基于HPLC的秦艽药材特征指纹图谱构建及主成分分析

Construction of characteristic fingerprinting and principal component analysis of Gentianae macrophyllae based on HPLC

摘要

目的 HPLC测定23批秦艽样品中3种环烯醚萜苷含量，并结合中药指纹图谱进行相似度评价，同时探究主成分分析。 方法 以收集7个不同产区和4个不同基原的秦艽药材，采用HPLC测定样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷的含量。色谱条件为C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%醋酸（9∶91），检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量为10 μL。另外，结合中药指纹图谱软件进行相似度评价；同时利用10个共有色谱峰的峰面积组成的数据矩阵进行主成分分析。 结果 23批不同产地及不同基原的秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽和小秦艽，马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量分别在0.112%~2.390%，0.079%~2.038%，0.426%~17.314%。马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷三者总含量在0.7146%~19.969%。该试验精密度、稳定性和重复性试验的RSD均≤3.0%，马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷加标平均回收率分别为：97.56%，100.06%，102.12%（RSD<1.0%，n=6）。另外，所有秦艽样品与共有模式下的对照指纹图谱其相似度在0.990~0.999，各批样品相似度较好。最后，根据共有色谱峰的峰面积组成的数据矩阵进行主成分分析，其结果表明，秦艽的2个主成分（PC1和PC2）分别表征了原始变量49.5%和 22.2%的变异信息。 结论 所构建的HPLC检测方法，可用于秦艽药材的含量测定；同时因产地或基原不同，样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷三种成分含量存在一定差异，但三者的谱峰的分离度和响应值较高且为共有峰，因此可确定为秦艽药材指纹特征图谱和主成分分析。

Abstract

Objective The study aimed to determine the contents of three iridoid glycosides in 23 batches of Gentianae Macrophyllae Radix samples by using HPLC and to evaluate the similarity of these samples by using Traditional Chinese Medicine Fingerprint （TCMF） and principal components analysis. Method Samples were collected from 7 different production areas and 4 different origins，and the contents of loganic acid，swertiamarin，and gentiopicroside were determined using HPLC with a C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） and a mobile phase of acetonitrile -0.2% acetic acid （9∶91）.The detection wavelength was 254 nm， flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 25 °C，and injection volume was 10 μl.Traditional Chinese medicine fingerprint software was used to evaluate the similarity，and the data matrix consisting of the peak areas of 10 common chromatographic peaks was used for principal component analysis. Result The results showed that the contents of loganic acid，swertiamarin，and gentiopicroside varied among the 23 batches of Gentiana macrophylla Pall.，G.crassicaulis Duthie ex Burk.，G.straminea Maxim.and G.dahurica Fisch.from different origins and regions，with total contents ranging from 0.714 6% to 19.969%.The RSD of precision，stability，and repeatability of the tests were ≤3.0%，and the average recoveries of loganic acid，swertiamarin，and gentiopicroside were 97.56%，100.06%，and 102.12% （RSD<1.0%，n=6）.The similarity of fingerprints between all G.Macrophyllae Radix samples and the control fingerprints under the common mode was 0.990~0.999，indicating good similarity among all batches.Principal component analysis was used to analyze the data matrix consisting of the peak areas of common chromatographic peaks，and the results showed that the two principal components （PC1 and PC2） of G.Macrophyllae Radix reflected the variation information of 49.5% and 22.2% of the original variables. Conclusion In conclusion，the HPLC detection method established in this study can be used for the determination of medicine contents in G.Macrophyllae.The contents of loganic acid，swertiamarin，and gentiopicroside varied to some extent among samples from different origins or regions，but the resolution and response values of the three peaks were relatively high and they were common peaks，making them suitable as fingerprints for G.Macrophyllae.Principal component analysis can provide useful information on the variation among different batches.

