藏药蓝玉簪龙胆的种子萌发和愈伤繁殖特性

Characteristics of seed germination and callus propagation of Tibetan medicine Gentiana veitchiorum

摘要

目的 为保护蓝玉簪龙胆的种质资源，探索其人工繁育方法。 方法 试验采用浸种和组织培养技术，通过不同培养基和不同激素的筛选，讨论蓝玉簪龙胆种子萌发以及愈伤组织分化的最佳策略。 结果 蓝玉簪龙胆种子在200 mg/L GA₃处理4 h发芽率最高，为44.84%；在不同基本培养基中培养，B5培养基萌发效果最佳，发芽率达53.21%。以B5培养基为基础，向培养基中添加不同浓度的GA₃、NAA和6-BA，得到蓝玉簪龙胆种子萌发的最优培养基为：B5+0.5 mg/L GA₃+1 mg/L^{6-BA，发芽率达66.01%；诱导愈伤组织生长的最适宜培养基为：B5+0.5 mg/L GA₃+0.5 mg/LNAA+0.5 mg/L6-BA，诱导率为34.28%。以愈伤组织生长最适培养基为基础，添加不同浓度6-BA，进一步优化培养基配方，得到最适合蓝玉簪龙胆愈伤组织继代培养的方案：B5+0.5 mg/LGA₃+0.5 mg/LNAA+1 mg/L6-BA。 结论 愈伤组织继代培养方案可以将蓝玉簪龙胆从种子分化成愈伤组织，再分化成幼苗。}

Abstract

Objective The study aimed to explore artificial breeding approaches of the Gentiana veitchiorum in order to protect its germplasm resources. Method The best conditions for seed germination and callus differentiation of G.veitchiorum was determined by using seed soaking and tissue culture techniques and screening of different media and different hormones in the experiment. Result The germination rate of G.veitchiorum seeds was the highest when treated with 200 mg/L GA₃ for 4 h， which was 44.84%.Cultured in different basic media， the seeds had the highest germination rate on B5 medium （i.e.， 53.21%）.With adding different concentrations of GA₃， NAA and 6-BA to basic B5 medium， it was showed that the optimal medium for seed germination of Gentiana veitchii was B5+0.5 mg/L GA₃+1 mg/L 6-BA，on which the seed germination rate was 66.01%.The optimal medium for callus induction was B5+0.5 mg/L GA₃+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，on which the induction rate was 34.28%.Based on the optimal medium for callus growth， the medium formula was further optimized by adding different concentrations of 6-BA，and the most suitable scheme for callus subculture was obtained as follows： B5+0.5 mg/L GA₃+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA. Conclusion The G.veitchiorum seeds can be differentiated into callus，and then into seedlings by using the callus subculture scheme.

Graphical abstract

关键词

蓝玉簪龙胆 / 人工繁育 / 种子萌发 / 愈伤诱导

Key words

G.veitchiorum / artificial breeding / seed germination / callus induction

蓝玉簪龙胆（Gentiana veitchiorum Hemsl.）藏语学名为“邦见温保”，龙胆科龙胆属，是青藏高原特有的多年生草本植物，其花冠形状同“喇叭状”，呈蓝色或深蓝色，极具观赏价值^［1］。蓝玉簪龙胆作为传统的中藏药，因其地上部位的提取物富含类黄酮，生物碱和环烯醚萜苷类等次生代谢产物，而被认为具有清热解毒和清热利胆的功能^［2-3］。现代医学表明它可以用于治疗肝脏黄疸，急性肝病，天花，头痛和呼吸道感染等疾病，并且现以蓝玉簪龙胆为原料的成药产品有龙胆泻肝汤、蓝玉簪龙胆花漱口剂等^［4-7］。因其具有重要的产业价值，对原材料需求逐年上升，但目前获取蓝玉簪龙胆植株仍靠人工采挖，导致产品产量稳定性差，品质层次不齐，同时野生群体稳定性被破坏，进而导致生态系统次生危害激增^［8］。为了缓解蓝玉簪龙胆野生植物资源枯竭，最大限度地满足药品、保健品等生产用原料的需求，本试验通过研究其种子的萌发和愈伤组织的特性，建立人工繁育体系，促进该药用植物资源的永续利用。

