40种中草药及其联合应用对凡纳滨对虾源副溶血弧菌的体外抑菌作用

The bacteriostatic effect of 40 kinds of Chinese herbal medicines and their combinations on Vibrio parahaemolyticus from Litopenaeus vannameiin vitro

摘要

目的 探究40种单方中草药及其复方中草药水提取液对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）源副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的体外抑菌效果。 方法 采用牛津杯打孔法测定40种单方中草药对副溶血弧菌的体外抑菌作用，然后用微量肉汤稀释法测定具有抑菌效果的中草药对副溶血弧菌的最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌质量浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），并选取具有较强抑菌活性的中草药进行复方作用评价。 结果 34种中草药对副溶血弧菌有抑制作用，其中黄连（Rhizoma coptidis）、乌梅（Fructus mume）、苏木（Caesalpinia sappan）、五倍子（Rhus chinensis）、地榆（Sanguisorba officinalis）、黄柏（Cortex phellodendri）6种中草药对副溶血弧菌的抑菌作用较强，抑菌圈直径为21.00~26.00 mm，最小抑菌质量浓度为3.91~31.25 mg/mL，最小杀菌质量浓度为7.81~62.50 mg/mL。黄连+乌梅、黄连+苏木、乌梅+五倍子、黄连+黄柏和黄柏+五倍子联合对副溶血弧菌抑菌效果较好，其中以黄连+苏木组合对副溶血弧菌抑菌效果最佳，抑菌圈直径达28.74 mm，最小抑菌质量浓度与最小杀菌质量浓度分别为1.95 mg/mL、3.91 mg/mL，联合抑菌指数为0.50，表现为协同作用。 结论 34种中草药对凡纳滨对虾源副溶血弧菌具有抑菌作用，以黄连+苏木联合对凡纳滨对虾源副溶血弧菌的体外抑菌和杀菌作用最强。

Abstract

Objective To study the antibacterial effect of water extracts of 40 kinds of single Chinese herbal medicines and their compounds against Vibrio parahaemolyticus from Litopenaeus vannameiin vitro. Method The antibacterial effect of 40 kinds of single Chinese herbal medicines was determined by the Oxford cup method，and then the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) of Chinese herbal medicines with good antibacterial effect on V.parahaemolyticus were determined by the Broth microdilution method.The Chinese herbal medicines with better inhibitory activities against V.parahaemolyticus were selected to evaluate the antibacterial effect of their compounds. Result 34 kinds of Chinese herbal medicines had inhibitory effects on V.parahaemolyticus，among which Rhizoma coptidis，Fructus mume，Caesalpinia sappan，Rhus chinensis，Sanguisorba officinalis and Cortex phellodendri had relatively strong inhibitory effects on V.parahaemolyticus，with inhibitory circle diameter ranging from 21.00 to 26.00 mm，MICs from 3.91 to 31.25 mg/mL and MBCs from 7.81 to 62.50 mg/mL.The combinations of R.coptidis+F.mume，R.coptidis+C.sappan，F.mume+R.chinensis，R.coptidis+C.phellodendri and C.phellodendri+R.chinensis had better antibacterial effect against V.parahaemolyticu，among which the combination of R.coptidis+C.sappan had the best antibacterial effect.The inhibitory circle diameter was 28.74 mm，MIC was 1.95 mg/mL，and MBC was 3.91 mg/mL against V.parahaemolyticus，and the fraction inhibitory concentration index was 0.50，showing a synergistic effect. Conclusion The 34 kinds of Chinese herbal medicines had inhibitory effects on V.parahaemolyticus from L.vannamei，and the combination of R.coptidis + C.sappan showed the strongest bacteriostatic/bactericidal effect against V.parahaemolyticus from L.vannamei in vitro.

关键词

中草药 / 凡纳滨对虾 / 副溶血弧菌 / 体外抑菌效果

Key words

Chinese herbal medicine / Litopenaeus vannamei / Vibrio parahaemolyticus / bacteriostatic effect

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）隶属于弧菌科（Vibrionaceae），弧菌属（Vibrio），广泛分布于海洋、河口以及水产养殖环境中，是水生动物主要条件致病菌之一^［1］，能够感染包括大黄鱼（Pseudosciaena crocea）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）、杂色鲍（Haliotis diversicolor）等^［2-5］ 多种水产养殖动物，给水产养殖业带来较大危害。目前，使用抗生素仍是防治水产养殖动物细菌性感染的有效方式，然而抗生素的长期使用可造成病原菌耐药性增强、治疗效果变差以及药物残留对水产品质量安全潜在危害已成世界共识^［6-7］。

