西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定

Identification of Pseudomonas an endophytic bacterium from root nodules of Hippophae thibetana

摘要

目的 获取西藏沙棘根瘤内生菌中具有生物学活性的假单胞菌。 方法 采用细菌纯培养方法，从西藏沙棘根瘤中分离假单胞菌，通过细菌染色镜检、生化试验及16S rDNA基因序列分析等方法进行鉴定，通过生长曲线、耐受性、解磷及固氮能力定性筛选等实验对分离菌株生物学特性进行检测。 结果 分离菌株在YMA培养基上呈白色或乳白色，革兰氏阴性菌，杆状，16S rDNA序列比对结果表明分离株与参考假单胞菌属同源性为99%，命名为QY-X8。QY-X8在pH为5~8、氯化钠浓度0%~2%仍能存活，具有较强的抗逆性，溶解无机磷和有机磷的溶磷圈/菌圈均大于2 mm，具有较好的溶磷能力，但不具有固氮能力。 结论 QY-X8菌株具有较强的耐受性和解磷作用，可为研发生物菌肥提供基础材料。

Abstract

Objective Method To obtain Pseudomonas with biological activity from endophytic bacteria of Hippophae thibetana root nodules. Result The isolated strains were white or milky white on YMA medium,Gram-negative bacteria，rod-shaped，and 16S rDNA sequence alignment showed that the isolated strains had 99% homology with the reference Pseudomonas，named QY-X8.QY-X8 can survive at pH 5~8 and sodium chloride concentration 0%~2%，and has strong stress resistance，and has the ability to dissolve inorganic phosphorus and organic phosphorus simultaneously. The phosphorus dissolving circle/bacteria circle is larger than 2 mm，indicating that it has good phosphorus dissolving ability，but the nitrogen fixing transparent circle can't be detected on the solid medium. Conclusion QY-X8 has strong tolerance and dephosphorization，which can provide basic materials for the research and development of biological bacterial fertilizer.

Graphical abstract

关键词

假单胞菌属 / 西藏沙棘 / 菌种鉴定

Key words

Pseudomonas / Hippophae thibetana / strain identification

沙棘是典型的非豆科结瘤植物，沙棘根瘤是由弗兰克氏菌（Frankia）侵入沙棘根系形成的瘤状结构，具有固氮作用^［1-3］；中国境内主要有中国沙棘（Hippophae rhamnoidoes）、西藏沙棘（Hippophae thibetana）、肋果沙棘（H.neurocarpa）等^［4-5］。

研究表明沙棘根瘤内生菌菌群丰富，并不是单一的弗兰克氏放线菌^［6］，前人用高通量测得215属，纯培养8属^［7］，沙棘根瘤内生菌不仅在菌属数量上丰富，而且功能上也是存在多样性^［8-9］。

假单胞菌属广泛存在于土壤及植物根瘤中，属革兰氏阴性菌，呈杆状或短杆状^［10］。虽然已有从多种植物中分离出具有生防、固氮、解磷、解毒等作用的假单胞菌属的研究报道^［11-12］，但是微生物种群、微生物作用常常因为土壤环境及宿主植物的不同而产生差异^［13］，因此从高海拔、干旱或半干旱等恶劣环境生长的植物根瘤中分离筛选出具有多重作用的假单胞菌属具有重要意义，为后续菌株的产IAA、铁载体等促生性能研究提供材料。

本研究从青海玉树地区西藏沙棘根瘤内生菌中进行假单胞菌的分离、纯化及鉴定，并对菌株的耐受性、解磷及固氮能力进行测定，研究结果将为开发微生物菌肥提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植株

西藏沙棘采自中国青海省玉树藏族自治州治多县加吉博洛镇（E 95.622267，N 33.849483，海拔4 141.75 m），采集生长良好、成熟的植株。

1.1.2 培养基及试剂

YMA培养基^［14］；BTB培养基；MR-VP培养基；解无机磷培养基；解有机磷培养基；阿须贝固氮培养基；革兰氏染液、甲基红试剂及V-P试剂等等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的处理

将采集的西藏沙棘植株连根及根际土一起装到密封袋带回实验室。自来水冲洗后挑选饱满的根瘤经75%乙醇初步灭菌，4 ℃冰箱保存。挑选个大饱满、鲜嫩的根瘤置于超净工作台，用95%乙醇、0.2% HgCl₂对根瘤进行灭菌，最后无菌水冲洗，取冲洗无菌水用于灭菌是否彻底检测，涂布于YMA固体培养基上^［15］。

