牛支原体deoC蛋白多抗的制备及生物信息学分析

Preparation and bioinformatic analysis of polyclonal antibody to the deoC protein of Mycoplasma bovis

摘要

目的 研究牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）武威株脱氧核糖磷酸醛缩酶（Deoxyribose-phosphate aldolase protein，DERA）基因序列特征及其分布位置，对免疫原性做初步探究。 方法 参照GenBank PG45菌株deoC基因（登录号：CP002188.1）设计引物PCR扩增deoC基因全长，构建原核表达载体pET-deoC。经感受态BL21转化IPTG诱导后纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清，应用Western blot与间接ELISA检测对其免疫原性和细胞内的分布进行初步研究。 结果 deoC 基因全长为669 bp，重组蛋白为可溶性形式；Western blot与间接ELISA结果具有较高的免疫原性，在细胞质中分布多于细胞膜。与地方株同源性均为95.4%，亲水性蛋白，无信号肽和跨膜结构，存在磷酸化位点和糖基化位点，混合型二级结构。 结论 deoC具有良好的免疫原性，为研究牛支原体抗原提供了一定的理论基础依据。

Abstract

Objective The aim of the experiment was to study the sequence characteristics and distribution of the deoxyribose-phosphate aldolase protein (DERA) gene of Mycoplasma bovis Wuwei strain and to preliminarily investigate the immunogenicity. Method Primers were designed according to the deoC gene of the PG45 strain in GenBank (accession number:CP002188.1)，and the full-length deoC gene was obtained by PCR and the prokaryotic expression vector pET-deoC was constructed.After transformation of E.coli BL21 competent cells，the purified protein was induced by IPTG and New Zealand rabbits were immunized to produced polyclonal antiserum.Western blot and indirect ELISA were used to determine the immunogenicity and intracellular distribution. Result The deoC full-legth gene was 669 bp，and the recombinant protein was soluble;Western blot and indirect ELISA results showed that it had high immunogenicity and was distributed more in the cytoplasm than in the cell membrane.The homology with local strains was 95.4%，hydrophilic protein，no signal peptide and transmembrane structure.There are phosphorylation sites and glycosylation sites，mixed secondary structure. Conclusion deoC has good immunogenicity，which provides a theoretical basis for studying of M.bovis antigen.

Graphical abstract

关键词

牛支原体 / deoC基因 / 基因克隆 / 生物学信息分析

Key words

Mycoplasma bovis / deoC gene / gene cloning / biological information analysis

牛支原体呈世界性分布，其中对于发展中国家的养殖业和经济造成了明显的挑战^［1］。牛支原体主要引起牛群发生牛呼吸系统疾病、关节炎以及生殖系统等疾病，发病特点以高热不退，呼吸困难、肺炎、四肢跛行、和母畜流产等为特征^［2］。牛支原基因组存在可变蛋白基因，在不同的地域空间可以进化出不同的种株。随着国内引进新品种和与其他国家贸易往来1910 年传播进我国，2008年牛支原体爆发对我国的养牛业发展影响日益严重^［3］。湖北、宁夏、新疆等地区出现以地方为代表的新型地方株：MJ1株，16M株，HB0801-P180，150，115株，NM2012株，CQ-W70株等^［4］。目前在针对牛支原体的疫苗研究，美国是唯一一个在牛支原体疫苗研究方面取得成熟技术并且商品化的国家，该技术未成熟之前美国牛支原体感染率高达70%，将近损失1.1亿美元^［5-6］。

deoC基因蛋白（Deoxyribose-phosphate aldolase protein，DERA脱氧核糖磷酸醛缩酶）属于deoC/FbaB 醛缩酶家族^［7］。该类家族成员广泛的存在于各种生物中，其中在鼠类，人类以及多种哺乳动物都存在，但是在哺乳动物中这种蛋白质从未被正式确定^［8］。醛缩酶家族成员根据严格的供体机制可以分为两大类：I类醛缩酶和II类醛缩酶^［9］。目前已经发现30 余种醛缩酶，其中I类醛缩酶主要是存在于动物以及高级植物；II类醛缩酶主要存在于真菌以及细菌之中；相对于前者，后者酶类生物活性显得更为稳定，对于供体的选择通常以三分子的乙醛为底物，最后生成2，4，6脱氧已糖。蒋仁新发现脱氧核糖磷酸醛缩酶（deo C）与p59可以发生相互作用，与其他互作蛋白功能相比较发现均为碳水化合物摄取相关，例如ABC转运蛋白2（ADR24785.1、ADR25073.1）、ABC转运器组成蛋白（ADR25021.1）、胞苷脱氨酶（cdd）、脱氧核苷激酶（ADR24931.1、ADR25021.1）和p48脂蛋白（ADR24695.1）等^［10］。与其他的醛缩酶类相比较，在底物结合的过程可以连续的进行醛缩反应。催化过程中通过共价键将底物和活性部分的氨基酸结合，形成Shiff碱，引发键的断裂和形成^［11-12］；Han发现deoC 基因编码的脱氧核糖醛缩酶可能通过分解细胞外基质中的 eDNA，增强生物膜再生成功能^［13］。

