胰岛素对昆虫病原线虫共生菌的影响

Effects of insulin on symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes

摘要

目的 明确胰岛素对昆虫病原线虫共生细菌生长发育的影响，寻找高效开发利用共生菌的途径。 方法 通过固体培养观测菌落生长和液体培养测定细菌生长曲线，探究胰岛素对昆虫病原线虫共生菌生长发育的影响，从而为进一步研究胰岛素对昆虫病原线虫及其共生菌生长发育的影响提供理论依据和技术支持。 结果 在常规涂布法下，不同浓度胰岛素处理组和对照组相比，胰岛素对共生细菌的生长无明显作用，其菌落形态和大小无显著差异。但通过添加浓度为1∶500、1∶5 000胰岛素测量共生细菌生长曲线，并与对照组进行比较，发现胰岛素对两种共生细菌的生长均有促进作用，Xenorhabdus SB0627L共生细菌在对数生长期（6~18 h）表现明显，Photorhabdus SB 0641TY共生菌在平稳期（18~36 h）表现明显，且这种促进作用均表现为：1∶500胰岛素>1∶5 000胰岛素>林格氏液和空白对照。 结论 生长曲线法为测定胰岛素影响昆虫病原线虫共生细菌生长发育的较好方法；胰岛素具有促进供生细菌生长发育的作用，且高浓度胰岛素的促进作用较为明显。不同共生菌的生长规律有所不同，Xenorhabdus SB0627L共生细菌与Photorhabdus SB0641TY共生细菌分别在培养6~18 h与12~24 h时生长最好。

Abstract

Objective To study the effects of insulin on the growth and development of symbiotic bacteria in entomopathogenic nematodes，and to find a way to efficiently develop and use symbiotic bacteria. Method In this study，the effects of insulin on the growth and development of entomopathogenic nematodes and their symbiotic bacteria were investigated by observing the colony growth in solid culture and measuring the bacterial growth curve in liquid culture to provide a theoretical basis and technical support for further studies on the effects of insulin on the growth and development of entomopathogenic nematodes and their symbiotic bacteria. Result Insulin had no significant effect on the growth of symbiotic bacteria，and there was no significant difference in the morphology and size of bacterial colonies in the group treated with different concentrations of insulin compared with the control group.However，by adding insulin at 1∶500 and 1∶5 000 to measure the growth curve of symbiotic bacteria，and comparing with the control group，it was found that insulin promoted the growth of both kinds of symbiotic bacteria，Xenorhabdus SB0627L symbiotic bacteria showed obvious performance in logarithmic growth period of 6~18 h.Photorhabdus SB 0641TY symbiotic bacteria showed significant improvement in the stationary phase （18~36 h），and the promoting effect was 1∶500 insulin >1∶5 000 insulin > Ringer's solution and blank control. Conclusion The growth curve method is a good way to determine the effect of insulin on the growth and development of entomopathogenic nematodes symbiotic bacteria.Insulin has the effect of promoting growth and development，and high concentration of insulin has the most obvious promoting effect.The growth patterns of different symbiotic bacteria were different.Xenorhabdus SB0627L and Photorhabdus SB0641TY symbiotic bacteria grew best at 6~18 h and 12~24 h，respectively.

