小尾寒羊不同乳腺发育时期7种激素分泌规律

Secretion rule of seven hormones of Small-Tailed Han sheep during different mammary gland development periods

摘要

目的 激素调控了奶牛和奶山羊的乳腺生长发育和泌乳，但目前在绵羊中的研究还不够全面和系统。 方法 以小尾寒羊为研究对象，在空怀期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期、泌乳早期和泌乳中后期6个乳腺发育时期，采用酶联免疫吸附法测定血液中雌激素、孕酮、催乳素、生长激素、糖皮质激素，胰岛素和胰岛素样生长因子I的浓度，分析激素对绵羊乳腺发育的调控作用。 结果 雌激素和孕酮浓度呈先上升后下降的总体趋势，它们在妊娠末期的浓度最高（分别为73.01 pg/mL和530.48 pmol/L），在空怀期的浓度最低（分别为35.69 pg/mL和485.46 pmol/L）；从空怀期开始，催乳素浓度持续升高，在泌乳早期达到最大值，其在泌乳早期的浓度分别比妊娠中期、泌乳中后期、妊娠早期和空怀期高12.47%、16.17%、46.15%和59.66%（P<0.05）；妊娠末期的糖皮质激素浓度最大（495.28 pg/mL），较妊娠早期和空怀期分别高14.36%和12.42%（P<0.05）；胰岛素含量由大到小依次为妊娠早期（36.22 mIU/L）>妊娠末期（36.10 mIU/L）>泌乳早期（35.98 mIU/L）>妊娠中期（35.49 mIU/L）>空怀期（33.78 mIU/L）>泌乳中后期（32.22 mIU/L），空怀期、泌乳中后期与其它时期的胰岛素含量差异显著（P<0.05）。然而，生长激素和胰岛素样生长因子I的浓度在6个时期之间无显著差异（P>0.05）。 结论 在绵羊6个乳腺发育时期，雌激素、孕酮、催乳素、糖皮质激素和胰岛素这5种激素的浓度有显著差异（P<0.05），说明它们可能影响了绵羊乳腺的生长发育和泌乳功能。

Abstract

Objective Hormones regulate the growth and development of the mammary gland and lactation in dairy cows and goats. However， there have been no comprehensive and systematic studies of hormone secretion in sheep. Method Six mammary gland periods of Small-Tailed Han sheep were selected to determine the levels of progesterone， estrogen， prolactin， growth hormone， glucocorticoid， insulin， and insulin-like growth factor I in blood using an enzyme linked immunosorbent assay， including non-pregnancy， early pregnancy， mid-pregnancy， late pregnancy， early lactation and mid-late lactation periods. Result The concentrations of estrogen and progesterone showed a general trend of increasing first and then decreasing.The concentrations of estrogen and progesterone were the highest at late pregnancy with a concentration of 73.01 pg/mL and 530.48 pmol/L， respectively， while their concentrations were the lowest in non-pregnancy with a concentration of 35.69 pg/mL and 485.46 pmol/L，respectively.The concentration of prolactin increased continuously from non-pregnancy with the highest value at early lactation periods， and its content in early lactation was 12.47%， 16.17%，46.15% and 59.66% higher than that in mid-pregnancy， mid-late lactation， early pregnancy and non-pregnancy， respectively （P<0.05）. The glucocorticoid level was the highest in late pregnancy （495.28 pg/mL）， and its level in the late pregnancy was 14.36% and 12.42% higher than that in early pregnancy and non-pregnancy， respectively （P<0.05）.The insulin level was the highest in early pregnancy （36.22 mIU/L）， followed by late pregnancy （36.10 mIU/L），early lactation （35.98 mIU/L），mid-pregnancy （35.49 mIU/L），non-pregnancy （33.78 mIU/L），and mid-late lactation （32.22 mIU/L）.Insulin levels were significantly different between the non-pregnancy， mid-late lactation and other periods （P<0.05）. However， there were no significant differences in the level of growth hormone and insulin-like growth factor I between the six periods （P>0.05）. Conclusion The concentrations of estrogen， progesterone， prolactin， glucocorticoid and insulin were significantly different at six different stages of mammary gland development in Small-Tailed Han sheep（P<0.05）， suggesting that they may affect mammary gland growth and development and lactation in sheep.

