NaN₃诱变草莓突变体的表型筛选与SRAP分子鉴定

Phenotypic screening and SRAP molecular identification of NaN₃-induced strawberry mutants

摘要

目的 探索NaN₃对红花草莓的诱变效果，筛选出红花草莓突变体。 方法 在对NaN₃诱变红花草莓植株形态学初筛的基础上，进一步采用SRAP分子标记技术进行分子鉴定，通过聚类分析鉴定了红花草莓与其突变单株的遗传背景和亲缘关系。 结果 从M₁代中筛选出23株具有不同表型变化的突变体，总突变率为4.6%，包括株型紧凑、株高变矮、茎纤细、小叶、叶片卷曲皱缩、花叶、白色花、三色花、花瓣短缩花、球型花、球形果、矩形果共12种突变性状；SRAP分子标记分析结果显示，8对SRAP引物扩增出的总条带数为72，多态性条带数为47，多态性比例为65%，23株表型突变株中有22个单株在DNA水平发生了基因突变；聚类分析表明，N-5、N-8和N-9与对照在遗传距离上相差最远，产生的变异最大，N-15与对照无差异。 结论 NaN₃ 诱变红花草莓育种是行之有效的，可产生草莓突变体，为红花草莓新品种选育以及相关研究提供参考依据。

Abstract

Objective To study the mutagenic effect of NaN₃ on safflower strawberry，to screen the mutants. Method Based on the morphological screening of NaN₃-induced safflower strawberry plants，SRAP molecular marker technology was further used for molecular identification.The genetic background and genetic relationship between safflower strawberry and its mutant plants were identified by cluster analysis. Result A total of 23 mutants with various phenotypic changes were screened from the M₁ generation，and the total mutation rate was 4.6%，including 12 mutant traits such as compact plant type，short plant height，slender stem，small leaves，curled and wrinkled leaves，mosaic leaves，white flowers，tricolor flowers，petal shortening flowers，spherical flowers，spherical fruits and rectangular fruits.The results of SRAP molecular marker analysis showed that the total number of bands amplified by 8 pairs of SRAP primers was 72，the number of polymorphic bands was 47，and the polymorphic ratio was 65%.Cluster analysis showed that the genetic distance of N-5，N-8 and N-9 was the farthest from the control，and the variation was the greatest. Conclusion NaN₃ mutagenesis of red-flowered strawberry breeding is effective and can produce strawberry mutants that provide a reference for the breeding of new red-flowered strawberry varieties and related research.

Graphical abstract

关键词

草莓 / NaN₃诱变 / 形态学鉴定 / SRAP分子标记

Key words

strawberry / NaN₃ mutagenesis / morphological characteristics / SRAP molecular marker

红花草莓开红花、结红果，具有三小叶，色彩鲜明^［1］，其植株可用于盆栽观赏和园林绿化^［2］。我国对红花草莓进行育种的时间不长、育成品种不多、果实品质欠佳、花色单一（主要为粉色）^［3-4］，红花草莓育种一直停留在传统的杂交育种阶段^［5-7］，这使得红花草莓的应用得到了限制。而化学诱变育种技术凭借其操作简易，特异性较强并且诱变后代遗传比较稳定的特点，已经在许多作物上得到了广泛运用^［8］。化学诱变剂叠氮化钠（NaN₃）可透过细胞膜进入细胞内，通过碱基替换方式使DNA的正常合成受到影响，引起点突变的产生^［9］。崔广荣等^［10］采用NaN₃对文心兰原球茎进行诱变处理，成功获得了突变体植株；王霞等^［11］采用NaN₃对凤尾鸡冠花叶片进行处理，成功筛选出耐盐突变体；何克勤等^［12］采用NaN₃对甜叶菊试管苗进行诱变处理，得到突变体植株。有关红花草莓的NaN₃离体化学诱变研究尚未见报道。