Graphical abstract

关键词

胰岛素 / 昆虫病原线虫 / 共生细菌 / 生长曲线

Key words

insulin / entomopathogenic nematode / symbiotic bacteria / growth curve

昆虫病原线虫共生菌隶属于肠杆菌科，存在于昆虫病原线虫侵染期幼虫（infected juveniles，IJ）肠道内^［1-3］，在20世纪60年代由Poinar等首次发现，关于它的研究也由此开始^［4］。已有的研究证实，昆虫病原线虫的斯氏线虫属 Steinernema 和异小杆线虫属Heterorhabditis 线虫分别与嗜线虫致病杆菌属Xenorhabdus 和发 光 杆 菌 属 Photorhabdus 细菌形成互惠共生的复合体，共同致死昆虫^［5-6］。对这一复合体研究发现，当线虫携带共生菌进入昆虫体内，共生菌会通过自身分泌的多种代谢产物，将昆虫血腔中的大分子营养物质转化为能被昆虫病原线虫所吸收利用的小分子营养物，同时抑制其他杂菌生长，为昆虫病原线虫的生长发育创造良好的环境^［7-10］。为了探明共生菌代谢产物及其作用，科学家从被线虫侵染致死的寄主昆虫体内分离获得共生菌，对昆虫病原线虫共生菌代谢产物的成分进行了分析。研究发现，致病杆菌属（Xenorhabdus）和发光杆菌属（Photorhabdus）的细菌产生多种具有不同活性的代谢产物，其次级代谢产物具有杀虫、杀螨、杀线虫、抗菌活性以及抗溃疡和抗肿瘤活性^［11-17］。例如共生菌的杀虫毒素对害虫有着极其强烈的致死作用^［18-19］，共生菌产生的具有广泛抑菌活性的抗生素，对许多的植物病原菌甚至人类都有显著的效果^［20-22］，最新研究表明其代谢产物中含有抑制人类肿瘤细胞形成的物质，具有巨大开发应用前景^［23-26］。但是在离体培养的过程中，受培养基、pH、养分等因素影响，共生菌次生代谢产物也随之改变^［27-29］。所以，寻找高效开发利用共生细菌的途径，对生物防治有重要意义，对昆虫病原线虫的利用也有重要意义

胰岛素是一种分子量较小的蛋白质激素，它由胰岛素细胞分泌，通过相关胰岛素信号通路在机体中起作用。在医学上，对胰岛素的研究已有很多突破，尤其是在糖尿病的治疗上；对昆虫体内胰岛素的研究，始于昆虫类胰岛素家蚕素的发现^［30-31］。诸多研究已证实，胰岛素可以调控昆虫的寿命、生长发育、代谢等，这在秀丽隐杆线虫的研究中已相当清晰^［32］。如Blackwell等^［33］的研究发现，胰岛素表达相关基因skn⁃1可调节线虫蛋白质稳态及代谢等功能，在线虫药物性和遗传性延寿中起着关键作用，证明了胰岛素在调节线虫寿命中起重要作用^［33］。而作为与昆虫病原线虫互惠共生的共生菌，胰岛素对其是否有影响？胰岛素对昆虫病原线虫的影响中对共生细菌的影响作用是什么？这都值得我们去探究。

本试验在前期致病力筛选研究的基础上，从本实验室所保存的两种甘肃省致病力较好的线虫Steinernematidae.kraussei 0627L和 Heterorhabditida.brevicaudis 0641TY体内分离出两种共生菌Xenorhabdus SB0627L和Photorhabdus SB 0641TY，通过固体培养观测菌落生长情况和液体培养测定细菌生长曲线，对胰岛素是否影响昆虫病原线虫共生菌进行了初步探究，旨为后续研究胰岛素对昆虫病原线虫、昆虫病原线虫-共生菌复合体的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

NBTB培养基：牛肉汤蛋白胨40 g/L、溴百里酚蓝0.08 g/L、酵母粉5 g/L、琼脂粉15 g/L（共生菌鉴别培养基）。

TSY培养基：胰蛋白胨大豆肉汤40 g/L、酵母提取物5 g/L（共生菌液体培养基）。

LA培养基：牛肉汤蛋白胨8 g/L、六水合氯化镁2 g/L、酵母粉5 g/L、玉米油4 mL、玉米糖浆7 mL（单菌线虫-共生菌营养培养基）。

林格氏液（缓冲液，用于复配胰岛素溶液）：氯化钠8.6 g/L、氯化钾0.3 g/L、氯化钙0.28 g/L。

胰岛素（规格：1 mg/mL，纯度97%）订购于上海生工生物有限公司。

大蜡螟Galleria mellonella三龄幼虫、昆虫病原线虫S.kraussei 0627L和 H.brevicaudis 0641TY品系，由甘肃农业大学生物防治工程实验室保存并提供。