关键词

小尾寒羊 / 乳腺发育 / 激素 / 酶联免疫吸附法

Key words

Small-Tailed Han sheep / mammary gland development / hormones / enzyme linked immunosorbent assay

母羊泌乳量显著影响了羔羊的成活率和生长速度，是制约养羊业经济效益的一个关键因素。乳腺是母畜生成和分泌乳汁的唯一场所，它的发育受到内分泌系统、转录因子、生长因子、受体、细胞内外信号分子等多种因素的影响。在这些因素中，激素发挥了重要调控作用^［1］。研究表明，激素对乳腺发育的调控作用具有物种差异性，即在不同物种中，它们对乳腺发育的调控作用有所差异。例如，雌激素诱导了小鼠乳腺间质和导管上皮的增殖，但它对奶牛乳腺间质细胞的增殖无显著影响^［2］。催乳素是小鼠合成乳汁所必需的激素，但在牛和山羊上研究发现，用溴隐亭阻断催乳素分泌后并不影响乳汁的分泌^［3］。这表明，在不同的物种中，应专门研究激素在乳腺发育中的个性化作用。

在家畜上，人们主要研究了奶牛和奶山羊血液中一些重要激素含量的变化情况。例如，在奶牛上，雌二醇含量在分娩时达到峰值，而泌乳期和干奶期含量则较低^［4］。前人也检测了妊娠期和泌乳期奶山羊血液中雌激素和催乳素的浓度^［3］。目前，人们也研究了一些绵羊品种在部分乳腺发育时期的激素含量变化。李爱华等^［5］研究了滩羊空怀期、妊娠前期、妊娠后期和泌乳期血液中雌二醇、孕酮和催乳素的分泌规律，发现这些激素在4个乳腺发育时期呈现出差异化分泌。Bassett等^［6］在美利奴羊上发现，孕酮在妊娠期持续上升，妊娠后期达到最高值。有学者也研究了小尾寒羊产后催乳素^［7］、孕酮、雌激素和催乳素的浓度变化情况^［8］，结果发现产后催乳素浓度呈显著下降趋势，雌激素和孕酮浓度在产后45天达到最高峰。但是，目前尚未全面研究在绵羊乳腺发育的整个过程中，雌激素、催乳素、孕酮、生长激素、糖皮质激素、胰岛素、胰岛素样生长因子I这些调控乳腺发育重要激素的变化规律。因此，本研究以成年小尾寒羊为研究对象，采集空怀期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期、泌乳早期以及泌乳中后期这6个乳腺发育关键时期的血液，用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），测定血液中上述7种激素的浓度，探讨主要激素在不同乳腺发育阶段的分泌规律和调控机理，进而为调控乳腺发育提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

在甘肃省白银市会宁县郭城驿镇康园肉羊养殖场相同的饲养管理条件下，选择3岁、健康、膘情中等、体重接近的8只小尾寒羊母羊，用DW-370台式兽用B超仪（大为，江苏）检测试验羊只的发情、妊娠和分娩状态，之后根据羔羊出生时间校正母羊乳腺发育时期。在试验羊只的空怀期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期、泌乳早期和泌乳中后期，每只羊颈静脉采血3 mL，之后迅速在3 000 r/min下离心15 min分离出血清，暂存于液氮中，带回实验室于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 7种激素含量的测定

从泉州睿信生物科技有限公司购买雌激素和孕酮ELISA试剂盒，从上海泛柯实业有限公司购买催乳素、生长激素、糖皮质激素、胰岛素和胰岛素样生长因子I ELISA试剂盒。根据试剂盒操作说明，将标准样品稀释为5个浓度梯度（分别定义为标准品1、标准品2、标准品3、标准品4和标准品5，表1），用3020型多功能微孔板读数仪（赛默飞，芬兰）测定每个标准品的D值。

