性成分含量及人体吸收率均有提高，果汁风味改善，货架期延长；岑敏连等^［20］用酿酒酵母发酵获得了低糖果汁，且该果汁具有抗氧化、减肥等功效。Di Cagno R等^［21］以植物乳杆菌发酵的石榴汁芳香化合物含量显著增加，醛、硫减少，感官品质提升。张宏志等^［22］用复合菌株发酵的混合果汁含糖量降低，总酸、总酚升高，抗氧化性增强。深入研究表明，多菌种协同发酵相较于单一菌种发酵的果汁活性成分更高、更稳定、糖含量更少，市场前景更广^［23］。由于啤特果汁营养物质含量、pH值等的特殊性，因此选择适宜的菌种及合理的发酵条件是决定果汁品质的关键。本研究通过对不同酵母菌、乳酸菌筛选以及发酵顺序的确定和发酵条件的优化，旨在为发酵低糖啤特果汁饮品生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

啤特果原汁，甘肃和政八八啤特果集团有限公司，可溶性固形物含量为8%；商业安琪耐高糖高活性干酵母（以下简称安琪酵母），中国湖北安琪活性干酵母有限公司；商业科汉森酵母（以下简称科汉森酵母），科汉森（天津）食品添加剂有限公司；蜂蜜结合酵母（Candida utilis），CGMCC编号2.1025，中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），CGMCC编号1.8727，中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；商业酸奶乳酸菌，北京川秀科技有限公司。

HZ85-2磁力搅拌机，北京中兴伟业仪器有限公司，HH-W420电热恒温水浴锅，济南来宝医疗器械公司；电子万用炉，天津天泰仪器有限公司；TJ-270-30A紫外可见分光光度计，天津电子仪表有限公司； FE28-Standard pH计，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；TD-45手持式糖度计，浙江托普云农科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵菌种优选

1.2.1.1 酵母菌筛选

安琪酵母、科汉森酵母、蜂蜜结合酵母，在接种量1.5%、发酵温度28 ℃、发酵时间44 h的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，分别设置接种量为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，发酵温度为25、28、31、34、37 ℃，发酵时间22、28、34、40、46 h，以可溶性固形物含量为指标，每组试验重复3次。

1.2.1.2 乳酸菌筛选

干酪乳杆菌和酸奶乳酸菌，在接种量5%、发酵温度37 ℃、发酵时间16 h的基础条件下，保持其它因素不变，只改变其中一个因素，分别设置接种量为2%、3%、4%、5%、6%，发酵温度为31、33、35、37、39 ℃，发酵时间为8、16、24、32、40 h，以可溶性固形物含量为指标，每组试验重复3次。

1.2.2 酵母菌和乳酸菌接种顺序确定

参考刘仁禄^［24］的方法，采用优选的酵母菌（接种量1.5%）、乳酸菌（接种量5%）将接种顺序分为：A酵母菌和乳酸菌同时发酵；B先酵母菌后乳酸菌发酵；C先乳酸菌后酵母菌发酵，对照组仅酵母菌发酵。以可溶性固形物为指标确定接种顺序。

A：发酵温度34 ℃，发酵时间56 h；B和C：酵母菌发酵时间40 h、发酵温度28 ℃，乳酸菌发酵时间16 h、发酵温度37 ℃，对照组酵母菌发酵时间40 h，发酵温度28 ℃。

1.2.3 发酵工艺条件优化

1.2.3.1 单因素试验

在接种量为1.5%、发酵时间40 h、发酵温度28 ℃，乳酸菌接种量为5%、发酵时间16 h、发酵温度37 ℃的基础条件下，只改变其中一个因素，设置酵母菌接种量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，发酵时间28、32、36、40、44 h，发酵温度26、28、30、32、34 ℃，乳酸菌接种量为2%、3%、4%、5%、6%，发酵时间6、11、16、21、26 h，发酵温度31、33、35、37、39 ℃，以可溶性固形物含量为指标进行单因素试验。

1.2.3.2 响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken试验设计。选取接种量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）三个因素，以啤特果发酵汁总糖含量（g/100 mL）为响应值，对酵母菌及乳酸菌发酵阶段分别进行三因素三水平响应面试验设计。酵母菌因素水平见表1，乳酸菌因素水平见表2。

1.2.4 指标测定

可溶性固形物采用NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》；总糖参照吕伟^［25］的方法，采用苯酚-硫酸法测定；pH值采用GB 10468-1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》；总酸采用GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》；总黄酮参照苏鹏飞^［26］的方法测定。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0、Excel 软件进行数据分析处理并制图。