Graphical abstract

关键词

HPLC / 秦艽 / 指纹图谱 / 主成分分析（PCA）

Key words

HPLC / Gentianae macrophyllae Radix / fingerprint / principal component analysis （PCA）

秦艽（Gentianae macrophyllae Radix）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）秦艽组（Sect.Cruciata Gaudin）植物。秦艽始载于《神农本草经》^［1］，别名较多，包括秦爪（《本经》）^［2］、秦胶（《唐本草》）^［3］等。秦艽具有祛风湿，清湿热，退虚热，止痹痛等功效，可用于治疗风湿痹痛，中风后半身不遂，筋脉拘挛，以及骨节酸痛和湿热黄疸等^［4］。《中国药典》（2020年版）规定秦艽药材来源于秦艽G.macrophylla Pall.、麻花秦艽G.straminea Maxim.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽G.dahurica Fisch.的干燥根^［5］。秦艽中化学成分很多，主要包括环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、三萜类、生物碱类等，具有抗炎镇痛、保肝、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、降压等活性^［6］。秦艽中的龙胆苦苷（C₁₆H₂₀O₉）和獐芽菜苦苷（C₁₆H₂₄O₁₀）是抗炎的主要成分，《中国药典》规定含龙胆苦苷和马钱苷酸的总量不得少于2.5%^［5］。龙胆苦苷可增加小鼠毛细血管通透性，还可减轻二甲苯所致的肿胀^［7］。另外，可以缓解大鼠关节肿胀症状^［8］。此外，獐芽菜苦苷也是秦艽中的一种主要成分，其镇痛作用略强于扑热息痛^［9］。目前市场上流通的秦艽商品来源复杂，虽然大多为栽培种，但也有少量野生来源，但是秦艽作为多基原的药材，有时存在基原和产地不明，所以导致成分含量存在一定差异。基于以上情况，本研究采用HPLC对收集的23批秦艽样品构建秦艽特征指纹图谱，通过中药指纹图谱相似度评价系统判定和指认共有峰，结合所有供试样品的主成分分析（principal component analysis，PCA），以及HPLC测定不同基原、不同产地秦艽的峰面积进行聚类分析，探究秦艽药材之间化学成分及含量存在的差异性，以期为秦艽的质量控制和品质评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

紫外分光光度计（TU-1810PC，北京普析通用），高效液相色谱仪（Waters e2695），超声波清洗器（KQ-800KDE，昆山市超声仪器），超纯水系统（H2O BASIC-T，赛多利斯），电子天平（QUINTIX224-1CN，d=0.000 1 g，赛多利斯），鼓风干燥箱（DHG-9240B，上海鸿都电子科技有限公司），超微粉碎机（FW-100，天津泰斯特），C₁₈色谱柱（Shim-pack GIS，4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 试药与材料

马钱苷酸（批号：111865-202005）、獐牙菜苦苷（批号：110785-201404）、龙胆苦苷（批号：110770-201918）均购于中国食品药品鉴定研究院，色谱乙腈（天津光复精细化工研究所），醋酸（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司），甲醇（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。

本试验所收集的23批秦艽药材均采集于新疆、内蒙、青海、甘肃、陕西、四川、云南7个不同产地，经甘肃农业大学农学院陈垣教授鉴定为龙胆科植物秦艽G.macrophylla Pall.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie ex Burk.、麻花秦艽G.straminea Maxim.和小秦艽G.dahurica Fisch.的干燥根。取大小适中的秦艽药材为供试样品，45 ℃干燥，粉碎后过三号药典筛，备用。秦艽药材来源见表1。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%醋酸（9∶91），检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量为10 μL。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密量取马钱苷酸对照品、獐牙菜苦苷对照品和龙胆苦苷对照品混合储备液，用甲醇进行定容，配制成使其浓度分别为0.294 0、0.284 2、0.245 8 mg/mL的对照品混合溶液，保存于4 ℃遮光的冰箱中备用。混合对照品梯度溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，用HPLC进行检测。

