富含羟基酪醇橄榄油对衰老小鼠的影响

Effect of olive oil containing hydroxyl tyrosol on aging mice

摘要

目的 为研究富含羟基酪醇橄榄油（Olive oil rich in hydroxyl tyrosol，OHT）对衰老小鼠的影响。 方法 利用小鼠颈部皮下注射500 mg/kg的D-半乳糖（D-galactose）溶液构建亚急性衰老模型，建模成功后，将小鼠随机分成7组，分别为空白对照组（CK₀）、模型组（Model group）、维生素E阳性对照组（VE positive control group）、普通橄榄油组（Cormal olive oil group）和OHT高、中、低剂量（200、100、50 mg/kg）处理组（OHT high，medium，low-dose group），连续灌胃28 d，检测小鼠体质量变化及脏器指数、血清中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的变化，观察肝组织形态学变化。 结果 OHT使衰老小鼠的体质量和脏器指数显著升高（P<0.05，P<0.01），肝脏病理变化得到改善，血清CAT、GSH-Px和SOD活性显著升高（P<0.05，P<0.01），MDA含量显著降低（P<0.05，P<0.01），以上指标变化在OHT高剂量组尤为明显，且OHT干预效果强于普通橄榄油。 结论 OHT能提高机体抗氧化能力，进而发挥抗衰老的作用。

Abstract

Objective To study the effects of olive oil containing hydroxyl tyrosol （OHT） on aging mice. Method An aging animal model was established by subcutaneous injection of 500 mg/kg D-galactose in the neck，and after successful modeling，the mice were randomly divided into 7 groups： blank control group，model group，VE positive control group，common olive oil group，OHT high，medium and low dose treated groups （200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg），the OHT was administered to the mice by intragastric administration for 28 consecutive days.The weight and viscera indexes of each group were calculated，and the activities of glutathione peroxidase （GSH-Px），superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT） and malondialdehyde （MDA） in the serum were determined，and the morphology changes of the liver tissue were observed. Result OHT could significantly improve the body weight and organ index in aging mice（P<0.05，P<0.01），ameliorate the pathological changes of the liver，significantly increase the activity of serum CAT，GSH-Px and SOD （P<0.05，P<0.01），and significantly reduced MDA content （P<0.05，P<0.01）.The changes in the above indexes were particularly evident in the high-dose OHT group，and the intervention effect of OHT was stronger than that of normal olive oil. Conclusion OHT could improve the body’s antioxidant capacity to play an anti-aging role.

Graphical abstract

关键词

羟基酪醇 / 橄榄油 / 衰老小鼠 / 抗氧化 / 抗衰老

Key words

hydroxytyrosol / olive oil / aubacute senescence mice / antioxidant / anti-aging

橄榄油属木本植物油，是新鲜的油橄榄果实经直接冷榨而获取的果汁油，因其不经加热和化学处理，保留了油橄榄果中的天然营养成分^［1］。橄榄油中富含甾醇类、类胡萝卜素、三萜类、角鲨烯、脂溶性维生素、多酚类、不饱和脂肪酸、酚类化合物和其它色素等多种活性成分，被誉为“飘香的软黄金”^［2-3］，是地中海膳食结构的重要饮食结构之一，因其具有众多健康益处和独特的风味而收到消费者的青睐。研究发现，橄榄油具有保持肠道菌群健康、养肤护肤、降低血脂、预防心血管疾病、阿尔茨海默病、肝病、癌症、糖尿病和骨质疏松症等保健和疾病预防功效^［4-7］，是理想的高级食用油。

羟基酪醇（3，4-二羟基苯基乙醇）广泛存在于新鲜橄榄叶、橄榄油废水、橄榄果渣以及橄榄油中，是一种天然的酚类化合物，其生物利用度和安全性高、无毒性且不易引起过敏反应^［8］。羟基酪醇可有效去除外源性和内源性自由基和氧化物，是一种自由基清道夫，具有良好的抗氧化作用^［9-11］。目前，国内外学者的研究主要集中在橄榄油的保健和药用功效上，而对富含羟基酪醇橄榄油的相关研究较少，本实验以衰老小鼠模型研究富含羟基酪醇橄榄油对衰老小鼠的影响，以期为开发无毒无副作用的抗衰老油橄榄保健食品，为开发富含羟基酪醇橄榄油保健产品及其功效研究，同时为国内外橄榄油保健食品研发、产业延伸和产品推广的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

