利用酵母双杂交技术筛选与新孢子虫NcSRS2蛋白相互作用的宿主蛋白

Screening of host proteins interacting with Neospora Caninum NcSRS2 protein by yeast two⁃hybrid system

摘要

目的 筛选与鉴定与新孢子虫NcSRS2蛋白相互作用的Vero细胞蛋白。 方法 从Nc1株犬新孢子虫速殖子中提取DNA作为模板，PCR扩增NcSRS2基因，克隆于pGBKT7表达载体，构建诱饵载体pGBKT7-NcSRS2，转化入Y2H酵母感受态细胞，进行自激活活性验证和细胞毒性检测。利用酵母双杂交技术，以转化诱饵载体pGBKT7-NcSRS2 的Y2H酵母菌株与Vero细胞cDNA文库进行酵母双杂交，筛选与NcSRS2蛋白相互作用的宿主蛋白，对阳性克隆进行测序，并用BLAST分析，筛选出与NcSRS2存在相互作用的Vero细胞蛋白质。 结果 诱饵载体pGBKT7-NcSRS2无自激活活性和细胞毒性，可用于文库筛选。运用酵母双杂交系统，筛选出2个与NcSRS2相互作用的Vero细胞成分，分别是NADH dehydrogenase subunit 1和STMN2。 结论 本研究首次运用酵母双杂交技术筛选出与新孢子虫NcSRS2相互作用的Vero细胞蛋白质，为进一步研究犬新孢子虫NcSRS2参与黏附及入侵宿主细胞的机制奠定基础。

Abstract

Objective The study aim to screen and identify Vero cell proteins that can interact with Neospora caninum NcSRS2 protein. Method The DNA is extracted from the Nc1 strain of N.caninum as a template.The NcSRS2 gene is amplified by PCR， and cloned into the pGBKT7 expression vector to construct the yeast two-hybrid bait vector pGBKT7-NcSRS2.And then， the pGBKT7-NcSRS2 is transformed into the yeast competent cell Y2H.The self-transcriptional activity and cytotoxicity of the constructed bait vector pGBKT7-NcSRS2 are detected.The yeast cell of Y2H containing the pGBKT7-NcSRS2 bait vector is cultured with the Vero cell cDNA library to screen the host proteins interacting with NcSRS2 by yeast two-hybrid technology.The positive clones are sequenced for the BLAST analysis. Result The bait vector pGBKT7-NcSRS2 is no self-transcriptional activity and cytotoxicity and can be used for library screening.Two prey protein interacting with NcSRS2 are captured from Vero cell including NADH dehydrogenase subunit 1 and STMN2. Conclusion This study firstly report on the screening of Vero cell proteins interacting with Neospora caninum NcSRS2 protein by yeast two-hybrid technology， which provide a scientific basis for studying the mechanism of N.caninum adhesion and invasion of host cells.

Graphical abstract

关键词

犬新孢子虫 / NcSRS2 / 酵母双杂交 / 筛选

Key words

Neospora caninum / NcSRS2 / yeast two-hybrid / screening

犬新孢子虫（Neospora caninum）隶属于顶复门，孢子虫纲，是胞内寄生性原虫，可以寄生于多种动物细胞内。新孢子虫病可引起孕畜出现流产、死胎，而感染的新生胎儿会出现运动神经障碍等症状^［1］，成为公认的牛流产的主要原因之一，给畜牧业带来了很大的损失^［2］。

