青海省辣椒隐症病毒1的鉴定与全基因组序列克隆

Identification and whole genome sequence cloning of pepper cryptic virus-1 in Qinghai Province

摘要

目的 明确青海省辣椒病毒病病原种类，获得乐都长辣椒的辣椒隐症病毒1（Pepper cryptic virus 1，PCV1）分离物的全基因组序列。 方法 2021年6月对青海省辣椒病毒病进行调查并采集疑似病样，对采集的样品分别用通用引物和特异性引物进行RT-PCR检测，后续通过克隆的方法得到PCV1的全基因组序列，用NCBI进行序列比对后用MEGA6.0软件最大似然法（maximum likelihood）、自导复制（bootstrap）1 000次构建系统进化树，并运用同源性分析和聚类分析方法对PCV1的2条RNA链进行分析。 结果 采自乐都区的15份辣椒病样中，确认检出10份感染PCV1，其RNA1和RNA2的全长分别为1 563 bp和1 495 bp。NCBI网站序列比对分析结果表明克隆得到的PCV1青海分离物序列与已报道的PCV1其他分离物的核苷酸序列一致性与氨基酸一致性高于95%。系统发育分析表明RNA1和RNA2分别与其他PCV1分离物聚在一支上，与其同属的辣椒隐症病毒2（pepper cryptic virus 2，PCV2）分离物聚在不同的分支上。 结论 青海省辣椒上检测得到的病毒为PCV1，并获其全基因组序列，对今后保护青海省当地特色辣椒品种资源、不同地区的PCV1基因组遗传方式等研究的相关工作奠定理论基础。

Abstract

Objective The aim of this study was to identify the pathogenic species of pepper virus in Qinghai Province and obtain the whole genome sequence of pepper cryptic virus 1 （PCV1） isolate from Ledu Long Pepper. Method Suspected disease samples of Capsicum were investigated in June 2021 in Qinghai Province. The samples were detected using RT-PCR with universal and specific primers. The whole genome sequence of PCV1 was obtained using the cloning method，and a phylogenetic tree was constructed using MEGA6.0 software Maximum Likelihood and Bootstrap 1000 times after sequence comparison with NCBI.The two RNA strands of PCV1 were analyzed using homology and cluster analysis methods. Result The results showed that of the 15 pepper disease samples collected from Ledu District，10 samples were confirmed to be infected with PCV1，and the total lengths of RNA1 and RNA2 were 1 563 bp and 1 495 bp，respectively. the nucleotide sequence consistency and amino acid consistency between the cloned PCV1 Qinghai isolate and other reported PCV1 isolates were higher than 95% according to the NCBI website sequence comparison analysis. Phylogenetic analysis showed that RNA1 and RNA2 were clustered on one branch with the other PCV1 isolates，respectively，and the same genus of Pepper cryptic virus 2 （PCV2） isolates were clustered on different branches. Conclusion The virus detected on pepper in Qinghai Province was identified as PCV1，and its whole genome sequence was obtained. This study lays a theoretical foundation for future research on the protection of local pepper varieties and the genetic mode of PCV1 genome in different regions in Qinghai Province.

Graphical abstract

关键词

辣椒 / 辣椒隐症病毒1 / 全基因组 / 青海省

Key words

pepper / pepper cryptic virus 1 / whole genome / Qinghai Province

青海省位于青藏高原东北部，辣椒（Capsicum annuum L.）^［1-2］是当地受众度极高的特色蔬菜，风味独特广受欢迎，具有非常好的发展前景。因此，辣椒在青海省内被广泛种植，而乐都长辣椒是其中的知名品种，具有皮薄肉厚、辣味适中、采收期整齐一致、耐贮存等特点。因其外形与猪大肠相似，又被称为“猪大肠”，成为当地地理标志产品^［3］。因上述便于栽培、品质优良且市场认可度高等原因，乐都长辣椒成为了当地农民增收的主栽经济作物。近年来，随着辣椒种植面积持续增加，病毒病的发生也越发频繁。2017年，李廷芳等^［4］在青海省海东市的设施辣椒上检测出辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）；吴淑华等^［5］于2020年在青海省西宁市的设施辣椒上检测出番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）。辣椒病毒病发病周期短，流行速度快，危害逐年加重，导致乐都长辣椒品种退化，出现褶皱消失和香辣味变淡等品质变劣的现象，并造成辣椒的产量降低，阻碍当地辣椒产业的发展^［6］。

辣椒隐症病毒1（pepper cryptic virus 1，PCV1）是1种重要的辣椒病毒，属于双分病毒科（Partitiviridae）丁型双分病毒属（Deltapartitivirus）的1个典型种^［1，7］。继1995年Arancibia等^［8］发现PCV1后，中国、北美及东亚等地陆续出现其侵染辣椒的报道。在我国，PCV1是近年来新出现的病毒，2019年刘勇等^［1］在山东辣椒上检测出PCV1，同年，汤亚飞等^［9］在广东辣椒上检测出PCV1。PCV1有2条dsRNA，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和外壳蛋白（coat protein，CP）^［10-12］。目前没有已知的可以传播PCV1的自然媒介，该病毒不能通过摩擦接种传播，但可以通过种子、花粉（父系）和卵细胞（母系）进行传播^［13-15］。