1.2.2 菌株的分离与纯化

将无菌根瘤用镊子夹破，将挤出液在YMA固体培养基上划线，28 ℃恒温培养2~5 d，在无菌环境下挑取单一菌落的一半进行革兰氏染色镜检。如果菌株不纯可重复进行单菌落划线分离和镜检，直至分纯。

1.2.3 菌株的生理生化测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》^［16］测定分离菌株的生理生化，参考菌株以恶臭假单胞菌为标准，恶臭假单胞菌不产生硫化氢，甲基红和V-P均阴性，革兰氏染色阴性菌，呈短杆状。

1.2.4 16S rDNA基因片段的PCR扩增

提取分离菌株基因组DNA，以16S rDNA基因通用引物27F（5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ）和1492R（5ʹ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ʹ）进行扩增。PCR扩增产物进行电泳检测，将电泳检测长度正确的PCR产物测序送公司测序，将测序结果在NCBI进行对比分析，Megalign构建系统发育树。

1.3 菌株生物学特性研究

1.3.1 生长曲线及产酸能力的测定

将菌液按照3%的接种量接种于YMA液体培养基，在28 ℃，170 r/min恒温振荡培养0至34 h，期间每隔2 h测定菌液D₆₀₀值及相对应的pH值，3次重复。

1.3.2 耐受性测定

耐酸性测定：将分离菌株按3%的接种量接种于pH为3、4、5、6、7、8的YMA液体培养基，氯化钠浓度为0.01%，28 ℃，170 r/min恒温振荡培养24 h，以对应不同pH不接菌为对照，测定不同pH下的菌液D₆₀₀值，3次重复。

耐盐性测定：将分离菌株按3%的接种量接种于氯化钠浓度为0%、0.01%、1%、2%、3%和4% 的YMA液体培养基上，pH=7.0，28 ℃，170 r/min恒温振荡培养24 h，测定不同氯化钠浓度下的菌液D₆₀₀值，3次重复。

1.3.3 解磷、固氮能力定性测定

将菌株接种于YMA液体培养基，28 ℃，170 r/min恒温振荡培养24 h，在打好孔的解无机磷、解有机磷培养基内注入分离菌株20 μL，28 ℃恒温培养4 d，测量透明圈（D）/菌圈（d），按照十字交叉法测定，将接活菌株点接于阿须贝固氮培养基，28 ℃恒温培养4 d，查看是否有菌落生产，3次重复。

1.4 数据分析

测量数据用Excel 2019统计，数据以平均值±标准偏差输入。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态染色特征

将通过划线分离纯化1株西藏沙棘根瘤内生菌的单一菌落进行革兰氏染色，分离株为红色（图1），杆状或短杆状，部分弯曲，属于革兰氏阴性菌，为方便阐述，本文将获得菌株编号为QY-X8。

2.2 分离菌株生理生化测定结果

分离菌株在七叶苷和果糖下呈阳性，在麦芽糖、纤维二糖、乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、菊糖、甘露醇、山梨醇及棉子糖呈阴性，不产生硫化氢，在MR和V-P试验中呈阴性；在BTB培养基上产碱，符合假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的特征，但无法确定到种。

2.3 分离株16S rDNA扩增结果

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示从分离菌株中成功扩增出1 500 bp左右的16S rDNA基因条带，条带单一，符合预期大小（图2）。

2.4 分离菌株16S rDNA同源比对分析

将分离菌株16S rDNA序列与在NCBI上进行Blast分析，挑选出相似度较高的11株对比菌株（图3），结果显示，分离菌株与假单胞菌属（AY131214.1、EF540467.1、KJ482869.1、KT3505 01.1、KY962737.1）同源性为100%。系统进化结果显示分离菌株与Pseudomonas baetica（MZ4562 73.1）为一个进化类群（图4），同源性达99.9%，结合生理生化试验表明，分离菌株为假单胞菌属。

2.5 生长曲线及产酸能力的测定

由图5可见，QY-X8在2 h内处于迟缓期，生长较为缓慢；从2 h到22 h处于对数生长期，生长速度最快；从22 h到28 h处于稳定期，生长速度变慢，28 h后进入衰亡期。从0 h到34 h菌株的培养液pH由6.3持续上升到7.0，提示QY-X8菌株在生长过程中产碱。