1.3.3 供试品溶液的制备

选取23批样品中大小适中的秦艽药材作为供试样品，45 ℃干燥，粉碎，过三号筛，称取供试样品0.5 g，置于150 mL的具塞锥形瓶中，加入80%甲醇20 mL，称定质量，用封口膜封口，设置提取温度为50 ℃，超声功率为720 W，超声频率40 KHz，超声处理30 min，提取2次，冷却后去掉封口膜，再称定质量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀后过滤，取续滤液，将续滤液用0.45 μm滤膜过滤，即得供试品溶液，在4 ℃的冰箱中备用。

1.3.4 线性关系

量取混合对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，按照2.1项下色谱条件依次进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0、12.0 μL，测定其峰面积。分别以各色谱峰的峰面积为纵坐标（Y），以对照品的浓度为横坐标（X）制作标准曲线。保留时间、线性回归方程、相关系数和线性范围见表2。

1.3.5 精密度试验

精密量取秦艽混合对照品溶液，每次进样量10.0 μL，用HPLC测定5次，测定3种对照品的峰面积，计算所得马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷峰面积的RSD分别为0.15%、0.25%和0.28%，结果表明仪器精密度良好。

1.3.6 稳定性试验

精密称取S1号秦艽样品，按照“2.3”项下制备供试品溶液，吸取供试品溶10.0 μL，分别在 0，2，4，6，8，10，12，24、48 h进样并测定其峰面积，同时记录保留时间，所得马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷峰面积的RSD分别为2.95%、2.59%和2.50%，结果表明，秦艽供试品溶液在48 h内稳定。

1.3.7 重复性试验

精密称取S4号秦艽样品6份，每份0.5 g，按照“2.3”项下制备供试品溶液，每次进样量10.0 μL，计算所得样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷的峰面积的RSD值分别为0.38%、0.80%和0.24%，结果表明，此方法重复性良好。

1.3.8 加标回收试验

精密称取S3号秦艽样品0.5 g，共6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL，加80%甲醇定容至10 mL，过0.45 μm微孔滤膜，作为试样；另精密量取该供试品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，再加入“2.2”项下混合对照品溶液1 mL，用80%甲醇定容，过0.45 μm微孔滤膜，作为加标试样。

2 结果与分析

2.1 加标回收试验结果

用HPLC进行检测并计算秦艽药材中环烯醚萜苷类化合物回收率（表3）。

2.2 不同产地秦艽3种成分含量比较

从图1-A得出，马钱苷酸含量在0.38%~2.39%之间波动，从不同产地可以得出：S₇（2.39%，四川若尔盖县）>S₆（1.90%，四川小金县）>S₅（1.75%，四川甘孜县）>S₄（1.75%，新疆玛纳斯）>S₃（1.16%，甘肃陇西县）>S₂（0.98%，内蒙古阿鲁科尔沁旗）>S₁（0.38%，内蒙古杭锦旗）。

獐牙菜苦苷含量在0.52%~2.04%之间波动，从不同产地可以得出：S₂（2.04%，内蒙古阿鲁科尔沁旗）>S₁（0.84%，内蒙古杭锦旗）>S₆（0.74%，四川小金县）>S₅（0.73%，四川甘孜县）>S₇（0.72%，四川若尔盖县）>S₄（0.63%，新疆玛纳斯）>S₃（0.52%，甘肃陇西县）。

龙胆苦苷含量在9.69%~17.31%之间波动，从不同产地可以得出：S₆（17.31%，四川小金县）>S₇（16.86%，四川若尔盖县）>S₅（16.27%，四川甘孜县）>S₄（10.78%，新疆玛纳斯）>S₃（10.26%，甘肃陇西县）>S₁（10.06%，内蒙古杭锦旗）>S₂（9.69%，内蒙古阿鲁科尔沁旗）。

总含量在11.27%~19.97%之间波动，从不同产地可以得出：S₇（19.97%，四川若尔盖县）>S₆（19.95%，四川小金县）>S₅（18.75%，四川甘孜县）>S₄（13.16%，新疆玛纳斯）>S₂（12.72%，内蒙古阿鲁科尔沁旗）>S₃（11.94%，甘肃陇西县）>S₁（11.27%，内蒙古杭锦旗）。