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又名南美白对虾，因其味道鲜美、营养丰富、生长快等特点，已成为我国重要的水产养殖品种^［8］。据中国渔业年鉴统计，2021年我国凡纳滨对虾养殖总产量达197.7万t，占对虾养殖总量的86.88 %，主要产自广东、广西、山东等地^［9］。近年来，凡纳滨对虾养殖场频频发生由致病性副溶血弧菌引起的对虾急性肝胰腺坏死病，造成凡纳滨对虾大规模的急性死亡，严重制约了对虾养殖产业的健康发展^［10-12］，因此，凡纳滨对虾源副溶血弧菌的控制应予重点关注。

中草药富含生物碱、有机酸、苷类等多种活性物质，具有抗菌、抗病毒等作用，研究证实其对水产动物细菌性、真菌性等疾病具有良好的防治效果，且不易产生耐药性、无残留、价格低廉，还具有促进水生动物生长、提高免疫力等优点^［13-15］。目前，有关学者已开展了中草药对鱼源副溶血弧菌的抑菌作用相关研究，发现了对大菱鲆（Scophthalmus maximus）、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）、草鱼（Ctenopharyngodon idella）源副溶血弧菌具有良好抑菌作用的石榴皮（Punica granatum）、黄连（Rhizoma coptidis）、乌梅（Fructus mume）、白头翁（Pulsatilla chinensis）、黄芩（Scutellaria baicalensis）、五倍子（Rhus chinensis）等中草药^［16-18］，但从现有文献来看，有关中草药及其联合用药对凡纳滨对虾源副溶血弧菌的抑菌效果研究却鲜有报道。鉴此，本研究通过牛津杯打孔法分析了40种常见中草药对凡纳滨对虾源副溶血弧菌的体外抑菌效果，用微量肉汤稀释法测定具有抑菌作用的中草药对副溶血弧菌的最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌质量浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），并选择抑菌效果较好的中草药联合应用，进一步评价复方中草药的体外抑菌效果，以期为后续筛选抗凡纳滨对虾源副溶血弧菌中草药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

副溶血弧菌FHBX-1，为本实验室于上海市某凡纳滨对虾养殖场分离、鉴定并保存^［10］。40种常见中草药（表1），购自上海益丰大药房；LB营养肉汤（LB Broth Lennox）、LB营养琼脂（LB Nutrient Agar）、Muller-Hinton肉汤（Muller-Hinton Broth，MHB）、Muller-Hinton琼脂（Muller-Hinton Agar，MHA）购自北京陆桥技术股份责任公司。96孔板、牛津杯及其他试剂耗材购自上海生工有限公司；0.85%氯化钠溶液，由本实验室自制。

1.2 中草药提取液的制备

参照马秀慧等^［19］的方法制备中草药提取液。将各供试中草药置于60 ℃干燥箱中烘至恒质量，各取30 g，加300 mL自来水，浸泡1 h以后煎煮，大火煮沸后转小火煮 30 min，过滤第1道药液；药渣加300 mL自来水，小火煎煮60 min，过滤第2道药液；药渣加300 mL自来水，大火煎煮30 min，过滤第3道药液，将3次药液合并后浓缩至30 mL，使中草药提取液终质量浓度为1 g/mL，121 ℃高压灭菌15min后取出，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 副溶血弧菌菌悬液的制备

参照高晓华等^［10］方法进行副溶血弧菌菌悬液的制备。即无菌条件下将 -80 ℃保存的副溶血弧菌FHBX-1划线接种至LB营养琼脂平板上，30 ℃培养18 h。挑取单个菌落接种于LB营养肉汤中，置30 ℃摇床（200 r/min）培养20 h后，高速离心收集菌体，并用0.85%氯化钠溶液重悬，采用麦氏比浊法测定其浓度，并将菌液浓度稀释至1.0×10⁷ CFU/mL，置于4 ℃冰箱备用。