2.6 耐受性测定

2.6.1 耐酸性测定

图6为QY-X8在不同pH下的生长变化。由图6可见QY-X8在pH为4~8均可生长，说明菌株具有较广的酸碱适应范围；pH为3时培养24 h的菌株与培养0 h的菌株D₆₀₀值变化不明显，而pH在5~8时二者的生长量差异明显，菌株较适合生长的pH为5~7，其中pH为7时，菌株D₆₀₀值最大。

2.6.2 耐盐性测定

图7为QY-X8在不同氯化钠浓度下的生长变化。由图7可知，QY-X8在氯化钠浓度0%~2%下均可以生长，说明该菌株有较强的耐盐性，在氯化钠浓度为3%~4%时，菌株生长缓慢，不适合QY-X8菌株的增殖培养。

2.6.3 解磷、固氮能力的定性测定

表2显示分离菌株QY-X8具有较强的溶解无机磷和有机磷的能力，在第4 天溶解无机磷和溶解有机磷的D/d的比值分别为2.02 mm和2.27 mm（溶磷圈大小/菌落大小>2mm），表明该菌同时兼具两种生物作用；但是QY-X8未能在阿须贝固氮培养基上生长，表明QY-X8可能没有固氮作用或者固氮作用弱，后续研究需结合定量测定，才能更准确的得出QY-X8的生物作用。

3 讨论

目前对微生物种群的研究主要以高通量测序和纯培养两种方法，高通量测序能够较为全面的揭示菌种数量和分布情况^［17］，而纯培养是获得实体菌株的前提，也是提供开发微生物菌肥所需菌种的基础^［18］。本研究通过纯培养的方式从西藏沙棘根瘤中获得1株QY-X8菌株，通过革兰氏染色、16S rDNA序列分析，表明QY-X8菌株隶属变形菌门中的假单胞菌属，这与之前的研究表明假单胞菌属存在于沙棘根瘤一致^［19］。

假单胞菌属广泛存在于土壤及植物根际中，具有固氮、解磷、解毒、生防及产IAA等生物功能。闫双堆等^［20］从11株可以降解多环芳烃的菌株中筛选出1株具有高效降解能力的假单胞菌属，说明假单胞菌具有解毒功能；郭振华等^［21］从不同时期落叶松根际土壤中利用筛选培养基获得112株固氮菌株，其中假单胞菌属是最为丰富的，表明假单胞菌属有较强的固氮能力；罗兴等^［22］从健康乌头植株中分离出24株高产IAA的内生细菌，分别为假单胞菌属和芽孢杆菌属（Bacillus），表明假单胞菌属具有产IAA的能力；张笑宇等^［23］利用微生物培养联合高通量测序技术研究玉米-烟草轮作和烟草连作，发现连作土壤中根腐病病原菌腐霉属丰富度高，但轮作壤中未出现腐霉属菌，且轮作土壤中拮抗菌假单胞菌高于连作土壤，说明假单胞菌属是重要的生防菌，有着不可替代的生态价值。此外，研究发现，来自矮火绒草不同组织的假单胞菌属均有较强的抑菌、产IAA、溶磷及固氮的功能^［24］，说明假单胞菌具有功能的多样性，且不同植物根际解磷菌存在差异^［25-26］。本研究从青海高海拔地区筛选出1株兼具溶解无机磷（磷酸三钙）和有机磷（卵磷脂）的多重作用菌株，后续可从不同磷源去研究溶磷的多样性。

由上述研究可见假单胞菌在不同植物中均可获得，不同筛选条件能获得具备不同功能的假单胞菌，因此在多条件下筛选多重作用的假单胞菌是研究趋势。植物根际微生物群落结构受植物及土壤养分的影响^［27］，且微生物对植物的促生性及抗逆性都有极大的提高^［28］，基于微生物的众多优良特性及假单胞菌属的普遍功能，本研究从高海拔干旱地区的沙质土壤中采集西藏沙棘根瘤，通过纯培养的方法筛选分离出假单胞菌属QY-X8，该菌具有溶解无机磷和有机磷的能力，并且具有较强的耐酸碱和耐盐性，说明该菌株具有提高植物在极端环境下的耐受性的潜力。上述研究结果为发掘多功能菌株提供了基础材料，而该菌是否有促生性及与沙棘根瘤内生菌中其他种属的相互作用有待进一步的研究。

4 结论

从西藏沙棘根瘤中分离筛选出一株假单胞菌属，该菌具有较强的耐酸和耐盐性，可在广谱环境中生存，经筛选培养基定性鉴定，该菌具有溶解无机磷和有机磷的能力，可为研发微生物菌肥提供基础材料。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31660071)

青海省科技厅项目(2017-ZJ-734)