2.3 不同产地粗茎秦艽3种成分含量比较

从图1-B得出，马钱苷酸含量在1.22%~1.88%之间波动，从不同产地可以得出S₁₀（1.88%，云南玉龙县）>马钱苷酸含量：S₉（1.27%，云南玉龙县）>S₈（1.22%，云南玉龙县）。

獐牙菜苦苷含量在1.19%~1.63%之间波动，从不同产地可以得出：S₉（1.63%，云南玉龙县）>S₁₀（1.29%，云南玉龙县）>S₈（1.19%，云南玉龙县）。

龙胆苦苷含量在11.66%~13.46%之间波动，从不同产地可以得出：S₁₀（13.46%，云南玉龙县）>S₉（12.61%，云南玉龙县）>S₈（11.66%，玉龙县）。

总含量在14.08%~16.63%之间波动，从不同产地可以得出：S₁₀（16.63%，云南玉龙县）>S₉（15.51%，云南玉龙县）>S₈（14.08%，云南玉龙县）。

2.4 不同产地麻花秦艽3种成分含量比较

从图1-C得出，马钱苷酸含量在0.14%~1.71%之间波动，从不同产地可以得出：S₁₁（1.71%，内蒙古海拉尔）>S₁₄（1.45%，四川若尔盖）>S₁₃（1.22%，甘肃卓尼县）>S₁₂（0.46%，甘肃玛曲县）>S₁₆（0.21%，青海同仁县）>S₁₅（0.20%，青海同仁）>S₁₇（0.14%，青海同仁县）。

獐牙菜苦苷含量在0.08%~0.56%之间波动，从不同产地可以得出：S₁₄（0.56%，四川若尔盖）>S₁₁（0.43%，内蒙古海拉尔）>S₁₃（0.37%，甘肃卓尼县）>S₁₂（0.25%，甘肃玛曲县）>S₁₅（0.09%，青海同仁县）>S₁₇（0.09%，青海同仁县）>S₁₆（0.08%，青海同仁县）。

龙胆苦苦苷含量在0.43%~9.65%之间波动，从不同产地可以得出：S₁₄（9.65%，四川若尔盖县）>S₁₁（8.43%，内蒙古海拉尔）>S₁₃（8.08%，甘肃卓尼县）>S₁₂（6.35%，甘肃玛曲）>S₁₆（0.66%，青海同仁县）>S₁₇（0.48%，青海同仁县）>S₁₅（0.43%，青海同仁县）。

总含量在0.71%~11.65%之间波动，从不同产地可以得出：S₁₄（11.65%，四川若尔盖县）>S₁₁（10.56%，内蒙古海拉尔）>S₁₃（9.67%，甘肃卓尼县）>S₁₂（7.06%，甘肃玛曲县）>S₁₆（0.94%，青海同仁县）>S₁₅（0.72%，青海同仁县）>S₁₇（0.71%，青海同仁县）。

2.5 不同产地小秦艽3种成分含量比较

从图1-D得出，马钱苷酸含量在0.11%~1.50%之间波动，从不同产地可以得出：S₂₃（1.50%，陕西凤县）>S₁₉（0.19%，内蒙古喀喇沁旗）>S₂₁（0.17%，甘肃徽县）>S₂₀（0.14%，内蒙古鄂托克旗）>S₁₈（0.13%，内蒙古阿拉科尔沁旗县）>S₂₂（0.11%，甘肃两当县）。

獐牙菜苦苷含量在0.86%~1.10%之间波动，从不同产地可以得出：S₂₃（1.10%，陕西凤县）>S₁₉（1.07%，内蒙古喀喇沁旗）>S₁₈（0.93%，内蒙古阿拉科尔沁旗县）>S₂₂（0.88%，甘肃两当县）>S₂₁（0.88%，甘肃徽县）>S₂₀（0.86%，内蒙古鄂托克旗）。