2 结果与分析

2.1 发酵菌种筛选

2.1.1 酵母菌筛选

由图1可知，安琪（AQ）、科汉森（KHS）、蜂蜜结合（FM）3种酵母菌分别在接种量小于1.5%、1.5%、2.0%时，随接种量的增加啤特果发酵汁可溶性固形物含量不断降低，以安琪酵母菌最明显，继续增加接种量，均无显著变化。图2表明，不同酵母菌随发酵时间延长，可溶性固形物含量均降低，安琪酵母菌最明显，当超过40 h后变化不明显。由图3可知，随着发酵温度的升高，不同酵母菌发酵汁可溶性固形物含量先降低后增加，在28 ℃时，达到各组含量最低值。综上，降低啤特果发酵汁可溶性固形物含量的能力依次为安琪酵母菌>科汉森酵母菌>蜂蜜结合酵母菌，故宜选择安琪酵母菌作为酵母菌阶段发酵菌种。

2.1.2 乳酸菌筛选

图4、5表明，当干酪（GL）、酸奶（SN）乳杆菌接种量小于5% 、发酵时间小于16 h时，可溶性固形物含量随接种量和发酵时间增加呈下降趋势，之后变化不明显。由图6可知，当发酵温度从31 ℃升至37 ℃时，可溶性固形物含量达到最低值。之后随温度升高，可溶性固形物含量不降反升，其原因是过高的温度不利于乳酸菌生长。各图中干酪乳杆菌降幅均高于酸奶乳酸菌。试验表明，宜选择干酪乳杆菌作为乳酸菌发酵阶段菌种。

2.2 酵母菌与乳酸菌接种顺序确定

由图7可知，B（先酵母菌后乳酸菌发酵）接种次序最有利于啤特果汁可溶性固形物含量降低，故宜选择先接入酵母菌后接入乳酸菌的发酵方式。对照组仅接入酵母菌。

2.3 发酵工艺优化

2.3.1 酵母菌发酵阶段

2.3.1.1 单因素试验

图8表明，接种量在0.5%~1.5%之间，可溶性固形物含量降幅明显，1.5%时最低。由图9可知，在26~34 ℃，随着温度的升高，啤特果发酵汁可溶性固形物含量呈先下降后上升的趋势，在28 ℃时最低。图10表明，在28 ~40 h，啤特果发酵汁可溶性固形物含量大幅下降，当超过40 h后，可溶性固形物含量基本无变化。

2.3.1.2 响应面试验

在单因素试验基础上，以总糖含量（g/100 mL）为响应值，选择酵母菌接种量（A）、酵母菌发酵时间（B）、酵母菌发酵温度（C）进行三因素三水平Box-Behnken 响应面优化试验，试验结果见表3。

2.3.1.3 回归方程拟合及方程分析

二次多项式回归拟合得出，发酵汁总糖含量对拟合酵母菌接种量（A）、酵母菌发酵时间（B）、酵母菌发酵温度（C）的回归模型方程为：

总糖=199.427 77-10.885 85A-1.195 75B-

11.698 01C+0.105 62AB-0.083 500AC-

0.012 719BC+2.884 20A²+0.017 769B²+0.217 64C²

回归模型方差分析（表4）可知，总糖含量回归模型P<0.000 1，失拟检验P=0.253 8>0.05，相关系数R²=0.995 4，R_Adj²=0.989 5，表明模型方程达到极显著水平，模型选择合适，方程对试验拟合较好。接种量（A）、发酵时间（B）和发酵温度（C）以及AB的交互项对啤特果发酵汁的影响均为极显著（P<0.01）；AC、BC的交互项对啤特果发酵汁的影响均显著（P<0.05）。

2.3.1.4 响应面和等高线分析

对比三维响应面图11可见，酵母菌接种量与发酵时间的交互作用对啤特果发酵汁的影响为极显著，曲面较凹；等高线形状表明，酵母菌接种量与酵母菌发酵温度、酵母菌发酵时间与酵母菌发酵温度的交互作用对啤特果发酵汁的影响为显著，这与回归方程方差分析的结果一致。

2.3.1.5 酵母菌发酵阶段工艺参数验证试验

通过回归模型预测分析得到酵母菌接种量1.58%，发酵时间39.08 h、发酵温度28.32 ℃，预测总糖含量为1.807 g/100 mL。考虑具体操作，选择酵母菌接种量1.5%，发酵时间40 h，发酵温度28 ℃进行酵母菌发酵阶段工艺参数验证试验，结果表明，在此工艺条件下测定啤特果发酵汁总糖含量为（1.797±0.001）g/100 mL，该工艺可行。

2.3.2 乳酸菌发酵阶段

2.3.2.1 单因素试验结果

由图12可知，接种量2%~6%之间，可溶性固形物含量先降低后增加，在5%时最低；pH值随接种量的增加而逐渐减小，但降幅不大。图13表明，在6~26 h，可溶性固形物含量先降低后趋于平缓，16 h后基本不变；pH在11~16 h降低较明显，这是由于乳酸菌大量增殖发酵产酸，16 h后变化不大。图14可知，在31~39 ℃，可溶性固形物含量先降低后增加，在37 ℃时最低；pH值则变化不明显。