根据现有研究证实该蛋白多存在于无法自身利用或者生成ATP的细胞，这类细胞用来利用细胞外脱氧肌苷来将２⁃脱氧⁃Ｄ⁃核糖⁃５⁃磷酸转化为甘油醛⁃３⁃磷酸和乙醛维持自身ATP的动态平衡的生成。DERA催化合成相比较与其他催化反应的优势在于∶反应条件专一且过程温和，转化率高于同类催化以及反应产物单一纯粹，不会有对应异构体出现^［14］，因此DERA催化的研究具有学术实际意义。目前关于牛支原体deoC蛋白的报道和研究较少，本研究将弥补这一空缺，对此进行预测和分析，以期对该蛋白特性以及功能提供一定的理论基础。

本研究利用牛支原体武威株 deoC 基因进行克隆转化和生物学信息分析，以期对该蛋白的功能和牛支原体的预防治疗提供科学的参考依据。目前对于牛支原体deoC蛋白的研究较少，该基因对生物体的致病机理不清楚和蛋白功能尚不明确，因此本研究deoC基因作为研究出发点，对其序列克隆分析，推测其特性和国际标准株的进化关系，进一步为牛支原体的预防和治疗提供参考指导。

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株牛支原体武威分离株由甘肃农业大学传染病学实验室保存；原核表达载体pET-28a（+）由甘肃农业大学传染病实验室分离和保存。

1.2 主要试剂

限制性核酸内切酶以及连接酶，TaKaRa有限公司产品；DNA marker与预染蛋白质分子质量标准，Thermo公司产品；质粒小提试剂盒，天根生化科技公司产品；琼脂糖，北京擎科生物公司产品；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma公司产品；蛋白酶抑制剂与显色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；BCA蛋白定量试剂盒与羊抗兔HRP-IgG，碧云天生物公司产品；支原体培养基基础，青岛海博生物技术有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 deoC基因引物设计

参照GenBank PG45菌株deoC基因（CP002188.1）设计特异性引物（表1），使用Snapgene软件设计引物并分别在引物上游添加BamHⅠ酶切位点XhoⅠ酶切位点XhoⅠ酶切位点以及保护碱基对。引物序列为deoC-F：5′-CGCGGATCCATGAAAATTGATTACAACAAAATGAT（下划线为BamHⅠ酶切位点），deoC-R：5′-TATCTCGAGCTAGTAGCCGCCGTGT GATTCTTT（下划线为XhoⅠ酶切位点），预计扩增产物大小669 bp。引物信息见表1，由北京擎科生物有限公司合成。

1.3.2 菌液以及基因的提取

从-80 ℃冰箱取出牛支原体分离株复苏接种于支原体培养基中，在37 ℃，5% CO₂中培养48~72 h。取新鲜的牛支原体菌液2 ｍL在4 ℃，12 000 r/min的条件下离心8 min，弃上清，加入1 ｍL无菌PBS将沉淀悬浮，上述操作方法重复3次，最终用100 μL PBS悬浮，沸水煮沸8 min，立即放在冰上冰浴6 min，12 000 r/min离心后上清为粗提基因组，-20 ℃保存备用。

1.3.3 deoC全长基因的扩增

上述粗提的总DNA为模板，使用引物deoC-F与deoC-R扩增全长deoC 基因（669 bp），扩增程序：95 ℃ ，5 min；95 ℃ ，1 min；55 ℃ ，45 s；72 ℃ ，1 min，共35 个循环。扩增反应体系如下：2×PCR MIX 20 μL、DNA模板4 μL、上下游引物各1.5 μL、dd水补足至40 μL。最后应用12 g/L琼脂凝胶对PCR产物电泳后回收。