形态学标记因其具有简易、快速，不需要高昂仪器设备等特点^［13］，在育种鉴定中常见报道^［10-17］，但是形态学鉴定容易受到环境因素和人为因素的影响，只能作为初步鉴定。而分子标记技术不易受到环境等因素的影响，可以从遗传物质DNA水平来研究植物基因的变化，具有操作更简单，结果更精确的特点^［18］。SRAP分子标记是一种基于PCR的新型分子标记^［19］，其具有操作简单、易重复性和高共显性等优点。本研究采用NaN₃诱变红花草莓植株，在形态学初筛的基础上，进一步采用SRAP分子标记技术进行多态性检测，通过聚类分析鉴定了红花草莓与其23株突变单株的遗传背景和亲缘关系，以期筛出突变体，为红花草莓新品种培育提供参考和奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

由安徽科技学院分子育种实验室提供的纯系红花草莓品种。

1.2 试剂

SRAP 引物的合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；10×DNA buffer 、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、Marker等均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 诱变材料获取

2021年8月在预备试验基础上，用1 mmol/L NaN₃ 对草莓试管苗诱变处理1 d后移入增殖培养基中培养28 d，继代两次后转入生根培养基中，25 d后转入穴盘炼苗，30 d后移栽至安徽科技学院温室大棚中，共得到M₁代诱变单株 500 株。

1.3.2 表型性状调查

2022年春对500株诱变单株进行田间表型鉴定，观察记录株高、冠幅、茎粗、叶面积、叶型、叶色、花色、花型、果形。 突变体筛选标准采用Wei等^［20］的方法，入选标准为：入选株性状>对照平均值±3倍标准差。

1.3.3 SRAP分子鉴定

2022年4月采用CTAB法对发生表型突变的草莓植株幼嫩叶片进行DNA提取，参考胡能兵^［21］的方法。采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳对DNA进行质量检测。挑选主条带清楚并且干扰条带少的8对引物（表1）来检测表型性状突变体的多态性。采用胡能兵等^［22］的SRAP反应体系进行扩增。采用 Sanguinetti等^［23］的银染方法进行染色。

1.4 数据统计与分析

通过EXCEL 2007软件进行数据转换，分别计算红花草莓表型突变植株的株高、冠幅、茎粗、叶面积的均值（Ｘ） 和标准差（ＳＤ）。采用 NTsys 2.10软件进行统计和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 表型突变植株筛选

由表2可得，表型突变主要为株型、茎叶、花和果实4种突变类型，在整个生育期共发现23份表型突变株，突变率为4.6%，其中部分突变株存在多类型突变。

2.1.1 株型突变

由表2和图1可知，株型突变主要包括株型紧凑、株高变矮2种类型。共有4份，突变率为0.8%。其中，株型紧凑的有2株，突变率为0.4%。与对照冠幅（25~46.5 cm）相比，主要表现为冠幅变小（冠幅减少13.54~21.29 cm）。植株矮化的有2株，突变率为0.4%，与对照株高（20~35 cm）相比，主要表现为茎长度缩短（株高减少13.54~15.54 cm）。

2.1.2 茎叶突变

由表2和图2可知，茎叶突变主要包括茎纤细、小叶、叶片皱缩卷曲和花叶4种类型。共有8份，突变率为1.6%。其中，茎纤细的突变株有1株，突变率为0.2%，与对照茎粗（1.99~3.01 cm）相比，表现为茎变细（减少1.08 cm）。叶面积变小的有4株，突变率为0.8%。叶片皱缩卷曲的植株有2株，突变率为0.4%。花叶突变体1株，突变率为0.2%，表现为叶片颜色黄绿相间。

2.1.3 花突变

由表2和图3可得，花突变主要包括白色花、三色花、花瓣短缩花和球型花4种类型（图3），共有8份，突变率为1.6%。其中，白色花4份，突变率为0.8%。三色花1份，突变率为0.2%，表现为一朵花上同时出现深粉色、粉色、白色3种颜色的花瓣。花瓣短缩花2份，突变率为0.4%，表现为一朵花上的2个花瓣短缩，发育不良。球型花突变体1份，突变率为0.2%，表现为花型由平面展开型变为圆球型，并且花蕊由圆形变为长椭圆形。