2.3.2.2 响应面试验

在单因素试验结果的基础上，以总糖含量（g/100 mL）为响应值，选择乳酸菌接种量（A）、乳酸菌发酵时间（B）、乳酸菌发酵温度（C）进行三因素三水平Box-Behnken 响应面优化试验。试验结果见表5。

2.3.2.3 回归方程拟合及方程分析

二次多项式回归拟合得到发酵汁总糖含量对拟合乳酸菌接种量（A）、乳酸菌发酵时间（B）以及乳酸菌发酵温度（C）的回归模型方程为：

总糖=177.058 88-6.056 20A-0.671 34B-

8.387 00C-0.0188 00AB+0.054 500AC+

3.20 E-003BC+0.422 30A²+0.019 492B²+0.109 08C²

回归模型进行方差分析（表6）可见，总糖含量回归模型P<0.000 1，失拟检验P=0.240 0>0.05，相关系数R²=0.988 8，R_Adj²=0.974 4，表明模型方程达到极显著水平，模型选择合适，方程对试验拟合较好。乳酸菌接种量（A）、乳酸菌发酵时间（B）对啤特果发酵汁的影响均为极显著（P<0.01），AB、AC的交互项对啤特果发酵汁的影响显著（P<0.05），乳酸菌发酵温度（C）以及BC的交互项对啤特果发酵汁的影响不显著（P>0.05）。

2.3.2 4　响应面和等高线分析

对比三维响应面图15可见，乳酸菌接种量与发酵时间、乳酸菌接种量与发酵温度的交互作用对啤特果发酵汁的影响为显著；等高线形状表明，乳酸菌发酵时间与发酵温度的交互作用对啤特果发酵汁的影响不显著，这与回归方程方差分析的结果一致。

2.3.2 5　乳酸菌阶段发酵工艺参数验证试验

通过回归模型预测分析得到乳酸接种量5.16%，16.68 h发酵时间、发酵温度36.91 ℃，预测总糖含量为1.044 g/100 mL。考虑具体操作，选择5%乳酸菌接种量，16 h发酵时间，37 ℃发酵温度，进行乳酸菌发酵阶段工艺参数验证试验。试验结果表明，在此工艺条件下测得啤特果发酵汁总糖含量为（0.986±0.008）g/100 mL，说明工艺可行。

2.4 指标测定结果

啤特果原汁及酵母菌、乳酸菌发酵阶段其总糖、总酸、总黄酮含量见表7。

由表7可知，啤特果原汁中总糖经酵母菌、乳酸菌双重发酵后降至（0.986±0.008）g/100 mL。总酸由（1.467±0.007）%增加至（2.061±0.018）%。发酵后的啤特果汁总黄酮增加至（0.565±0.009）mg/mL，这与王越等^［27］的报道一致。

3 讨论

酵母菌与乳酸菌混合发酵可改善果汁风味和营养并降低含糖量，选择适宜于啤特果汁中生长、代谢的酵母菌和乳酸菌至关重要。本研究从3种酵母和2种乳酸菌中筛选出了降低啤特果汁可溶性固形物含量能力较强的安琪酵母菌和干酪乳杆菌。

菌种之间存在协同或竞争作用，不同发酵菌种接入顺序对发酵结果影响显著。本试验通过对酵母菌和乳酸菌在啤特果汁中不同接种顺序的对比，优选出先接入酵母菌后接入乳酸菌的发酵方式降糖效果好。菌种的接种量、发酵温度、发酵时间等工艺参数是影响最终发酵效果的主要因素，当各参数过低或过高时，都会致使发酵过程受到影响而导致发酵结果不理想。本研究利用单因素及响应面优化设计对啤特果汁发酵工艺条件进行了优化，在此优化后的条件下，发酵效果良好，产品含糖量低且风味营养俱佳。

4 结论

菌种及发酵条件是影响发酵结果的关键，本研究所选用的种酵母菌对降低啤特果发酵汁可溶性固形物含量的能力依次为：安琪酵母菌>科汉森酵母菌>蜂蜜结合酵母菌；所选的2种乳酸菌中，干酪乳杆菌在降低啤特果发酵汁可溶性固形物含量方面优于酸奶乳酸菌。在先接种酵母菌后接种乳酸菌的接种顺序及最优发酵工艺条件下，啤特果发酵汁总糖含量由原来的（5.443±0.008）g/100 mL降至（0.986±0.008）g/100 mL，降糖效果显著。

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基金资助

中央引导地方科技发展专项项目“藜麦精深产品研发及推广应用”(ZCYD-2020-6-1)

陇原青年创新创业人才个人项目“发酵型啤特果果酒工艺研发与营养价值评价”