1.3.4 pET-deoC 的载体构建

分别对pET-28a和deoC全长片段分别提取质粒后用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶进行分别过夜酶切后回收构建pET-deoC质粒，酶切体系为：全长deoC基因片段（或质粒）20 μL，BamHⅠ 2 μL，XhoⅠ2 μL，10×K Buffer 4 μL，加ddＨ_２Ｏ补足40 μL。酶切产物回收后过夜连接，转化进DH5a感受态细胞内，琼脂电泳结果判断是否大肠杆菌是否含有特有质粒。将验证成功的将验证为阳性的质粒送往北京擎科生物公司测序。

1.3.5 重组蛋白的诱导表达及可溶性鉴定

按照上述成功转化的方法将pET-deoC转化至BL21感受态细胞，在培养基上挑取多个单菌落于2 ｍL 2-YT培养液中震荡培养至D₆₀₀到0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 mol/L，16 ℃震荡培养16 h，12 000 r/min过夜培养，分别取1 ｍL于1.5 ｍL离心管，其他的放置冰箱备用。在12 000 r/min后弃掉上清，用适量1xPBS悬浮并加20 μL 5×蛋白上样缓冲液混匀后水浴15 min，冰上冷却5 min后离心经进行SDS-PAGE分析。

1.3.6 表达产物的纯化

将上述SDS-PAGE分析表达量高的菌液转接于200 mL的2-YT培养液中，按照上述方法进行等比例扩大培养后经4 ℃，12 000 r/min离心条件后弃掉上清，沉淀用PBS重悬3次后加入适量Binding Buffer 悬起在冰上破碎，破碎条件如下：功率200 W，工作时间3 s，停歇时间4 s，时间35 min。直至破碎上清液清亮，用HIS标签的Ni柱进行纯化，分别制样进行SDS-PAGE分析。

1.3.7 多抗血清的制备以及免疫原性分析

新西兰兔正常喂养7 d后，观察其生理状态无异常情况用于制备deoC蛋白多抗血清，确认无误后采取少量血液制作阴性血清。将经纯化定量的deoC重组蛋白取800 μg，与佐剂一比一等体积的充分乳化后对新西兰兔进行背部皮下点射免疫。14 d后取纯化蛋白deoC 400 μg同样一比一等体积的不完全佐剂充分混匀，按照二免时用的剂量以及佐剂每7天一个周期免疫并采血测效价，同上一次效价相比不再上升就停止免疫并分离血清后-20 ℃保存备用，并用于Western blot分析其蛋白的免疫原性。

1.3.8 deoC蛋白在牛支原体细胞内的分布

将牛支原体扩大培养至100 ｍL支原体培养基中，待到培养至后期8 000 r/min离心30 min后，PBS洗涤后将沉淀重悬后取少量制成全菌蛋白，使用TritonX-114法分离膜蛋白和胞浆蛋白，将提取好的膜蛋白和胞浆蛋白分别包被酶标板，低温过夜后用PBST洗涤3次后每孔加入200 μL的5%脱脂乳，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤3次后将多抗血清以1∶1 000 稀释后加入每孔孵育1 h。PBST洗涤3次，加入1∶8 000 稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育１h后PBST同上洗涤３次，每孔避光加入100 μL TMB底物显色液，于室温避光显色15 min后加入H₂SO₄溶液终止反应，平行试验3 次取平均值，同时设立阴性对照和空白对照。

1.3.9 deoC蛋白生物信息学分析

将正确的阳性菌送往北京擎科生物有限公司测序后将测序，使用在线软件比对结果在NCBL上对deoC基因进行Blast后分析；使用DNAMAN将标准株P45和其他不同来源的的菌株deoC基因进行对比；利用DNA star进行构建进化树；应用ExPASy-Prot-Param对蛋白理化性质进行预测；应用 InterPro进行预测蛋白疏水域；应用SignaIP（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）预测蛋白信号肽；使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白跨膜结构；应用NetPhos - 3.1（https：//www.dtu.dk/english）预测蛋白的磷酸化位点和糖基化位点；应用Smart（http：//smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白二级结构；应用Swiss-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白三级结构；应用在线工具Swiss-MODEL和PROCHECK软件对三级结构进行拉曼图分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增以及测序

利用PCR技术成功的扩增一条大小约为669 bp的条带（图1），测序结果与双酶切鉴定预期大小一致（图2），成功克隆deoC基因，其蛋白由222 个氨基酸编码组成。

2.2 deoC蛋白的少量诱导以及纯化SDS-PAGE

目的蛋白插入pET-28a载体后分子量约为24.2 ku，在16 ℃低温诱导16 h后经SDS-PAGE分析：少量诱导纯化前全菌样（图3）和大量诱导纯化后（图4）的蛋白大小在预期结果25 ku处，与预期结果相符。