龙胆苦苷含量在5.48%~11.20%之间波动，从不同产地可以得出：S₂₃（11.20%，陕西凤县）>S₁₉（6.70%，内蒙古喀喇沁旗）>S₂₂（6.08%，甘肃两当县）>S₁₈（6.01%，内蒙古阿拉科尔沁旗县）>S₂₁（5.91%，甘肃徽县）>S₂₀（5.48%，内蒙古鄂托克旗）。

总含量在6.48%~13.80%之间波动，从不同产地可以得出：S₂₃（13.80%，陕西凤县）>S₁₉（7.96%，内蒙古喀喇沁旗）>S₁₈（7.08%，内蒙古阿拉科尔沁旗县）>S₂₂（7.07%，甘肃两当县）>S₂₁（6.95%，甘肃徽县）>S₂₀（6.48%，内蒙古鄂托克旗）。

从23批不同产地及不同基原秦艽药材的比较得出，马钱苷酸含量在0.11%~2.39%之间波动，不同基原的秦艽药材中，秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽和小秦艽中马钱苷酸平均含量分别为1.47%、1.46%、0.77%和0.37%。獐牙菜苦苷含量在0.08%~2.04%之间波动，不同基原的秦艽药材中，秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽和小秦艽中獐牙菜苦苷平均含量分别为0.89%、1.37%、0.27%和0.95%。龙胆苦苷含量在0.43%~17.31%之间波动，不同基原的秦艽药材中，秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽和小秦艽中獐牙菜苦苷平均含量分别为13.04%、12.58%、4.87%和6.90%。

马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷三者总含量在0.71%~19.97%之间波动，不同基原的秦艽药材中，秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽和小秦艽中獐牙菜苦苷平均含量分别为15.40%、15.41%、5.90%和8.22%。

2.6 秦艽HPLC指纹图谱的建立

按“3.2.1”项下方法制备23批秦艽供试品溶液，按“3.2.1”项下色谱条件分别进行测定，记录23批秦艽45 min色谱图。将23批秦艽HPLC图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件，按照相应程序设置参数，经过多点校正自动匹配生成秦艽共有模式对照指纹图谱，分析不同供试样品所得指纹图谱，以S1样品色谱图为参照图谱，各供试样品见共确定了12个共有峰，根据混合对照品色谱图，确认了3个共有特征峰，分别为1号马钱苷酸，2号獐牙菜苦苷，3号龙胆苦苷。流动相色谱图、对照品色谱图、供试样品色谱和23批样品指纹图谱见图2（A-C）。

2.7 相似度评价

用“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012版本）软件计算分析，结果见表4。23批秦艽样品的指纹图谱与共有模式下的对照指纹图谱的相似度在0.976~0.999，各批样品相似度较好。1号峰（马钱苷酸）、2号峰（獐牙菜苦苷）和3号峰（龙胆苦苷）各谱峰的分离度和响应值较高且为共有峰，因此确定为秦艽药材指纹特征图谱。以3号峰（龙胆苦苷）为参照峰，计算23批秦艽样品中各共有峰的相对保留时间以及相对峰面积，得出相对保留时间和相对峰面积的差异性较大，表明不同来源秦艽药材的化学组成形似，但是各样品间共有峰成分质量分数存在差异性。

2.8 HPLC测定主成分分析

本研究以所收集的7个不同产区和4个不同基原的秦艽作为研究对象，通过构建 HPLC特征指纹图谱，结合10个共有色谱峰的峰面积，导入软件R studio （v.1.2.5042） 后，组成的数据矩阵进行主成分比较，见图3。其结果表明，秦艽的2个主成分（PC1和PC2）分别表征了原始变量49.5%和 22.2%的变异信息。在分别以PC1为横坐标，PC2为纵坐标绘制得分图中，23批次秦艽样品的分布呈现3种不同的聚集趋势，来自于相同基原或同一产地的样品基本聚集为一体，相反，基原不同或产地相远的样品相聚较远。例如，在 PC1 方向上，S₁₅、S₁₆和S₁₇ 3个样品基本聚集一起，它们均为青海同仁所产的麻花秦艽。当然，有些样品虽然聚集一起，但是不同产地、不同基原相互交叉，情况较为复杂。探究原因，可能与收集的商品秦艽样品来源或鉴定不明等多个因素有关。