橄榄油由甘肃时光油橄榄科技有限公司提供；SPFKM小鼠，雌雄各半，体质量22~28 g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证号：SCXK（甘）2020-0002。

1.2 试验试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量检测试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；D-半乳糖，购自江苏鹏翔生物医药有限公司；维生素E，购自成都乐美天医药科技有限公司。

1.2.2 主要仪器

R35组织切片机，购自德国徕卡仪器有限公司；BZ-X一体化显微成像系统，购自基恩士 （中国） 有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅，购自上海一恒仪器有限公司；Sorvall ST8台式离心机，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UV759紫外-可见分光光度计，购自上海精密科学仪器有限公司；FA1204万分之一电子分析天平，购自上海力辰仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 富含羟基酪醇橄榄油制备

取清洗洁净的新鲜去核油橄榄果，粉碎，过80目筛，将粉碎后的油橄榄果置于重量为其6倍的45 ℃纯净水中，混合均匀，然后用转速为16 000 r/min的高速剪切，破碎10 min，每破碎2 min，中间间隔0.5 min。破碎后的匀浆液在45 ℃恒温条件下搅拌至形成果浆。然后将果浆在常温下压榨处理，用20 000 r/min高速离心机离心5 min，弃掉果渣，将上清液（油水混合液）过400目滤膜。在过滤液内加入重量为其10%的硫酸钠，混合均匀后静置25 min，再进行油水分离，得到富含羟基酪醇橄榄毛油和果水。富含高含量羟基酪醇橄榄毛油静置24 h后，得富含羟基酪醇功能特级初榨橄榄油，用高效液相测定橄榄油中羟基酪醇的含量为20 mg/100g，检测含量的色谱柱：SinoChrom ODS-BP（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流动相：0.1%甲酸-水∶乙腈（86∶14，v/v），流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测器和检测条件：DAD，280 nm，进样体积：20 μL^［3］。普通橄榄油中羟基酪醇的含量约为2.5 mg/kg。

1.3.2 动物模型建立与给药

根据参考文献10-11的方法，购买回来的70只KM小鼠适应性饲喂7 d后，将小鼠随机分成7组，每组10只，统一饲喂基础日粮。先取6组小鼠按体质量500 mg/kg分别颈部皮下注射5%的D-半乳糖，连续注射42 d后，检测各组小鼠体质量和血清中GSH-Px、SOD、CAT和MDA含量，数据经SPSS 18.0分析，若CK₀组与建模组存在显著性差异，即为亚急性衰老小鼠建模成功；剩余1组小鼠颈部皮下注射相同体积的生理盐水为空白对照组CK₀。将建模成功的6组小鼠分为设为衰老模型组、VE阳性对照组、普通橄榄油组和富含羟基酪醇橄榄油高、中、低剂量组。VE阳性对照组和普通橄榄油组分别按170 mg/kg和200 mg/kg剂量灌胃维生素E和普通橄榄油，富含羟基酪醇橄榄油高、中、低剂量组分别按200、100和50 mg/kg^［3］剂量灌胃富含羟基酪醇橄榄油，灌胃相同体积的生理盐水为空白对照组CK₀，以上7组小鼠在相同饲养条件下连续灌胃28 d，分别在灌胃0、7、14、21、28 d称量小鼠质量，末次灌胃禁食不禁水12 h后，小鼠眼眶静脉丛采血，置于不加抗凝剂的红头采血管内，4 ℃低温4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，按检测试剂盒说明书操作步骤测定GSH-Px、SOD、CAT活性和MDA含量，解剖各组小鼠分离脏器（心、肝、脾、肾、脑和胸腺）并称质量，计算脏器指数（脏器指数=脏器质量/小鼠质量）×100%。