1.3 标准曲线和回归方程的建立

根据葛闻博等的方法^［9］，以标准样品浓度为横坐标，测定的相应D值为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程Y=ax²+bx+c，其中Y代表标准样品浓度，a、b、c为常数，x代表D值。计算回归方程的拟合度R²（0<R²<1），该值越接近于1，说明回归方程的拟合度越好）来判断方程的准确性。

对于在每个乳腺发育时期采集的8个试验样本，每个样本设置2个技术重复，共16个重复，用ELISA法测定它们的D值。具体方法是设置空白孔、标准孔以及待测样品孔，加入相应样品，在37 ℃下反应30 min弃液体，洗板5次；加入酶标试剂（HRP标记抗原和抗体混合物），在37 ℃下反应30 min，洗板5次；加入显色液A和B，在37 ℃下反应10 min，加入终止液。最后在450 nm下，用3020型多功能微孔板读数仪测定样品D值。根据建立的回归方程和样本的D值，计算待测激素的浓度。

1.4 数据分析

用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，分析结果用\overline{x}±s表示。

2 结果与分析

2.1 7种激素标准品的D值和标准曲线

对应于5个标准品，7种激素的D值见表2。

根据5个标准品的浓度和D值，建立了7种激素的如下回归方程：

催乳素：

Y=44.196x²-165.8x+172.5（R²=0.99）

糖皮质激素：

Y=75x²-165x+120（R²=0.99）

胰岛素：Y=5x²-11x+8（R²=0.99）

胰岛素样生长因子I：Y=25x²-55x+40（R²=0.99）

2.2 7种激素浓度的测定结果

各激素浓度测定结果见表3。

2.2.1 雌激素

从空怀期到泌乳中后期，雌激素含量呈现出先升后降的总体趋势。该激素浓度在空怀期最低（35.70 pg/mL），之后急剧上升，在妊娠末期达最高峰（73.01 pg/mL），之后又逐渐下降。妊娠末期雌激素的浓度较泌乳早期、泌乳中后期和空怀期分别高22.53%、27.37%和104.50%（P<0.05）。

2.2.2 孕酮

孕酮浓度也呈现出先升后降的总体趋势。它在空怀期的浓度是485.46 pmol/L，进入妊娠期后逐步上升，在妊娠末期达最高峰（530.48 pmol/L），之后缓慢下降。妊娠末期孕酮浓度较妊娠中期、妊娠早期和空怀期分别高3.52%、10.70%和9.27%（P<0.05）。

2.2.3 生长激素

生长激素的浓度范围为2.36~2.62 μg/L。在乳腺发育的6个时期之间，它的浓度无显著差异（P>0.05）。

2.2.4 催乳素

从空怀期开始，催乳素浓度持续升高，在泌乳早期达到最大值，其在泌乳早期的浓度分别比妊娠中期、泌乳中后期、妊娠早期和空怀期高12.47%、16.17%、46.15%和59.66%（P<0.05）。

2.2.5 糖皮质激素

糖皮质激素浓度由大到小依次为：妊娠末期（495.28 pg/mL）>泌乳早期（488.75 pg/mL）>泌乳中后期（482.75 pg/mL）>妊娠中期（465.02 pg/mL）>空怀期（440.53 pg/mL）>妊娠早期（433.07 pg/mL）。妊娠末期的糖皮质激素浓度较妊娠早期和空怀期分别高14.36%和12.42%（P<0.05），空怀期、妊娠早期、妊娠中期、泌乳早期和泌乳中后期间的糖皮质激素浓度无显著差异（P>0.05）。

2.2.6 胰岛素

胰岛素浓度由大到小依次为：妊娠早期（36.22 mIU/L）>妊娠末期（36.10 mIU/L）>泌乳早期（35.98 mIU/L）>妊娠中期（35.49 mIU/L）>空怀期（33.78 mIU/L）>泌乳中后期（32.22 mIU/L）。空怀期、泌乳中后期与其它时期的胰岛素浓度差异显著（P<0.05），妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期和泌乳早期之间的胰岛素浓度无显著差异（P>0.05）。