2.1.4 果实突变

由表2和图4可知，果实突变为果形突变。共有3份，突变率为0.6%。其中，长圆锥形果1份，突变率为0.2%，表现为果实变细长，由圆锥形变为长圆锥形。球型果1份，突变率为0.2%，表现为果形变圆变小。矩形果1份，突变率为0.2%，表现为果实膨大，形状接近矩形。

2.2 SRAP分子鉴定

2.2.1 SRAP标记的扩增多态性分析

利用SRAP分子标记对23株草莓表型突变植株进行遗传多态性进行分析（图5）。8对SRAP引物扩增出的片段大小主要在100~1 000 bp，每1对引物扩增出的总条带数在4~15条不等。8对SRAP引物扩增出的总条带数为72，多态性条带数为47，多态性比例为65%，其中引物A18Z14扩增出的多态性条带是最多的，扩增出10条多态性条带（图5）。与CK相比，部分表型突变植株的条带出现了3种变化，具体表现为条带新增，条带缺失，条带既新增又缺失。

2.2.2 突变植株与对照的遗传差异性比较

由图6可以看出，与对照相比，除了突变植株N-15没有出现遗传上的变异以外（虽然株高矮化明显），其他22株突变植株都出现了遗传上的变异。其中与对照在遗传距离上相差最远的是N-5、N-8和N-9，产生的变异最大，它们分别通过8对引物扩增出12、13和15态性条带，说明通过NaN₃处理引起了这些突变植株较多基因位点上的突变，与对照植株相比，这3株突变植株在形态上表现为花型与花色的变异，其中N-5表现为花型由平面展开型变为圆球型，并且花蕊由圆形变为长椭圆形。N-8和N-9花色均由粉色变为白色。

3 讨论

目前在草莓育种上化学诱变主要是用EMS进行诱变，张经纬等^［24］用EMS来处理丰香草莓的种子，突变率为1%。田前进等^［25］用EMS对草莓组培苗和叶片外植体进行处理，突变率为4.38%。本研究采用NaN₃对红花草莓不定芽进行诱变处理，突变率为4.6%，与田前进和张经纬的结果不完全一致，本研究中出现的花色和花型突变性状，在田前进和张经纬的研究中未出现。在这23株表型突变株中，部分突变体同时产生2种或3种复合性状变异，如花叶突变体同时产生了白色花性状，叶片皱缩卷曲突变体同时产生了白色花性状，茎纤细突变体同时产生株高变矮和小叶性状。这表明不同性状的变异发生在同一单株上是可能的。孙加焱等^［26］用⁶⁰CoY射线和EMS处理甘蓝型油菜，复合变异性状比例占总突变群体的36.60%。

本研究出现的大部分突变体为无益突变体，有益突变体如白色花、三色花和球型花突变体的突变率分别为0.8%、0.2%和0.2%。其中三色花和球型花突变体在以往红花草莓育种中从未见报道过，极具观赏价值。这些有益突变体可以作为育种材料使用。

SRAP分子标记在很多植物鉴定工作中得到广泛应用^［27-28］。本研究中SRAP 标记结果表明，红花草莓M₁代表型突变植株在 DNA 水平发生了基因突变，其中23 株突变株中有22个单株在 DNA水平发生了基因突变，而没有发生DNA水平变化的1株为株高变矮突变株，其表型变化可能是由于植株营养不良或者环境影响造成的，本试验结果获得22株表型突变株既在表型上发生变化又在分子水平发生变化。但存在的问题是，这些表型上的变异能否遗传给后代，是否为基因水平上可遗传的变异，这需要进一步对M₂代植株进行观察。

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基金资助

安徽省重点研究开发计划项目“草莓酒混菌发酵工艺研究与应用”(201904a06020002)

安徽省功能性果饮生态发酵工程研究中心