1.4 中草药抑菌圈测定

参照张恒桥等^［20］的方法，即采用牛津杯法打孔法测定40种中草药提取液对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈大小，在无菌培养皿中先倒入约10 mL灭菌MHA培养基，待凝固后均匀放置4个灭菌牛津杯，再倒入约10~15 mL MHA培养基，待凝固后，每个平板上加入100 µL 备用菌悬液，用一次性无菌棉棒涂抹均匀，待菌液完全吸收后，用镊子取出牛津杯。每个平板上其中3孔加入80 µL中草药提取液，1孔加入灭菌水为阴性对照，每种药液均设置3个重复，30 ℃正置培养24 h观察结果，并用游标卡尺测量抑菌圈的直径（d）。抑菌圈直径判断标准 ^［21］，d≥20 mm为极度敏感（++++），20 mm>d≥15 mm为高度敏感（+++），15 mm>d≥10 mm为中度敏感（++），d<10 mm为低度敏感（+），无抑菌圈为不敏感（－）。

1.5 中草药最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度的测定

参照陶莎等^［22］的方法，即采用96孔板微量肉汤稀释法分别测定具有抑菌作用的中草药对副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌质量浓度（MIC）。无菌条件下，取一次性无菌96孔酶标板（A~H行×12列），每孔加入100 µL灭菌MH肉汤，A~D行的第1列加入待测中草药提取液100 µL，充分混匀后，逐级稀释至第11列，并从第11列孔中取出100 µL弃去，每孔液体终体积均为100 µL。1~11列提取液质量终浓度分别为500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 mg/mL；A~C行的1~11列每孔加入10 µL稀释的菌悬液为试验组，第12孔不加入菌液，为阴性对照，D行的1~11 列不加入菌液，作空白对照组观察是否生长细菌，第12孔加入10 µL菌液，作为阳性对照，一板一药，30 ℃正置培养24 h观察结果，试验组与空白对照组透明度相似的质量浓度即为最小抑菌质量浓度，对于颜色较深不易判断的孔需进行平板涂布培养，根据平板上菌落生长情况来确定孔内菌体生长情况。

最小杀菌质量浓度（MBC）测定，即选择每组所有高于最小抑菌质量浓度的试验孔，分别取100 µL液体均匀涂布于LB营养琼脂培养基上，30 ℃倒置培养24 h后观察结果，少于5个单菌落试验组的质量浓度即为待测中草药提取液的最小杀菌质量浓度。

1.6 中草药联合对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌效果

根据40种中草药对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌结果，筛选出6种综合抑菌作用较强的中草药，按照夏与晴等^［18］的方法，将筛选的6种中草药原液两两组合按照体积1：1的比例进行配比，组合成15组复方中草药，并参照1.4、1.5节的方法测定不同中草药两两联合对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直径、最小抑菌质量浓度（MIC）和最小杀菌质量浓度（MBC）。复方中草药联合抑菌指数^［23］（fraction inhibitory concentration index，FICI）=甲药联合时MIC/甲药单独时MIC+乙药联合时MIC/乙药单独时MIC。判定标准：FICI≤0.5为协同作用；0.5<FICI≤1.0为相加作用；1.0<FICI≤2.0为无关作用；FICI>2.0为拮抗作用。

1.7 数据处理与分析

所有试验数据采用SPSS 19.0软件进行处理分析，以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 40种中草药对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌效果

由表2可知，副溶血弧菌FHBX-1对34种单方中草药表现为敏感，其对黄连、乌梅、黄柏、苏木、五倍子、地榆、熟地黄等9种单方中草药为极度敏感，抑菌圈直径均大于20.00 mm，其中对黄连最敏感，抑菌直径达25.41 mm；对石榴皮、香薷、黄芩等4种中草药高度敏感，抑菌圈直径为15.00~20.00 mm；对大黄、女贞子、茵陈等18种中草药中度敏感，抑菌圈直径为10.00~15.00 mm；对香附、石菖蒲、杜仲3种中草药低度敏感，抑菌圈直径均小于10.00 mm；对合欢皮、广藿香、黄芪等6种中草药不敏感。

2.2 34种中草药对副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

由表3可知，黄连、苏木、乌梅、五倍子、地榆、黄柏等10种单方中草药对副溶血弧菌FHBX-1的MIC为3.91~31.25 mg/mL，MBC为7.81~62.50 mg/mL；石榴皮、虎杖、牡丹皮等19种单方中草药的MIC为62.50~125 mg/mL，MBC为125~250 mg/mL；石菖蒲、金樱子、杜仲等5种单方中草药的MIC均为250 mg/mL，MBC均为500 mg/mL。

综合单方中草药抑菌圈直径、MIC、MBC试验结果可知，黄连、乌梅、苏木、五倍子、地榆、黄柏6种单方中草药对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑制效果较好，可作为复方中草药配伍的备选药物。