由于青藏高原的特殊地理环境因素，导致蓝玉簪龙胆种子体积很小，所以种子内的营养物质也很少，使得真正能够成熟且正常萌发的种子数量十分有限，同时恶劣的气候又使落地种子的活力不断下降，致使蓝玉簪龙胆在自然状态下萌发率极低^［9-10］。组织培养是一种在不受季节变化的影响的前提下，能够提高种子萌发率和快速繁殖植物的一种常用的生物技术手段，不仅可以保存植物的种质资源且能够优化和增强其生物合成^［11］。迄今为止，蓝玉簪龙胆的组织培养只有茎段培养技术的研究^［12］。但茎段的繁殖材料数量有限，植株遗传性状较稳定，无法通过诱变育种进行品种改良。本研究在前人的基础上，拟通过赤霉素处理，探究野生蓝玉簪龙胆种子萌发特性；为进一步提高种子的发芽率，试验将种子接种在不同基础培养基和不同激素配比的培养基中，获取最适合种子萌发和诱导愈伤组织生长的方案；最后对促进愈伤组织生长的方案进行优化，获取促进愈伤组织继代培养的最优方案。试验旨在探究蓝玉簪龙胆种子萌发和愈伤组织生长特性，改进播种繁育技术，以期为蓝玉簪龙胆人工种子的获取和系统开发、多元利用提供技术和理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料用蓝玉簪龙胆种子于2021年9月在青海洮河源国家湿地公园（N 34°32′1″~34°12′25″，E 101°56′20″~102°08′52＂）采集，并将种子储存在牛皮纸袋中，晾晒干燥后保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 赤霉素打破休眠处理

蓝玉簪龙胆种子经白猫漂水消毒20 min，参考刘美茹等的方法将消毒后的种子分别以赤霉素浓度为0、200、300、400 mg/L的溶液和浸泡30 min和4 h处理，随后将不同浓度不同浸泡时间处理组合的种子平铺在有湿滤纸的培养皿中，每个处理设置3次重复^［13］。随后置于光照培养箱（40%的相对湿度，白天25 ℃/16 h；黑夜20 ℃/8 h）中进行常规培养，全程保湿。于7 d后观察种子萌发情况并统计发芽率。

1.2.2 基本培养基的筛选

蓝玉簪龙胆种子经白猫漂水消毒20 min，利用试验1.2.1筛选出的最适合的打破种子休眠赤霉素的方案处理种子，然后接种在5种不同基础培养基上，即1/2 MS培养基、1/4 MS培养基、3/4 MS培养基、MS培养基和B5培养基（MS培养基中微量元素分别为原来的1/2、1/4和3/4，配成1/2MS、1/4MS培和3/4MS培养基。MS和B5培养基配方见表1~2）。每个处理设置3个重复，每个重复做6皿技术重复，每皿30~50粒种子，然后置于光照培养箱（40%的相对湿度，白天25 ℃/16 h；黑夜20 ℃/8 h）中进行常规培养，于培养7 d后观察种子萌发情况并统计蓝玉簪龙胆种子的发芽率。

1.2.3 不同激素浓度对种子发芽和愈伤组织的影响

在试验1.2.2的基础上，将种子接种于添加不同浓度和种类激素配比的培养基中，按表3拟正交试验组合27组处理，每个处理设置3次重复，每个重复接种3皿，于接种后7 d开始观察种子萌发情况，2周后开始观察愈伤生长情况，筛选出蓝玉簪龙胆种子发芽和愈伤组织生长的最优培养基培养配方。