2.2.7 胰岛素样生长因子I

胰岛素样生长因子I的浓度范围为147.91~162.46 μg/L。在乳腺发育的6个时期之间，它的浓度无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

雌激素是雌性动物性器官发育和维持正常性机能的主要激素。在本研究中，空怀期时的雌激素浓度最低，妊娠末期达到最高值，分娩后逐步下降，这与前人在鲁西黄牛^［10］和建昌黑山羊^［11］中的研究结果一致，说明雌激素对反刍动物乳腺发育有相似的调控作用。但是江青东等^［12］在大鼠中发现，空怀期时雌二醇浓度最高，妊娠后急剧下降，泌乳期又逐渐升高，说明反刍动物与啮齿动物的雌激素分泌规律有较大差异。在绵羊乳腺不同发育时期，差异化的雌激素含量与其发挥的生理作用有关。在空怀期，雌激素能够诱导乳腺退化，为乳腺上皮细胞的分化和增殖做好准备^［13-14］。妊娠期增加的雌激素浓度能进一步促进绵羊乳腺的腺泡发育^［15］。妊娠末期绵羊的雌激素浓度达到最大值，这是因为：（1）除了胎盘以外，妊娠期的乳腺组织自身也能够分泌17-β雌二醇^［13］；（2）妊娠末期是乳腺上皮细胞增殖速度最快的时期^［16］，而乳腺上皮细胞的增殖需要雌激素的刺激，因此该时期的雌激素浓度较高。另外，Erb等^［17］发现奶牛分娩前的17-β雌二醇浓度与产后60天的产奶量呈正相关。因此为了维持较高的泌乳量，绵羊在妊娠末期可能需要较高的雌激素浓度。

孕酮是一种黄体激素，也是维持妊娠的重要激素。本试验发现，妊娠末期小尾寒羊血清中的孕酮含量最高，之后逐渐降低。人们在大鼠^［12］和奶山羊^［3］上均发现，妊娠末期的孕酮浓度最大，这与本研究结果相一致。研究发现，孕酮在乳腺分化、增殖和退化过程中均发挥作用，因此在6个时期的血清中均检测到孕酮。孕酮是乳腺小叶和腺泡发育必需的一种激素，它能诱导妊娠期腺泡和腺泡腔的形成^［3］，因此，在妊娠中后期的绵羊中有较高的孕酮浓度。妊娠末期逐渐增大的孕酮含量加速了乳腺上皮细胞的增殖，进一步增大了腺泡腔，最终导致乳腺完全发育。由于孕酮对α-乳清蛋白和乳形成有一定的抑制作用^［18］，因此为了促进乳汁分泌，分娩后孕酮含量逐渐降低。

催乳素是垂体前叶合成和分泌的一种多肽类激素。在本研究中，泌乳早期小尾寒羊血清中的催乳素浓度最大，这与王康^［6］在绵羊上的研究结果一致，也与前人在鲁西黄牛^［10］、滩羊^［5］、奶山羊^［3］和大鼠^［12］上的结果相一致。研究表明，催乳素对乳腺生长发育和退化具有多重作用^［19］，它还具有间接维持妊娠的作用^［20］，因此它在绵羊空怀期、妊娠期和泌乳期均分泌。妊娠期分泌的催乳素促进了乳腺小叶腺泡发育以及小叶上皮细胞的增殖^［3］。催乳素的另一作用是刺激并维持泌乳，它与乳汁和乳蛋白合成也密切相关^［21］。因此它在绵羊妊娠末期和泌乳初期有较高的含量。但是妊娠末期较高的雌激素和孕酮含量抑制了催乳素的泌乳作用，分娩后随着这两种激素特别是雌激素含量的下降，解除了对催乳素的抑制作用，导致泌乳发生。此外，泌乳早期较高的催乳素含量可能与羔羊频繁的吮乳有关^［3］。泌乳高峰过后，随着泌乳量的降低，催乳素的含量也随之降低。