2.9 秦艽药材聚类分析结果

为了比较不同产地、不同基原秦艽样品之间的差异，将HPLC测得的23批不同产地和来源的秦艽样品色谱数据处理后导入MetaboAnalyst 5.0软件，根据系统聚类法形成的聚类树状图进行分析^［10-11］。采用Ward法，以平方欧氏距离作为度量标准，见图4。在欧间距离小于5时，样品被分为15组；当欧间距离介于5~10时，样品被分为3组，这3组与秦艽基原和产地具有一定的相关性，但也有秦艽和小秦艽、麻花秦艽和秦艽、以及产地之间相互交叉的情况存在。故以上图分析结果作为秦艽不同基原、不同产地的聚类分析，仅仅说明秦艽药材之间化学成分及含量存在一定差异性。任桂友^［12］等利用双指标分析法（共有峰率和变异峰率）和聚类分析法，对不同产地及品种的秦艽红外指纹图谱进行分析。其鉴别结果与产地及品种一致；4种秦艽可分为3 类，即粗茎秦艽与麻花秦艽为一类，其余各为一类。得出红外光谱指纹图谱结合双指标序列分析法或聚类分析法，可以对两个或多个不同产地及品种的秦艽样品进行方便可靠的鉴别。

本文采用系统聚类法，以平方欧氏距离为度量标准，对23批样品进行分析，其相关性结果显示，样品依据其生物特性或（基原、化学成分、产地等）聚为6个小类（图5），其中由S₁₈、S₁₉、S₂₀、S₉和S₁₂组成聚类的样本数最大，其相关性也较高，提示这5个样本间具有较高的相似性。其它的5个聚类分别为：S₂₂、S₆、S₅和S₂₃；S₁₃、S₄、S₁和S₁₄；S₁₅、S₁₆和S₁₇；S₇、S₈和S₁₀； S₂、S₃、S₁₁和S₂₁。这些聚类热图结果与图4中的树图聚类也基本一致。此外，秦艽作为多基原的药材，不同产地和不同采收期等因素的影响，提示其药材化学物质群特征最大程度区别于其他种类的样品，这与上述研究秦艽主成分分析的结果有一定的差别。特别是，本研究结合秦艽化学成分的差异，间接反映了不同产地和不同基原之间的亲缘关系强弱，并可据此建立 HPLC 指纹图谱用以辅助不同秦艽种类的鉴别分析。

3 讨论

文献报道，徐蕾等在对秦艽药材的不同产地质量差异性研究时，结果表明，秦艽中所含马钱苷酸和龙胆苦苷两者总量在2.56%~12.42%之间波动^［13］。而本试验中，马钱苷酸、獐牙菜苦苷及龙胆苦苷三者总量在0.71%~19.97%范围内波动，通过比较上面文献测定环烯醚萜苷总含量，确定该试验结果较为科学合理。在HPLC流动相洗脱中，通过等度洗脱，不同比例比较出峰时间和成分分离效果，得出乙腈和0.2%醋酸水溶液比例为9∶91，出峰较为满意，因此确定这一流动相配比值。在全波长扫描测试中，结合HPLC谱图进行对比，结果表明，237 nm下基线较为平稳，共有峰数量较多，但是分离度不太直观。结合《中国药典》，最后确定在254 nm处通过试验，基线平稳和出峰多，加之谱峰分离效果较为满意，因此选择254 nm 作为秦艽后续检测波长的测定。以3号峰（龙胆苦苷）作为参照峰时，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积差异性均较为显著，表明不同来源秦艽药材的化学组成相似，但各样品间共有峰成分质量分数存在差异性。