乐都长辣椒作为青海省地理标志产品，在调研过程中发现部分辣椒无明显发病症状，但产量较低。为进一步明确造成该现象的原因，本研究采集了此类样品的辣椒叶片，并对其进行RT-PCR检测，结果显示部分样品受到PCV1的侵染。基于检测结果，本研究对PCV1基因组全序列进行了克隆与分析，以期为后续开展PCV1相关功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年6月，在青海省海东市乐都区采集无明显症状但产量较低的长辣椒叶片15份，用液氮进行低温速冻处理后放到超低温冰箱-80 ℃保存备用。

1.2 辣椒病叶总RNA的提取

取辣椒病叶0.1 g在液氮中速冻后放入组织破碎仪（Tissue Lyser Ⅱ）中打碎成粉末状。利用Trizol法提取辣椒病叶的总RNA^［16］，将提出的总RNA用20 μL的ddH₂O进行溶解，并用微量核酸测定仪（ND-one 2000 drop）对RNA进行质量检测，所提RNA的D_260nm/D_280nm在1.8~2.0之间，将RNA保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3 cDNA合成

以提取的总RNA为模板，采用Fastking一步法RT-PCR试剂盒（天根生物科技有限公司）合成cDNA。反应体系为20 μL：5xFastKing-RT SuperMix 4 μL；总RNA 2 μL；RNase-Free H₂O 14 μL。反应程序：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。待反应完成后，将cDNA放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 PCV1病毒的RT-PCR检测

根据现有报道的PCV1的特异性引物PCV1dF/PCV1dR ^［17］，以1.3 中cDNA为模板，进行RT-PCR检测^［18］。依次加入试剂：2×TaqMix （天根生物科技有限公司）10 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；cDNA 1 μL；ddH₂O 7 μL。总体系20 μL，反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60.8 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，34个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。反应完成后，取5 μL的PCR产物，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，完成后置于凝胶成像仪观察条带并拍照。

1.5 PCV1全基因组克隆

PCV1的全基因组包含2条单链RNA，分别为RNA1和RNA2。根据辣椒隐症病毒1的基因组序列设计特异性引物PCV1_RNA1-F/PCV1_RNA1-R，PCV1_RNA2-F/PCV1_RNA2-R，并对RNA1和RNA2进行扩增和克隆（表1），获得全基因组的序列。PCR的反应体系为25 μL，其中：5×PrimeSTAR HS Buffer （Mg²⁺ Plus） （北京宝日医生物科技有限公司）5 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；dNTP 2 μL；Prime STAR HS DNA polymerase（北京宝日医生物科技有限公司）0.25 μL；目的条带所相对应的cDNA 1 μL；RNase-Free H₂O 补足至25 μL。反应程序为：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，T_m（退火温度根据上述引物设置）5 s，72 ℃延伸（延伸时间为1 kb/min），34个循环；72 ℃ 10 min。待反应程序完成后，对PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的片段，然后进行凝胶回收与纯化。将回收的产物用pEASY-Blunt载体进行连接，并转化到Trans-T1感受态细胞中（北京全式金生物技术有限公司），挑选3个阳性克隆送到杨凌天奥科技有限公司进行测序。

1.6 序列分析的方法

测序所得到的结果经NCBI进行比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）后用MEGA6.0软件最大似然法（Maximum Likelihood）、自导复制（Bootstrap）1 000次构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 辣椒病样RT-PCR检测

对采集的样本提取总RNA，经过反转录后用PCV1的特异性引物PCV1dF/PCV1dR进行相应的RT-PCR检测，电泳结果显示15份样品中，有10份扩增得到大小约250 bp的条带，与目的条带245 bp大小非常接近（图1）。剩下的5个样品没有扩增到相应的条带。随机抽取3个已经扩增到目的条带的样品，对其进行凝胶回收与纯化，进行克隆转化试验，并送到公司测序，将测序得到的结果在NCBI网站上比对，BLAST结果显示，其与PCV1的氨基酸、核苷酸一致性较高，均为90%~100%。上述结果表明，在青海省海东市乐都区所采集的辣椒病毒病病样中，存在PCV1感染的现象。

2.2 辣椒病样中PCV1全基因组克隆

基于克隆的方法，获得PCV1全基因组序列。以采集的辣椒病样cDNA为模板，分别利用特异性引物PCV1_RNA1-F/PCV1_RNA1-R和PCV1_RNA2-F/PCV1_RNA2-R扩增RNA1和RNA2，获得约1 563 bp和1 495 bp的目的条带。将目的条带回收纯化，并把纯化后的目的片段连接到克隆载体pEASY-Blunt上，并转化至大肠杆菌Trans-T1。放置于光照培养箱，在37 ℃的条件下暗培养8 h，挑选3个阳性克隆送至公司测序。将测序得到的结果用DNAMAN软件进行比对，以此获得了PCV1的全基因组序列，碱基序列如下（图2）。