2.3 Western blot免疫原性分析

Western blot显示：目的区有特异性性条带且与预期一致（图5），表明该蛋白可以特异性结合和具有良好的免疫反应性。

2.4 蛋白的定位分析

间接ELISA结果显示：deoC蛋白在细胞膜和细胞质都存在，且细胞质的含量高于细胞膜（图6）。

2.5 deoC蛋白生化信息预测

2.5.1 序列同源性比对

将测序结果在NCBL进行blast结果显示；牛支原体武威株deoC基因和国内分离株MJ1株，XBY01株，16M株，08M株，HB0801-P180，150，115株，NM2012株，CQ-W70株同源性为95.4%，和国际标准株PG-45株同源性为42.4%（图7），此外进化树分析显示，deoC基因和国内分离株距离较近，似乎与国内分离株属于同一进化分支（图8）。

2.5.2 理化性质

deoC蛋白由222 个氨基酸所编码，蛋白分子蛋白分子大小约为24.2 ku，分子式C₁₀₇₄H₁₇₄₆N₂₇₆O₃₃₁S₁₃，理论等电点（pl）为6.45，由222 个氨基酸构成，其中酪氨酸最多（12.2%），带负电荷的残基总数（Asp+Glu）共31 个（表2），带正电荷的残基总数（Arg+Lys）共30 个，半衰期约为30 h，不稳定指数是23.42（<40为稳定蛋白），属于稳定蛋白。

2.5.3 亲/疏水性分析

亲/疏水性最大值是2.022（位于第61位氨基酸处），最小值为-2.333（位于第102位氨基酸处），总平均疏水性为-0.082（正值表示疏水，负值表示亲水），同时该蛋白含有大量亲水域 ，表明deoC蛋白为属于亲水性蛋白（图9）。

2.5.4 信号肽以及跨膜结构预测

应用在线工具SingaLP5.0 对牛支原体deoC蛋白信号肽预测，结果显示，该蛋白不存在信号肽（图10）和跨膜区（图11）。

2.5.5 磷酸化和糖基化预测

利用在线软件对deoC蛋白序列进行预测，结果显示当潜在磷酸化位点阈值为0.5时，该蛋白存在19 个潜在的磷酸化的位点（图12），其中丝氨酸9 个，苏氨酸8 个和1 个酪氨酸。预测该蛋白含有一个糖基化位点（图13）。

2.5.6 deoC蛋白的二级结构预测

使用SOPMA在线软件对牛支原体deoC蛋白二级结构进行分析，结果如图所示，该蛋白主要是由46.85%的α－螺旋（H）、16.67%的e-延伸链、7.21%的β-折叠（S）、和29.28%的无规则卷曲（L）等组成（图14）。

2.5.7 deoC蛋白的三级结构预测

在SWISS-MODEL预测deoC蛋白三级结构模型（图15），选取相似性为50.92%（2-214位氨基酸残基）建立三级结构的单链空间建构模型（通常认为预测蛋白序列一致性≥30%的已知蛋白结构为模板）。与其模板结构GMQE值（数值最接近于1最佳）与QMEAN值（数值最接近于0最佳）分别为0.83、0.09，为了进一步评估其模型质量是否可靠，分别用Swiss-MODEL（图16-A）和PROCHECK（图16-B）进行了拉曼图谱分析。统计分析结果显示，位于最适区、较合适区、可接受区和不合理区的氨基酸 残基数分别为 366、21、1和0，所占百分率分别为94.3%、5.4%、0.3%和0%，共有100.0%的氨基酸残基位于允许区，表明预测的deoC蛋白质高级结构比较稳定，该模型较为可靠（图16）。

3 讨论

由于牛支原体缺乏细胞壁，主要功能都是由细胞膜承担。细胞膜丰富的蛋白种类在生长代谢营养输送等各个方面起着重要作用^［15-17］。Salleron等^［18］ 发现deoC蛋白在其他生物广泛存在，主要功能是参与代谢调节，通过催化磷酸二酯键来达到调节作用，催化乙醛和D-甘油醛3-磷酸之间的可逆羟醛反应，生成2-脱氧-D-核糖5-磷酸，是生物体内一种重要的调节过程。廖志夫^［19］研究证实该蛋白还对于多种微生物是重要的调节生命功能的蛋白，还发现该蛋白除了在链球菌中参与对DNA的分解能力以外，还可以抑制其他生物生物膜形成来提高自身生物膜形成的能力，例如降低链球菌对口腔的黏附能力来提高自身的耐受性，有希望应用于治疗龋病。