近年来，主成分分析和聚类分析是药材、食品等领域研究的热点。药材的主成分分析（PCA）是一种降维技术，其原理为基于几个具有代表性的综合指标成分代替多个原始变量，从而实现降维观察数据特征，然后进行多元统计分析的一种模式方法^［14-15］。杨澜等^［16］利用主成分分析对其产量及产量构成、抗逆性（抗倒伏指数、抗穗发芽指数）和生态适应性等指标进行综合分析与评价。杨凤仙等^［17］基于1 H-NMR和主成分分析法分类鉴别秦艽，将图谱进行数据处理后，通过聚类分析和PCA，表明该法可以较好地区分不同来源的秦艽药材。张晓灿等^［18］采用高效液相色谱法，建立3种秦艽药材的HPLC指纹图谱，结合化学计量学方法对其品质进行比较；通过聚类分析和主成分分析将17批秦艽药材分成秦艽、小秦艽和粗茎秦艽3类。黄贤亮^［19］利用HPLC法测定18批不同产地野生与栽培秦艽药材的HPLC指纹图谱，建立指纹图谱共有模式，结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）计算相似度，并运用聚类分析（HCA）和最小偏二乘法-判别分析（PLS-DA）对其进行模式识别研究，可有效评价秦艽药材质量以及区分其野生与栽培品。

聚类热图^［20］可通过纵向聚类和横向聚类同时反映样品间和性状间的关系，特别是利用热图颜色的深浅反映样品中相应性状的变化。因此曲别军长等^［19］分析川赤芍根和地上部位中7 种主要化学成分在不同产地中的含量变化，采用聚类热图结果分析，“芍药苷”“氧化芍药苷”和“芍药内酯苷”的含量在川赤芍中存在此消彼长的关系，这与它们能相互生物转化的关系一致，同时也说明它们的总含量在川赤芍中维持着一定的平衡。

于翠翠等^［21］以不同产地芜菁为原料，对其基本营养及功能性成分和抗氧化能力进行测定；采用相关性分析、主成分分析及聚类分析方法对芜菁品质进行综合评价。刘立轩等^［22］研究秦艽药材产地鉴别时，以获得的不同产地秦艽药材的响应值进行主成分分析（PCA）以及判别因子分析（DFA）时得到 PCA分析不能准确地对药材的产地进行区分，而DFA具有较好的准确性。在生产实际中，药材秦艽的质量受地理环境、采收年限、采收季节、加工炮制等诸多因素影响，也因此导致对于秦艽药材的质量控制和品质评价具有一定的难度。但是，目前中药质量评价方法仍然以检测有效成分含量指标为重点，其检测成本较高，而且对于药材的质量评价存在一定片面性。杨东风^［23］等以丹参为例，将有效成分比例的一致性应用到三维多组分评价中药质量中，提出了“三维多组分”中药质量评价都模式，三维是指从有效成分的种类、组分比例和含量3个角度准确评价中药材质量，多组分是指要同时考虑中药中多种成分信息，特别是质量标志物和等效组分群。中药组分比例可以作为中药质量评价的重要指标，相对而言，品种或产地固定的药材，其有效成分比例较为稳定。所以，中药材的质量评价应该注重与生产实际相结合，今后需要通过探究多种评价方法，不同维度、不同层次多个角度相互结合，从而建立药材质量评价体系。

4 结论

综上，本研究通过秦艽指纹图谱和主成分分析和药材测定峰面积的聚类分析等综合手段为秦艽药材的质量评价提供依据，也为今后秦艽药材的质量控制和标准建立提供参考。

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基金资助

2017年中医药公共卫生服务补助专项“全国中药资源普查项目”(财社［2017］66号)

2019年汉中青年科技创新团队课题-秦巴山区药用植物研究团队