种子发芽率（%）=发芽种子数/总种子数×100%

愈伤组织诱导率（%）=愈伤组织数/总种子数×100%

1.2.4 6-BA对愈伤组织诱导的影响

为促进诱导蓝玉簪龙胆愈伤组织的生长，从试验1.2.3中所选出的诱导蓝玉簪龙胆愈伤组织生长的最优方案的基础上进一步优化，在此培养基上繁育愈伤组织，然后控制GA₃和NAA的激素浓度，添加0.20（C₁处理），0.50（C₂处理），0.70（C₃处理），1.0（C₄处理），1.5（C₅处理），2.0 mg/（C₆处理）的6-BA，以不添加6-BA为对照（CK），每个处理3个重复，每个重复接种3皿愈伤组织。每隔2周测量直径并观察愈伤组织的生长情况，直至第6周，计算愈伤组织直径增长率，筛选出诱导愈伤组织分化的最佳培养基。

愈伤组织总增长量（mm）=M₃-M₀

直径增长率（%）=（M-M₀）/M₀×100%

M₀为初始愈伤组织的直径；M₁，M₂，M₃分别为2周，4周和6周后愈伤组织直径。

1.3 数据分析

本试验利用Excel进行数据的整理和初步计算，利用SPSS 17.0软件进行差异性分析，使用Origin 19.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 GA₃对蓝玉簪龙胆种子萌发的影响

由图1-A可知，外源添加不同浓度GA₃并处理30 min和4 h蓝玉簪龙胆种子，发芽率不同，种子的发芽率随着GA₃的浓度升高和处理时间的延长呈先升高后下降的趋势。对蓝玉簪龙胆而言，添加200 mg/L的GA₃种子的发芽率相较于其他浓度处理显著增高，处理30 min和4 h的发芽率分别为39.57%和44.84%，分别比对照CK提高了25.16%和35.72%。随着浓度超过200 mg/L时，发芽率逐渐降低，在400 mg/L处理30 min时，种子的发芽率低于对照，说明该处理对种子的萌发起到抑制作用。综合考虑：200 mg/L GA₃处理30 min与处理4 h无显著差异，所以选择处理30 min为适合蓝玉簪龙胆种子萌发的条件。

2.2 不同基本培养基对蓝玉簪龙胆种子萌发的影响

如图1-C，在种子发芽的初期，中期和后期，B5培养基种子发芽率最高，幼苗根系长，颜色嫩绿，且长势一致。图1-B所示：蓝玉簪龙胆在B5和1/4 MS培养基中的发芽率相较于其他培养基显著升高，发芽率分别达到了53.20%和47.04%，而在MS培养基中的发芽率最低，为15.16%。所以选用B5培养基进行后续试验。

2.3 不同激素配比对种子萌发和愈伤诱导的影响

正交试验设计结果表明（表4）：影响蓝玉簪龙胆种子发芽率的激素按主次排序为A（GA₃）>C（6-BA）>B（NAA），GA₃浓度是排在第一位的关键原因；从初选的最优水平组合能够看出，最适合种子发芽的激素配比方案为A₂B₁C₃（B5+0.5 mg/L^{GA₃+1 mg/L 6-BA），发芽率达66.01%；影响诱导蓝玉簪龙胆愈伤组织生长的激素按主次排序为C（6-BA）>B（NAA）>A（GA₃），6-BA浓度是排在第一位的关键原因，其次是NAA和GA₃；适合诱导愈伤组织生长的最优水平组合为A₂B₂C₂（B5+0.5 mg/L GA₃+0.5 mg/LNAA+0.5 mg/L6-BA），愈伤诱导率达34.28%。影响发芽率和诱导愈伤组织生长的最优组合均未在表中出现。}