顶复门原虫在入侵宿主细胞时，有专门的分泌细胞器，主要包括微线体，棒状体以及致密颗粒，这些细胞器相互协调来保证虫体的生存和发育，并且让虫体在入侵宿主细胞时遵循一个相对保守的模式^［3］。虫体吸附到宿主细胞表面后，虫体蛋白与宿主细胞表面受体相结合，宿主细胞膜内陷，形成纳虫空泡进入细胞^［4］。研究表明，新孢子虫入侵宿主细胞过程也以蛋白-蛋白的结合模式进行，并不是蛋白质-糖类物质结合模式进行^［5］。许多虫体蛋白质在感染周期，如黏附、侵入、增殖和免疫逃避过程中起到关键作用。特别是SRS家族（SRSs）蛋白在早期介导虫体黏附和入侵中发挥重要作用^［6］，其中SRS2在速殖子和缓殖子两个阶段均可表达，位于新孢子虫的致密颗粒和棒状体内以及速殖子表面，是介导虫体入侵至宿主细胞的重要跨膜蛋白，对入侵宿主起到重要作用^［7］。

参与入侵的蛋白既帮助虫体入侵和胞内增殖发育，又帮助宿主抵御虫体感染，对疾病的发生发展具有重要的作用。本研究构建新孢子虫NcSRS2基因的酵母双杂交诱饵载体，筛选与NcSRS2蛋白相互作用的Vero细胞蛋白，为深入研究NcSRS2蛋白在与新孢子虫黏附及入侵宿主细胞的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

犬新孢子虫Nc1株、Vero细胞、Y2H宿主菌、Vero细胞酵母双杂交cDNA文库由延边大学动物医学系预防兽医学实验室保存；EcoRⅠ、SalⅠ、DL5 000、DL2 000、2×Taq Master Mix、Ligation SolutionⅠ、质粒DNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；SD/-Trp缺陷型培养基、SD/-Leu缺陷型培养基、SD/-Trp/-Leu缺陷型培养基、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷型培养基、载体pGBKT7、X-α-gal半乳糖苷酶显色底物、Aba抗生素、Yeast transformation system 2酵母转化试剂盒购自Clontech公司；腺嘌呤、YPDA培养基购自索莱宝试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 NcSRS2基因的克隆

根据新孢子虫NcSRS2基因的全长编码序列设计引物。上游引物5′-ACGAATTCGCGCCGTTCAAGTCGGAAA ATG-3′；下游引物5′-TTGTCGACAGGCAACT CGTCACATGCATCT-3′，引物上分别加入了EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点，下划线部分显示，引物由吉林省库美生物技术有限公司合成。用DNA提取试剂盒从Nc1株犬新孢子虫速殖子中提取DNA作为模板，进行PCR扩增。以双蒸水作为空白对照，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。扩增产物进行纯化，经EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，酶切产物连入pMD19T Simple载体，构建重组质粒。重组质粒经双酶切鉴定后进行测序。

1.2.2 重组诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的构建及鉴定

测序正确pMD19T-NcSRS2重组质粒经酶切后与诱饵载体pGBKT7连接，转化至大肠杆菌DH5α。重组质粒经酶切鉴定后，将结果阳性菌液进行测序。

1.2.3 诱饵载体pGBKT7-NcSRS2自激活验证

将诱饵载体pGBKT7-NcSRS2转化入Y2H酵母感受态细胞，在SD/-Trp缺陷性固体培养基，SD/-Trp/X-α-gal缺陷性固体培养基和SD/-Trp/X-α-gal/Aba 缺陷性固体培养基均涂布上转化产物，培养4 d后，仔细观察菌落是否生长和菌落颜色变化，来判断诱饵载体pGBKT7-NcSRS2表达的蛋白有无自激活活性。无自激活活性的含诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的Y2H酵母菌在缺陷性培养上可以生长，在含Aba的缺陷性培养中无法生长，且在含X-α-gal培养中菌落呈白色。

1.2.4 检测pGBKT7-NcSRS2细胞毒性

分别含有诱饵载体pGBKT7-NcSRS2和空载体pGBKT7的Y2H酵母细胞，涂布在SD/-Trp缺陷型固体培养基上，恒温培养箱中30 ℃倒置培养4 d。用无菌移液头挑取单个菌落，投入到50 mL SD/-Trp（Kan+）液体培养基中，振荡培养，转速220 r/min。从第12 h至21 h，每3 h取少量菌液，测量菌液D_600nm的数值，并绘制酵母菌的生长曲线，进行诱饵载体组和空载体组的对比，以验证pGBKT7-NcSRS2对Y2H宿主菌有无毒性。