2.3 中草药联合对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌效果

以黄连、乌梅、苏木、五倍子、地榆、黄柏抑菌效果较好的6种中草药，组成15组复方进行试验。由表4可知，15组复方中草药对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直径均大于15.00 mm，其中副溶血弧菌FHBX-1对黄连+苏木、乌梅+黄连、黄柏+黄连等10组为极度敏感，抑菌圈直径均大于20.00 mm；对黄连+地榆、苏木+黄柏、地榆+苏木等5组为高度敏感，抑菌圈直径为15.40~19.38 mm。

2.4 中草药联合对副溶血弧菌FHBX-1的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

由表5可知：15组复方中草药对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌作用各不相同，其中黄连+苏木组对副溶血弧菌的MIC为1.95 mg/mL，MBC为3.91 mg/mL，联合抑菌指数（FICI）为0.50，表现为协同作用；黄连+乌梅、黄柏+五倍子、黄连+黄柏组的MIC均为3.91 mg/mL，MBC均为7.81 mg/mL，FICI为0.63~1.00，表现为相加作用；乌梅+黄柏、乌梅+五倍子、苏木+五倍子组的MIC为3.91~7.81 mg/mL，MBC为7.81~15.63 mg/mL，FICI为1.06~2.00，表现为无关作用；黄连+地榆、乌梅+地榆、苏木+黄柏等8组的MIC为7.81~62.50 mg/mL，MBC为15.63~125.00 mg/mL，FICI为2.06~4.00，表现为拮抗作用。

综合中草药联合应用的抑菌圈直径、MIC、MBC试验结果可知，黄连+苏木组对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌效果最好，抑菌圈直径高达28.74 mm，MIC与MBC分别为1.95、3.91 mg/mL，显著优于单一抑菌活性最高的黄连（抑菌圈直径为25.41 mm，MIC为3.91 mg/mL、MBC为7.81 mg/mL）。

3 讨论

水产动物病害绿色防控是水产养殖业可持续健康发展的必然趋势^［24］。中草药作为天然草本植物，富含生物碱、有机酸、黄酮类、苷类、多糖等多种抑菌活性成分，能够通过破坏细菌细胞膜的完整性和通透性、影响细菌核酸和蛋白质合成等机制发挥抗菌作用，具有低毒、高效、不易产生耐药性，提高水产动物抗病力等优点^［25-26］。因此，利用中草药替代抗生素防治水产动物细菌性疾病具有广阔的应用前景。

近年来，有关学者开展了中草药对不同来源副溶血弧菌的体外抑菌效果相关研究。任海等^［16］报道，黄连对大菱鲆源副溶血弧菌的抑菌圈直径为25.00 mm，最小抑菌质量浓度（MIC）为1.56 mg/mL；夏与晴等^［18］研究显示，黄连对草鱼源副溶血弧菌具有良好的抑菌效果，抑菌圈直径达26.51 mm。本试验结果显示，黄连对凡纳滨对虾源副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌活性最强，抑菌圈直径达25.41 mm，最小抑菌质量浓度（MIC）为3.91 mg/mL，与上述研究结果相近。梁利国等^［27］研究发现，五倍子、苏木、石榴皮对副溶血弧菌的抑菌效果显著，最小抑菌质量浓度（MBC）均为3.12 mg/mL；张磊^［28］报道，黄柏、苦参等中草药对克氏原鳌虾（Procambarus clarkii）源副溶血弧菌有明显抑制作用；任海等^［16］研究显示，苏木、乌梅、地榆中草药对大菱鲆源副溶血弧菌具有较强抑菌活性，抑菌圈效果均为高度敏感，最小抑菌质量浓度（MIC）均为3.13 mg/mL。本试验分析了40种单方中草药对凡纳滨对虾源副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌效果，发现黄连、乌梅、苏木、五倍子、地榆、黄柏等中草药对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌作用较强，抑菌圈直径均达20.00 mm以上，最小抑菌质量浓度（MIC）为3.91~31.25 mg/mL，最小杀菌质量浓度（MBC）为7.81~62.50 mg/mL。本试验结果与上述学者的研究结果相似，这表明黄连、乌梅、苏木、五倍子、地榆、黄柏等中草药对副溶血弧菌的抑制作用具有一定的普遍性，其富含的抑菌成分（生物碱、鞣质、有机酸等）抑菌作用显著。另外，本试验结果显示，副溶血弧菌FHBX-1对板蓝根、黄芪、芦根等中草药不敏感，与王玉娥等^［17］研究发现的海洋致病性副溶血弧菌对板蓝根敏感的结论不一致，这可能与菌株来源、中草药产地以及中草药提取工艺不同等因素相关^［29］。