1.4 石蜡切片制作与HE染色

将采血后小鼠断颈处死，剖检死亡小鼠取出肝脏，迅速放在装有4%多聚甲醛溶液的广口瓶内固定，固定好的组织块经过修块、不同浓度CH₃CH₂OH脱水、苯蜡透明、包埋，石蜡切片机切片（厚度6 µm），37 ℃烘箱内过夜，HE染色，中性树胶封片后，置于光学显微镜下观察并拍照。

1.5 数据统计

实验数据经SPSS 18.0统计分析，结果均以平均值±标准误（\overline{x}\pm s）表示，采用单因子方差分析（One-way ANOVA，LSD）法检验比较各组数据差异性，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 OHT对衰老小鼠体质量与脏器指数的影响

OHT对衰老小鼠体质量的影响见表1。OHT灌胃第7天，与空白对照组相比，普通橄榄油组和OHT低剂量组小鼠体质量下降，存在显著性差异（P<0.05），其余各组间无统计学意义（P>0.05）。OHT灌胃第14天，与空白对照组相比，普通橄榄油组、OHT低剂量组和模型组小鼠体质量显著下降（P<0.05），其余各组间无统计学意义（P>0.05）。OHT灌胃第21 天，与对照组相比，普通橄榄油组和模型组小鼠体质量下降，存在极显著性差异（P<0.01），OHT低剂量组小鼠体质量显著下降（P<0.05）；与模型组相比，VE阳性对照组和OHT高剂量组小鼠体质量极显著增高（P<0.01），普通橄榄油组和OHT中剂量组小鼠体质量显著增高（P<0.05）；与普通橄榄油组相比，OHT高、中、低剂量和VE组小鼠体质量均明显增加，存在极显著性差异（P<0.01）。OHT灌胃第28天，与空白对照组相比，模型组、普通橄榄油和OHT低剂量组小鼠体质量明显下降，存在极显著性差异（P<0.01）；与模型组和普通橄榄油组相比，OHT高剂量和OHT中剂量组小鼠体质量增速明显，存在极显著性差异（P<0.01）；与VE阳性对照组相比，OHT中剂量和低剂量组小鼠体质量下降，存在极显著性差异（P<0.01）。以上结果表明，OHT灌胃前14天，OHT对小鼠体质量无明显影响（P>0.05），至第21天和28天时，OHT中剂量组可明显增加衰老小鼠体质量，增重效果明显好于普通橄榄油。

OHT对衰老小鼠脏器指数的影响见表2。OHT灌胃28 d后，与空白对照组相比，模型组、普通橄榄油组、OHT中剂量和低剂量组小鼠心脏指数明显下降，存在极显著差异（P<0.01），VE阳性对照组小鼠心脏指数升高，存在显著差异（P<0.05）；与模型组相比，VE阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠心脏指数升高，差异性极显著（P<0.01）；与普通橄榄油组相比，OHT高、中剂量组小鼠心脏指数增加，差异性极显著（P<0.01）；与VE阳性对照组相比，普通橄榄油组、OHT高、中、低组小鼠心脏指数下降，存在极显著性差异（P<0.01）。与对照组相比，模型组、阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠肝脏指数下降，差异性极显著（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠肝脏指数升高，差异性极显著（P<0.01）；OHT高、中、低剂量组小鼠肝脏指数明显高于普通橄榄油组，低于VE阳性对照组，存在极显著性差异（P<0.01）。与空白对照组相比，模型组、普通橄榄油组和OHT中、低剂量组小鼠脾脏指数明显下降，差异性极显著（P<0.01），OHT高剂量组小鼠脾脏指数下降，存在显著性差异（P<0.05），与模型组相比，VE阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠脾脏指数增加，差异性极显著（P<0.01）；与普通橄榄油组相比，OHT高剂量组小鼠脾脏指数明显升高，差异性极显著（P<0.01）；其余各组之间无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组相比，模型组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠肾脏指数明显下降，差异性极显著（P<0.01）；与模型相比，阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中剂量组小鼠肾脏指数升高，差异性极显著（P<0.01）；与普通橄榄油组相比，OHT高剂量组小鼠肾脏指数显著升高，差异性极显著（P<0.01），OHT低剂量组小鼠肾脏指数下降，差异性显著（P<0.05）；与VE阳性对照组相比，OHT高、中剂量组小鼠肾脏指数下降，差异性极显著（P<0.01）；其余各组之间无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组相比，模型组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠脑指数降低，差异性极显著（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠脑指数明显升高，差异性极显著（P<0.01）；与普通橄榄油组相比，OHT高、中、低剂量组小鼠脑指数明显升高，差异性极显著（P<0.01）；与阳性对照组相比，OHT高、中、低剂量组小鼠脑指数明显下降，差异性极显著（P<0.01）。与空白对照组相比，模型组、普通橄榄油组和OHT中、低剂量组小鼠胸腺指数明显下降，差异性极显著（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照组、普通橄榄油组和OHT高、中、低剂量组小鼠胸腺指数脑指数明显升高，差异性极显著（P<0.01）；与普通橄榄油组相比，OHT高、中、低剂量组小鼠胸腺指数明显升高，差异性极显著（P<0.01）；与VE阳性对照组相比，OHT中、低剂量组小鼠胸腺指数明显下降，差异性极显著（P<0.01）；其余各组之间无统计学意义（P>0.05）。以上结果表明，OHT可明显改善衰老小鼠的心、肝、脾、肾、脑和胸腺指数，其效果强于普通橄榄油。