2.4 6-BA对诱导植物愈伤组织分化的影响

细胞分裂素对愈伤组织的增殖和胚性维持起着重要作用^［14］。，为进一步优化促进蓝玉簪龙胆愈伤组织再分化的方案，在试验2.3的结果中筛选出的A₂B₂C₂方案的基础上，控制GA₃和NAA的浓度，添加不同浓度的6-BA，测量愈伤组织的直径大小，结果如图2所示，愈伤组织在各个时期的增长速率有所不同，其中最高的是C₄（GA₃∶NAA∶6-BA=0.5∶0.5∶1），平均速率为30.51%，其次为C₃（GA₃∶NAA∶6-BA=0.5∶0.5∶0.7），为29.92%，比平均生长速率最小的C₆（GA₃∶NAA∶6-BA=0.5∶0.5∶2）提高了8.6%和8.0%。各个处理直径增长量有所差异，处理C₁、C₂、C₃、C₄和C₅的直径总增长量相较于对照CK（GA₃∶NAA∶6-BA=0.5∶0.5∶0）处理均有所提高，但C₆处理有所下降。C₃在6周内愈伤直径增长总量均大于其他处理，其次是C₄，6周增长总量分别为4.29 mm和3.85 mm，比增长量最小的C₆处理分别增长了1.678 mm和1.22 mm。得出：0.7 mg/L的6-BA更有利于促进愈伤组织增殖。

根据图3和表4所示，6周后观察蓝玉簪龙胆愈伤组织生长情况，各个处理有所差异。在6-BA浓度为0.5~1.5 mg/L的范围内，愈伤组织能够分化出小苗，浓度过低分化出较多的叶和根，浓度过高则褐化严重。综合考虑：C₄（B5+0.5 mg/L^{GA₃+0.5 mg/LNAA+1 mg/L6-BA）处理是最适合蓝玉簪龙胆愈伤组织继代培养的方案。}

3 讨论

种子萌发是一个复杂的生理过程，受到多种因素的影响^［15］。周梦春等人研究表明，种子在采用传统的播种方式时发芽率低，而通过组织培养技术可以快速建立繁殖体系，提高种子发芽率^［16］。试验利用组织培养技术手段对蓝玉簪龙胆种子进行培养，诱导其萌发和促进愈伤组织的生长。但自然界中大多数种子都存在休眠，首先打破休眠是促进种子萌发的第一步。GA₃是一种广泛存在的具备高度生理活性的植物生长调节激素，能够打破种子休眠和促进种子萌发^［17］。如：外源GA₃提高了湖北白蜡种子的活力和吸水速率，并通过转录组分析验证了GA₃能够促进白蜡种子的萌发；外源GA₃提高了川黄檗种子的萌发率，同时促进其下胚轴的伸长^［18-19］。在本试验中，蓝玉簪龙胆种子在不同GA₃浓度的溶液中浸种，种子的发芽率有所不同：发芽率随GA₃浓度的升高，呈先升后降的趋势，在200 mg/L时种子发芽率达到峰值，并在处理4 h后发芽率最高，为44.84%。但在400 mg/L处理30 min时，种子的发芽率低于对照，此时GA₃对种子的萌发起到抑制作用，与焦德志等对羊草种子外源施加GA₃，表现出低浓度促进、高浓度抑制的研究结果一致^［20］。其中表现为抑制作用主要原因可能是GA₃浓度过高，导致种子内渗透压降低或者种子对激素的敏感度有关，例如对藜种子外源添加GA时出现负调控，原因是种子的渗透压低，对GA敏感度低^［21］。

不同基本培养基营养成分不同，为筛选出适合蓝玉簪龙胆种子发芽的培养基，试验在B5、MS、1/2 MS、1/4 MS和3/4 MS培养基上播种，结果表明蓝玉簪龙胆在B5培养基上发芽率最高，与传统播种方式相比，发芽率提高到了53.21%，与董雪等人的研究结果一致^［22］。植物的发芽、生长和形态取决于内源和外源生长调节剂之间的调节以及植物激素之间的相互作用^［23］。本试验中以B5为基本培养基，添加GA₃，NAA和6-BA 3种激素，结果表明GA₃在蓝玉簪龙胆种子发芽过程中起到主导作用，能够促进和维持种子发芽，与Simlat等的不同激素处理对甘菊种子萌发的试验中，GA₃对甘菊种子萌发起主导作用的结果一致^［24］。从初选的最优水平组合能够看出，最适合种子发芽的激素配比方案为A₂B₁C₃（GA₃∶NAA∶6-BA=0.5∶0.5∶1），发芽率达66.01%。