2.3 PCV1全基因组结构分析

运用DNAMAN软件对PCV1 RNA1和RNA2进行分析，得到PCV1 RNA1和RNA2的全基因组序列。RNA1全长1 563 bp，RNA2全长1 495 bp（图3）。RNA-1编码与基因组复制和表达相关的蛋白RdRp，由93~1 532 bp编码的479个氨基酸组成的。RNA-2编码的CP蛋白，由89~1 327 bp编码的412个氨基酸组成，序列如下（图4）。

2.4 同源性及聚类进化分析

运用同源性分析和聚类分析方法，对已获得的PCV1青海辣椒分离物基因组中的2条RNA链进行分析，结果显示，RNA1与韩国SC10-1（KY923701）和中国PCV1-BB13（KY978589）、JA128（MH782159）、JA145（MH782161）及PCV1-CHN（KX765307）的PCV1分离物核苷酸一致性均为100%，氨基酸一致性较高，均在99%~100%；与美国分离物Jal-01（NC-037095.1）的核苷酸一致性也为100%，氨基酸一致性为99.12%；与墨西哥分离物Chiltepin53（MG542616.1）和Chiltepin54（MG5426 15.1）、危地马拉分离物Chiltepin30（MG542613.1）以及美国分离物Long Red Cayenne（MG542614.1）的氨基酸一致性较高，分别为99.39%、98.90%、98.41%和99.75%。RNA2与韩国SC10-1（KY92 3702）和中国PCV1-BB13（KY978590）、JA128（MH782160）、JA145（MH782162）及PCV1-CHN（KX765306）的PCV1分离物核苷酸一致性均为100%，氨基酸一致性较高，均在99%~100%；与美国分离物Jal-01（NC-037095.1）的核苷酸一致性也为100%，氨基酸一致性为99.02%；与墨西哥分离物Chiltepin53（MG542616.1）和Chiltepin54（MG542 615.1）、危地马拉分离物Chiltepin30（MG542613.1）以及美国分离物Long Red Cayenne（MG542614.1）的核苷酸一致性以及氨基酸一致性均在90%以上，表明其为PCV1的一个分离物（表2）。将PCV1青海分离物与已报道的PCV1以及其同属的分离物进行聚类分析（图5~6），RNA1和RNA2分别与已经报道的PCV1分离物聚在一支，并且与同属的辣椒隐症病毒2（pepper cryptic virus 2，PCV2）聚在不同的支上。上述结果表明，从青海辣椒上分离到的病毒病为PCV1。

3 讨论

本研究于2021年6月对采自青海省乐都区的产量较低的长辣椒样本进行RT-PCR检测，结果发现存在PCV1感染。为进一步明确PCV1青海辣椒分离物的分类地位，运用克隆的方法，获得了RNA1和RNA2的全长序列，分别为1 563 bp和1 495 bp，将获得的序列在NCBI网站上比对，结果显示，PCV1青海分离物与其他分离物的核苷酸一致性为78%~100%，氨基酸一致性为97%~100%，通过系统发育分析结果得知，PCV1青海分离物与其他分离物聚为一个大支，与其他的同属病毒聚在不同的分支上。通过同源性分析与聚类进化分析结果均表明本次实验所得到的分离物为PCV1的一个分离物。

能够侵染辣椒的病毒有70多种，在我国能够侵染辣椒的病毒有30多种，包括黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、蚕豆萎蔫病毒2（broadbean wilt virus 2，BBWV）、辣椒轻微斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）等^［19］，对于青海省辣椒病毒病的报道除了PMMoV和TSWV 2种外，本研究得到的PCV1是首次在青海省的报道。PCV1内含有2个基因组片段，并分别被单独包裹，每个dsRNA包含1个开放阅读框，分别编码RdRp和CP^［20］。PCV1是近年来新发现的1种隐症病毒，其与其他隐症病毒相似，表现症状轻微且难以检测^［21］，通过种子以及花粉在细胞内进行传播，目前没有有效的药剂进行防治，在青海发现的PCV1是否与当地的种子调运有关需进一步调查。

2008年Valverde 和 Gutierrez报道了PCV1的生物学特性^［22］，并通过嫁接试验得知，PCV1不能嫁接到同一辣椒品种的无病毒系上，不能通过机械传播，而是通过父系（花粉）和母系进行传播，鉴于PCV1传播方式为垂直传播，且能与其他病毒复合侵染，因此生产上要注重种子脱毒，例如福尔马林浸种、高锰酸钾浸种等方法。

4 结论

本研究首次获得了青海省乐都长辣椒PCV1分离物的全基因组序列，明确了长辣椒产量表现较低的可能原因，对于今后保护青海省当地特色辣椒品种资源，延缓品种退化提供了技术支撑，为以后对不同地区的PCV1基因组遗传方式等研究的相关工作奠定基础。

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基金资助

青海省国际科技合作项目(2022-HZ-806)