Liu等^［20］发现在变形链球菌该蛋白通过介导生物膜扩散促进感染传播，以及通过NET降解促进变形链球菌从嗜中性粒细胞杀死中逃逸；此外在大肠杆菌内deoC蛋白可以发挥作用，在对正常生理状态下的细胞发生细胞凋亡时引起内环境钙离子和镁离子的浓度发生变化，浓度变化可作为引起脱氧核糖核酸内切酶发挥作用^［21-22］，因此认为该基因可能和相关激活信号调节调节生物功能有关^［23-24］。谢晓东等^［25］认为，研究牛支原体表面膜蛋白功能以及用于早期的范围筛查，例如P81蛋白、P48蛋白、P26蛋白等。本研究成功的扩增全长基因，其编码222个氨基酸；与地方株（MJ1株，XBY01株，16M株，08M株，HB0801-P180，150，115株，NM2012株，CQ-W70株）相似性为95.4%，说明该基因在大部分地方株亲缘接近，说明该基因普遍存在，可以应用于蛋白的血清学检测提供基础。

牛支原体武威株deoC基因不存在终止密码子，故设计一对特异性引物完成引物扩增，为方便后续实验中蛋白的纯化，载体选用HIS标签的pET-28a（+）载体来完成基因的表达，表达后经过分析得该蛋白为可溶性表达，大小约为24.2 ku，将重组蛋白进行多次点射免疫新西兰兔得到对抗血清，Western blot 结果显示：重组蛋白deoC抗血清有良好的免疫原性。本研究中，deoC基因具有良好的免疫原性，初步认定可以作为牛支原体疾病早期诊断靶抗原，为治疗筛选抗原库提供依据。

二级结构主要是以a-螺旋和不规则卷曲存在（α-螺旋包含46.85%，16.67%的e-延伸链、7.21%的β－折叠（S）、和29.28%的无规则卷曲（L））其中a-螺旋键能存在于蛋白的二级结构，主要作用是蛋白结构的骨架作用，此外β-折叠和无规则卷曲更灵活的使蛋白结构发生变形，更加利于发生答应，例如暴露更多结合位点使之结合。预测蛋白三级结构与模板相似性为50.92%，另外对模板进一步进行拉曼图分析，结果表明该模型可信度高。本研究显示：预测蛋白存在19 个潜在的磷酸化位点和1 个糖基化位点，表明该蛋白可能参加生物酶活性激活从而参与信号传导与致病机理有着潜在的研究价值。

通过对deoC的亚细胞定位实验得知，在牛支原体细胞膜稍微低于细胞膜，在细胞质和细胞膜上均有分布。研究已经证明该蛋白具有好的免疫原性，但是具体作用机制尚不明确，以及具体过程待进一步研究。对deoC蛋白的理化性质预测：该蛋白属于复合型蛋白，一种偏酸性蛋白（pI理论值为6.45）、稳定的亲水性蛋白。蛋白分子蛋白分子大小约为24.2 ku、分子式C₁₀₇₄H₁₇₄₆N₂₇₆O₃₃₁S₁₃、其中酪氨酸最多（12.2%）、该蛋白体外培养半衰期约为30 h，不存在信号肽序列，不稳定指数是23.42，以上信息都说明该蛋白属于稳定蛋白且不具有信号肽。

4 结论

对牛支原体 deoC 基因纯化表达后获得大小约为24.2 kU的纯化蛋白且具有良好免疫原性，证明蛋白主要分布在牛支原体膜，并通过同源性分析得知该基因序列高度保守，与国内分离株序列同源性为95.4%，具有遗传稳定性，同时获得高效的可溶性重组蛋白，大小约为24.2 kU，融合蛋白免疫新西兰兔，Western blot 结果显示：重组蛋白deoC抗血清与牛支原体全能发生特异性结合。间接ELISA结果表明，deoC蛋白在牛支原体膜上和细胞质中均有分布，且在细胞质中的分布多于在细胞膜，为牛支原体膜相关蛋白。deoC蛋白的生物学信息研究表明：其编码的蛋白不存在存在信号肽和跨膜结构.有19 个潜在的磷酸化位点和1 个糖基化位点.蛋白大小为24.2 kU，由222 个氨基酸（酪氨酸最多12.2%）组成的亲水性蛋白，二级结构是复合型结构组成，并且成功的预测了该蛋白的三级结构和进行拉曼图分析，结果成立。

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基金资助

甘肃农业大学学科建设专项基金(GSAU-XKJS-2018-075)

甘肃省重大专项(21ZD3NA001)

甘肃省科技重大专项计划项目21ZD3NA001