为了将蓝玉簪愈伤组织最大化地被诱导，试验进行了添加不同激素筛选培养基。正交试验结果分析显示，6-BA是影响诱导蓝玉簪龙胆愈伤组织生长的主导激素，能够促进愈伤组织生长和发育，且适合诱导愈伤组织生长的最优水平组合为A₂B₂C₂（GA₃∶NAA∶6-BA=0.5∶0.5∶0.5），愈伤诱导率达34.28%。愈伤组织在适宜的条件下可以再分化成根，芽或者完整的植株，所以保护蓝玉簪龙胆种质资源的关键在于愈伤组织可经过增殖培养并再分化发育成再生植株^［25］。6-BA是一种在植物生长的所有阶段都有活性的植物激素，并且是愈伤组织增殖的主要调节剂之一^［26-27］。许多研究证明不同植物诱导愈伤组织增长和分化所需的6-BA浓度不同，如：张雪梅等人研究发现0.5 mg/L的6-BA对铁皮石斛的愈伤组织诱导不定芽效果最好；杨小玲和杨少辉在6-BA对安祖花愈伤组织分化程度及所分化试管苗单苗重的影响试验中发现，0.75 mg/L^{6-BA明显促进愈伤组织增殖与分化［28-29］。为进一步筛选出适合蓝玉簪龙胆愈伤组织再分化培养基配方，在控制GA₃和NAA浓度的基础上，添加7种浓度的6-BA，结果显示，添加0.7 mg/L的6-BA，蓝玉簪龙胆的愈伤组织总直径增长量也最大，明显促进了愈伤组织的增殖；1 mg/L的6-BA愈伤组织平均生长速率最快，而且愈伤组织生长状态最佳，能够分化出小苗，所以诱导愈伤组织再分化最优的培养基配方为：B5+0.5 mg/LGA₃+0.5 mg/LNAA+1 mg/L6-BA，此配方初步证明蓝玉簪龙胆可以由种子分化成愈伤组织，通过继代培养可以再分化成幼苗。}

试验通过分析蓝玉簪龙胆种子发芽特性愈伤组织诱导特性，获得了适合愈伤组织分化成苗的最佳培养基，不仅有利于后期生根诱导，并且可以成为保护蓝玉簪龙胆种植资源的有效手段之一。该试验结合组织培养技术来构建人工繁育体系，为后期结合蓝玉簪龙胆在青海洮河源国家湿地公园原生生境群体特征、生物学特性、药用成分含量比较，探索青海省蓝玉簪龙胆人工繁育-仿生栽培体系提供理论参考和技术支撑。

4 结论

蓝玉簪龙胆种子在赤霉素浓度为200 mg/L，浸种4 h时发芽率最高，为44.84%；蓝玉簪龙胆种子在B₅培养基上萌发和生长效果最好，发芽率达53.21%；正交试验结果表明：蓝玉簪龙胆种子萌发的最优培养基为：B5+0.5 mg/L GA₃+1 mg/L^{6-BA），发芽率达66.01%；诱导愈伤组织生长的最适宜培养基为：B5+0.5 mg/L GA₃+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L6-BA，诱导率为34.28%。蓝玉簪龙胆愈伤组织继代培养最优方案：B5+0.5 mg/LGA₃+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA。}

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基金资助

青海省科技厅基础研究计划(2023-ZJ-982Q)

青海省“昆仑英才科技领军人才”培养项目(青人才字［2022］1号)

2021洮河源国家湿地公园湿地保护与恢复项目(2021-thy-1)

青海大学第五批创新创业工坊(GF-20230002)

青海大学2023年大学生科研训练计划（SRT）项目(SRT202311)

青海大学农牧学院大学生创新创业训练计划项目(2022)