1.2.5 诱饵质粒pGBKT7-NcSRS2与Vero细胞cDNA文库酵母双杂交筛选

将含有诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的Y2H酵母细胞加入50 mL SD/-Trp（Kan+）液体培养基中扩大培养，30 ℃恒温培养箱中220 r/min培养至D_600nm大于0.8，室温下3 000 r/min离心5 min，弃上清，用5 mL SD/-Trp液体培养基重悬沉淀并与1 mL Vero细胞的cDNA文库混合后，倒入含45 mL 2×YPDA（Kan+）液体培养基的锥形瓶中，30 ℃低速振荡培养24 h，进行酵母双杂交。培养至杂交液在显微镜下能观察到大部分细胞呈三叶草形状的杂合子出现，室温下3 000 r/min离心10 min，弃上清。用YPDA液体培养基洗涤沉淀两次，最后用10 mL YPDA液体培养基重悬沉淀。重悬的杂交液涂布于SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal高度缺陷型固体培养基上，30 ℃倒置培养5 d，筛选蓝色阳性菌落，初筛获得的阳性菌落重新涂布SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上进一步筛选。

1.2.6 阳性酵母菌株的PCR鉴定及序列分析

将最终得到的所有蓝色菌落接种于5 mL SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His液体培养基中，30℃振荡过夜。以菌液为模板，文库通用引物3′AD-GTGAACTTG CGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT、5′AD-C TATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAAC CC，进行PCR扩增鉴定。PCR产物送至吉林库美生物有限公司测序。对测序得到的序列进行BLAST数据库比对，以确定筛选到的蛋白类别。

2 结果与分析

2.1 NcSRS2基因克隆及序列分析

提取新孢子虫虫体DNA，经PCR扩增，得到条带大小约为1 000 bp，与大小为1 006 bp目的片段相一致，见图1-A。PCR回收产物与pMD19T Simple载体连接，进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定，与目的片段大小相一致，见图1-B。测序结果与GenBank上NcSRS2基因序列同源性100%。

2.2 诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的构建及鉴定

NcSRS2基因从pMD19T-NcSRS2切下后与pGBKT7载体连接，构建诱饵载体pGBKT7-NcSRS2，然后转化至大肠杆菌DH5α。经酶切鉴定，与1 006 bp大小目的片段相一致，见图2。测序结果显示该基因与与GenBank上NcSRS2基因序列同源性100%，表明成功构建了诱饵载体pGBKT7-NcSRS2。

2.3 诱饵载体自激活验证

pGBKT7-NcSRS2转化入Y2H酵母感受态细胞，转化产物分别涂布在三种缺陷性培养基上，生长出白色酵母克隆的是SD/-Trp缺陷型培基与SD/-Trp/X-α-gal缺陷型培养基，没有生长克隆的是SD/-Trp/X-α-gal/Aba缺陷型培养基，见图3。结果表明诱饵载体pGBKT7-NcSRS2表达的蛋白无自激活活性，因此可以用于酵母双杂交筛选。

2.4 检测诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的细胞毒性

分别含有诱饵载体pGBKT7-NcSRS2和空载体pGBKT7的Y2H酵母细胞在SD/-Trp（Kan+）液体培养基中培养，并测定菌液D_600nm，结果显示诱饵载体组和空载体组的D_600nm相近（图4），说明诱饵载体pGBKT7-NcSRS2对酵母细胞无毒性，不影响酵母菌的生长。

2.5 诱饵质粒pGBKT7-NcSRS2与Vero细胞cDNA文库酵母双杂交筛选

诱饵质粒pGBKT7-NcSRS2与Vero细胞酵母双杂交cDNA文库混合培养，利用倒置显微镜进行镜检，视野中可以观察到多个杂交后产生的酵母合子，见图5A。经过初筛和复筛，得到蓝斑菌株，见图5-B。