2.2 OHT对衰老小鼠CAT、GHS-Px、SOD活性及MDA含量的影响

OHT对亚急性衰老小鼠CAT、GHS-Px和SOD活性的影响见图1。衰老小鼠模型组血清内CAT、GHS-Px和SOD活性最低，与CK₀组相比3种酶活性差异性均极显著（P<0.01）；衰老小鼠经连续灌胃维生素E 28 d后血清中CAT、GHS-Px和SOD活性高于CK₀组，两组相比3种酶活性差异性极显著（P<0.01）；衰老小鼠经连续灌胃OHT高、中、低剂量28 d后，血清中CAT、GHS-Px和SOD活性随OHT剂量的增加依次递增，与模型组相比3种酶活性均显著升高，差异性极显著（P<0.01）；与CK₀组相比GHS-Px和SOD活性显著升高，差异性极显著（P<0.01），OHT低剂量组CAT活性略升高，无统计学意义（P>0.05），OHT高、中剂量组CAT活性显著升高，差异性极显著（P<0.01）；与VE阳性对照组相比3种酶活性显著降低，差异性极显著（P<0.01）；OHT高剂量组CAT、GHS-Px和SOD活性，OHT中剂量组GHS-Px活性均显著高于普通橄榄油组，差异性极显著（P<0.01）；OHT低剂量组CAT、GHS-Px和SOD活性，OHT中剂量组CAT和SOD活性与普通橄榄油组相比显著降低，存在显著性差异（P<0.01）；OHT高、中、低剂量组CAT、GHS-Px和SOD活性之间相互比较，均存在极显著性差异（P<0.01）。

OHT对亚急性衰老小鼠MDA含量的影响见图2。衰老小鼠模型组血清内MDA含量最高，与其他各组相比差异性极显著（P<0.01）；衰老小鼠经连续灌胃VE 28 d后血清中MDA含量稍高于CK₀组，两组相比差异性显著（P<0.05）。衰老小鼠经连续灌胃OHT高、中、低剂量28 d后，血清中MDA含量随OHT剂量的降低而逐渐增加，与模型组相比差异性极显著（P<0.01）；CK₀组与OHT高剂量组相比MDA含量降低，差异性显著（P<0.05），与OHT中、低剂量组相比，差异性极显著（P<0.01）；VE阳性对照组与OHT高剂量组相比无差异性（P>0.05），与OHT中、低剂量组相比MDA含量降低，差异性极显著（P<0.01）；OHT高、中、低剂量组MDA含量明显低于普通橄榄油组，差异性极显著（P<0.01）；OHT高、中、低剂量组之间相互比较，高、中剂量组和中、低剂量组之间存在显著性差异（P<0.05），高、低剂量组之间存在极显著性差异（P<0.01）。以上结果表明，OHT具有降低衰老小鼠血清中MDA含量的作用，高剂量组效果最好，其效果均优于普通橄榄油，但不如VE治疗组。