本研究中，小尾寒羊血清中的糖皮质激素浓度在妊娠中期开始急剧上升，并在妊娠末期达到最高值。人们在奶牛^［4］和美利奴羊^［22］上均发现，分娩前糖皮质激素显著增加，分娩后下降。Ota等^［23］在大鼠上也发现，随着泌乳的进行，糖皮质激素浓度逐渐减小，这些研究均与本研究结果一致。研究表明，糖皮质激素对乳腺发育和泌乳具有多重调控作用^［24］，因此它在乳腺发育的各个阶段均分泌。在妊娠期，给奶牛注射糖皮质激素后发现，奶牛开始分泌大量乳汁^［4］，说明糖皮质激素具有催乳作用，因此妊娠末期较高的糖皮质激素是为了给泌乳做好准备。糖皮质激素也是启动分娩和泌乳的重要激素^［25］，这些因素造成它在妊娠末期的含量最高。另外，糖皮质激素还与粗面内质网和高尔基体发育密切相关^［26］，说明它参与了乳蛋白合成，本研究中该激素在泌乳期具有较高的浓度也证实了这一点。

胰岛素是胰岛β细胞合成和分泌的一种可溶性蛋白激素，它通过调节全身能量分布来满足家畜乳腺发育的能量需求^［3］。本研究中，妊娠早期小尾寒羊血清中的胰岛素浓度最高，泌乳中后期浓度最低。但是，李真^［3］在奶山羊上研究发现，该激素浓度在妊娠早期最高，分娩时最低，这与本研究结果有一定差异，这种差异可能与物种有关，但还需要进一步研究。妊娠早期，母羊肠道吸收脂肪能力较强，导致血脂增高，脂肪积存较多，随之出现胰岛素分泌高峰^［3］。随着妊娠的持续，母羊基础代谢率会逐渐升高，有些可能还会出现摄食障碍，此时需要动用大量体脂来满足机体需求，因此胰岛素分泌量也随之缓慢减少^［3］。另外，胰岛素还可以刺激乳腺上皮细胞增殖^［27］，它也是诱导乳蛋白分泌所必需的激素，能促进乳蛋白的合成^［28］，因此这也是胰岛素在妊娠期和泌乳早期保持较高浓度的另一重要原因。

本研究中，在6个乳腺发育时期之间，血清中的生长激素和胰岛素样生长因子I浓度无显著差异（P>0.05），这与前人研究结果一致，李真^［3］发现奶山羊生长激素浓度在乳腺发育过程中变化不显著，Handwerger等^［29］发现陶塞特羊中的胰岛素样生长因子I浓度在妊娠期几乎没有变化。妊娠末期的生长激素浓度最大，这是因为乳腺合成乳汁需要大量的乳脂和乳糖，而生长激素有调节糖和脂肪代谢的功能^［3］。胰岛素样生长因子I属于类胰岛素生长因子的一种，它是乳腺导管生长和终末乳芽增殖所必须的介质，能促进乳腺上皮细胞生长、分化和存活^［30］，它在乳腺退化的重塑过程中也发挥了重要作用^［31］，因此在小尾寒羊6个乳腺发育时期的血清中均检测到胰岛素样生长因子I。

4 结论

在绵羊6个乳腺发育时期，雌激素、孕酮、催乳素、糖皮质激素和胰岛素这5种激素的浓度有显著差异（P<0.05），但生长激素和胰岛素样生长因子I的浓度无差异（P>0.05），这种浓度差异影响了绵羊乳腺在不同发育时期的结构和功能。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060746)

国家自然科学基金项目(31860635)

甘肃农业大学“伏羲青年英才培育计划项目(Gaufx-02Y02)

甘肃省基础研究创新群体项目(18JR3RA190)

甘肃农业大学自列课题(GSAU-ZL-2015-033)