2.6 菌落PCR鉴定

对部分蓝斑菌株液体培养后，进行PCR鉴定，显示插入片段大小约为500~1 000 bp之间，有的克隆中检测出2条带，大小也与文库中插入片段的结果相符（图6）。

2.7 鉴定与测序

对插入片段较大的12个阳性克隆株测序后，运用NCBI的BLAST进行比对，发现这12个阳性克隆与2个已知基因的部分序列高度同源（表1）。

3 讨论

犬新孢子虫NcSRS2于速殖子和缓殖子阶段均能产生，含有信号肽的氨基端和疏水性羧基端，是介导虫体入侵至宿主细胞的重要跨膜蛋白^［8］。有研究表明携带NcSRS2基因的重组痘苗病毒免疫小鼠，使小鼠血清中IL-4和IFN-γ水平显著升高，激发产生Th1型和Th2型免疫反应^［9］，纯化的GST-NcSRS2蛋白能提高免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫水平^［10］。目前对于新孢子虫SRS蛋白与宿主细胞之间的相互作用了解较少，需要更深入的研究。

研究蛋白质相互作用的方法有亲和纯化、免疫共沉淀 、酵母双杂交、体内蛋白片段互补分析、双分子荧光互补等^［11-12］，其中Fields和Song创立的因酵母双杂交技术操作简便，广泛用于研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术手段^［13-14］。Liu 等^［15］用酵母双杂交技术筛选出与附红细胞体α烯醇化酶相互作用的猪外周血淋巴细胞中的Endonuclease、clusterin precursor等；柳立新等^［16］筛选出与弓形虫棒状体蛋白9相互作用的人脑组织蛋白中的内质网凝集素蛋白、驱动蛋白结合蛋白、膜联蛋白等；Lai等^［17］筛选出与弓形虫SAG2相互作用的锌指蛋白等。本试验通过构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcSRS2，将NcSRS2作为诱饵蛋白，从宿主Vero细胞的cDNA文库中筛选出与其有相互作用的STMN2蛋白和NADH dehydrogenase subunit 1 （mitochondria）。

目前已公布的STMN2基因序列有人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪等动物，但STMN2基因的结构和功能的研究较少，需要更深的研究与探索。STMN2蛋白的保守性很高，可以通过磷酸化和去磷酸化调控细胞的有丝分裂，因此，STMN2蛋白与细胞周期的调控关系密切，研究发现颗粒细胞的增殖升高与颗粒细胞中STMN2蛋白的表达量升高有关^［18］。STMN2区别于家族中其他成员，是因为其蛋N-末端含有35个氨基酸，对其聚集在生长锥及在高尔基体定位具有巨大的影响作用^［19］。NADH脱氢酶亚基1（ND1）是线粒体膜呼吸链NADH脱氢酶（复合物Ⅰ）的核心亚基，参与线粒体呼吸链的电子传递，对启动整个呼吸链的运转起到重要的作用。弓形虫在侵入宿主细胞过程中伴随一系列与细胞骨架重塑相关的现象，如线粒体等细胞器重新分布，入侵时细胞线粒体向纳虫泡聚集^［20］。

4 结论

本研究PCR扩增出新孢子虫NcSRS2基因，构建诱饵载体pGBKT7-NcSRS2，转化Y2H酵母感受态细胞，运用酵母双杂交系统，以转化诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的Y2H酵母菌株与Vero细胞酵母双杂交cDNA文库宿主菌双杂交筛选与SRS2相互作用的宿主蛋白，筛选出与SRS2相互作用的蛋白质STMN2蛋白和NADH dehydrogenase subunit 1 （mitochondria）蛋白。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060807)

吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20200522KJ)

高等学校学科创新引智计划(D20034)