2.3 OHT对衰老小鼠肝脏组织形态结构的影响

小鼠肝脏HE染色结果见图3。CK₀组小鼠肝脏结构正常，每个肝细胞有1~2个核，位于肝细胞中央，细胞质丰富，肝细胞索排列正常，肝血窦正常（见图I）；衰老模型组小鼠肝脏细胞结构不清晰，排列松散，肝板与肝板之间的肝血窦消失，胞质淡染，部分细胞核萎缩，着色不强，肝细胞索排列不规则，同时可见大量脂肪颗粒（见图II）；而经VE治疗后的小鼠肝细胞及肝索排列整齐，可见均匀的肝血窦，肝细胞胞质着色正常，细胞核位于肝细胞中央（见图III）；普通橄榄油组小鼠，肝细胞结构不清晰，排列松散，肝血窦缩小（见图IV）；OHT高剂量处理组小鼠肝细胞和肝细胞索排列整齐，肝血窦均匀散在（见图V）；OHT中剂量处理组小鼠肝组织切片视野内约一半肝细胞结构清晰，一半肝细胞结构模糊，肝血窦微扩张（见图VI）；OHT低剂量处理组小鼠肝组织嗜酸性减弱，肝细胞结构不清晰，肝细胞索排列不整齐（见图VII）。以上结果表明，OHT具有保护衰老小鼠肝组织的作用，高剂量组效果最好，其效果均优于普通橄榄油，但不如VE治疗组。

3 讨论与结论

衰老是生物随着时间推移发生的一种自发的必然生物学过程，具体表现为组织结构的退行性病变和机能衰退^［12］，在众多抗衰老机制的学说中，自由基学说是公认的学说之一^［13］。氧化应激是正常机体内不可避免的一种状态，临床上很多疾病都与机体内过度的氧化应激都有对应的关系^［14-15］。机体在正常情况下，所产生的活性氧族自由基与抗氧化作用处于一种动态平衡状态^［16-17］，当体内的这种平衡被破坏，就会发生相应的疾病。而抗氧化系统中GSH-Px、SOD和CAT是清除自由基的主要过氧化物酶，GSH-Px可清除水和脂质氢过氧化物，降低过氧化物对机体的损伤^［18］；SOD通过催化超氧阴离子歧化为氧气和水，使正常情况下生成的一些自由基转变为非自由基，或是使自由基的不成对电子通过GSH转移至氧气，成为可被SOD清除的自由基而排出，从而防止自由基对机体产生损伤作用；CAT可清除过氧化体中尿酸氧化酶与羟基乙酸氧化酶等催化反应产生的H₂O₂的作用^［19-21］。另外，自由基可导致生物膜上的多元不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生成脂质过氧化物，而MDA是脂质过氧化物分解后的产物，造成机体生成脂褐素等异常代谢物，发生多种生化毒性反应，从而引发机体的多种疾病和衰老，形成老年斑^［22］。本研究以亚急性衰老小鼠模型为研究对象，结果显示OHT使衰老小鼠的体质量和脏器（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑）指数显著升高，显著改善了肝脏的病理变化，升高了血清CAT、GSH-Px和SOD活性，降低了MDA含量，以上指标变化在OHT剂量组与普通橄榄油组相比差异明显，这说明OHT能增强机体的抗氧化能力，具有明显的抗衰老作用，且OHT的干预效果强于普通橄榄油。

综上所述，OHT可通过增加亚急性衰老小鼠模型体内CAT、GSH-Px和SOD活性，降低MDA含量，改善损伤的肝脏组织，从而发挥抗衰老作用，且其抗衰老作用明显优于普通橄榄油，但橄榄油抗衰老的机制比较复杂，而富含羟基酪醇的橄榄油研究报道较少，还需要进一步研究和探讨。

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基金资助

2021年甘肃省科技重大专项(21ZD4NK045)

2022年甘肃省重点研发计划项目(22YF7FK220)

2021年甘肃省自然科学基金项目(21JR7RK912)

2023年甘肃省高校教师创新基金项目(2023B-412)

陇南市科技计划项目(2021-11)