Aggarwal等^［30］研究认为，抗菌药物的抑菌圈直径越大则最小抑菌质量浓度越小。本试验中地榆、苦参、大黄3种单方中草药的体外抑菌结果显示，地榆与苦参的抑菌圈直径均大于20.00 mm为极度敏感，但苦参的最小抑菌质量浓度（MIC）为125.00 mg/mL，而地榆的最小抑菌质量浓度（MIC）却为15.63 mg/mL，仅为苦参质量浓度的1/8；地榆与大黄的最小抑菌质量浓度（MIC）均为15.63 mg/mL，但大黄的抑菌圈直径为12.41 mm，仅为地榆抑菌圈直径的1/2，这种试验现象与Aggarwal等的观点不一致，可能与药液在不同介质中扩散能力与菌 - 药有效接触面积相关^［31］。本试验结果表明，仅依据抑菌圈直径大小来判断中草药的抑菌效果的强弱可能存在一定局限性，在筛选中草药时需参考抑菌圈直径、最小抑菌质量浓度（MIC）、最小杀菌质量浓度（MBC）等参数综合判断。本试验综合了抑菌圈直径、最小抑菌质量浓度（MIC）、最小杀菌质量浓度（MBC）试验结果，筛选出了黄连、乌梅、苏木、五倍子、地榆、黄柏6种具有较强综合抑菌活性的中草药，作为凡纳滨对虾源副溶血弧菌防治的复方配伍备选中草药。

杨培奎等^［32］认为，将两种或两种以上中草药进行合理配伍，利用不同药物间的协同作用，共同作用于水产致病菌具有显著提高中草药抑菌、杀菌的效果。王宝屯等^［24］发现，将乌梅和丁香进行配伍制成复方中草药，该复方中草药对花鲈源维氏气单胞菌的抑菌圈直径为22.50 mm，较乌梅、丁香单用时的抑菌圈直径（21.44、17.11 mm）有明显扩大；夏与晴等^［18］将乌梅和白头翁进行配伍制成复方中草药，发现该复方中草药对草鱼源荧光假单胞菌的MIC降低至7.81 mg/mL，较乌梅、白头翁单用时的MIC（15.63、62.50 mg/mL）显著减小。这些研究表明，不同中草药之间进行科学的配伍能够产生显著的协同抗菌作用^［33］，本试验中发现15组复方中草药对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直径均大于15.00 mm，较单方中草药抑菌效果更为稳定，其中黄连+苏木组的抑菌活性最高，对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌圈直径达28.74 mm，MIC为1.95 mg/mL，显著优于黄连、苏木单用时的抑菌圈直径（25.41、23.00 mm）与MIC（3.91、7.81 mg/mL），究其原因，可能是因为黄连富含小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱等活性物质，通过破坏细菌的细胞膜和细胞壁的结构，抑制糖代谢达到抑菌的作用^［34］；苏木富含巴西苏木素抑菌活性成分，可通过抑制细菌生物膜的形成起到抑菌效果^［35］，两者配伍时药效相互补充起到增效抗菌的作用^［22］。另外，本试验也发现乌梅+苏木组对副溶血弧菌FHBX-1的抑菌作用显著弱于乌梅、苏木单用时的抑菌效果，与王宝屯等^［24］研究结论一致，可能与药性相杀或相畏的中草药进行配伍时产生拮抗作用，造成药效减弱有关。因此，中草药之间进行复方时需严格按照科学的配伍原则，让中草药配伍起到“协同”作用，以增强复方中草药制剂的体外抑菌效果，这也将是提升水产用抗菌中草药制剂应用一个重要突破口。

4 结论

40种单方中草药对副溶血弧菌FHBX-1的体外抑菌效果存在一定差异，其中以黄连、乌梅、苏木、五倍子、地榆、黄柏6种单方中草药综合抑菌作用较强。中草药联合应用以黄连+苏木对副溶血弧菌FHBX-1抑菌和杀菌效果最好，联合抑菌指数显示为协同作用。结果表明中草药黄连+苏木联合应用对凡纳滨对虾源副溶血弧菌具有较强的体外抑菌和杀菌作用，可为进一步开发高效、安全、环境友好型的水产用中草药制剂提供参考依据。

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基金资助

上海市现代农业产业技术体系项目(沪农科产字（2022）第5号)