1.2 共生菌的获取

结合前期试验及项目研究结果，挑选致病力及生物学特性较好的两个昆虫病原线虫品系，S.kraussei 0627L和H.brevicaudis 0641TY，分离其共生细菌。先用两种线虫侵染大蜡螟，24~28 h后通过剪掉被线虫侵染的大蜡螟的第二或第三对胸足，获取其体液，将其涂布于NBTB培养基上，待培养基上长出菌体，其中吸收培养基染料且菌体呈绿色的则确定为昆虫病原线虫共生菌。然后选取适合菌落，通过多次分离，得到均匀的单菌落，经鉴定为Xenorhabdus SB 0627L和Photorhabdus SB 0641TY，保存备用。

1.3 菌液的制备

制作TSY液体培养基，挑取上述分离培养得到的两种共生菌单菌落于其中，在180 r/min、28 ℃条件下培养48 h，得到新鲜菌液，保存于4 ℃用于后续试验。

1.4 涂布法

将用林格氏液与胰岛素母液复配好的不同比例的胰岛素溶液1∶500、1∶5 000和对照林格氏液分别吸取相同量（每皿200 μL），涂布于已做好的NBTB平板，以未涂布药品的平板为空白对照，以添加林格氏液的为阴性对照。在28 ℃放置数小时，待给药平板上没有水分后，将两种菌分别接种于已处理好的NBTB平板上，48 h后观察菌落生长情况，比较不同处理菌落形态差异。每处理4重复，整体重复3次。

1.5 生长曲线测定

将胰岛素母液与林格氏液复配，得到1∶500、1∶5 000胰岛素溶液 。制备TSY培养基，将2.2中得到菌液以1%的接种量接到新配制的液体培养基中，再分别加入上述两种比例的胰岛素溶液，以未加胰岛素溶液的处理为对照，以0 h时的不同处理组菌液560 nm波长下吸光值（OD值）为零基准，放入28 ℃、180 r/min的摇床中培养，每隔6 h在同一波长下测OD值，绘制48 h的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 给药平板菌落生长情况对比

在28 ℃培养箱培养，两种菌各处理组都是在48 h后菌落开始生长，添加不同浓度胰岛素的处理组其生长速率与对照组相比无变化。观察两种菌菌落分布，发现与对照组相比，各处理组菌落形态均未发生变化。总之，无论是共生菌Xenorhabdus SB 0627L还是Photorhabdus SB 0641TY，各处理组菌落生长情况与对照组并无明显差异（图1~2）。

2.2 不同浓度胰岛素处理下两种共生菌生长曲线的测定

对Xenorhabdus SB 0627L共生菌绘制生长曲线，结果如图3所示。可以看出，在整个测定周期，4个处理组菌液生长曲线都呈现先上升后平缓的趋势，在0~6 h（延缓期）发育缓慢，在6~24 h（对数生长期）快速生长，在24 h（平稳期）以后则生长速度又开始减缓，符合常规的细菌生长规律。但是不同处理组之间，在不同生长期又有差异。在0~6 h内4个处理组生长曲线相近，OD值变化不明显，未表现出差异。而在6~24 h，4个处理组间生长曲线开始出现变化，其OD值分别为1∶500胰岛素处理组为0.1~1.0，1∶5 000胰岛素处理组为0.1~0.8，林格式液处理组为0.1~0.7，与空白对照接近，且发现此期间添加胰岛素的处理组与对照组存在差异，其中1∶500胰岛素处理组差异显著。而在24 h后，各处理组差异不显著，但1∶500胰岛素处理组生长速率依然最快。

由图4可以看出，在整个测定周期，Photorhabdus SB 0641TY共生菌的生长曲线同样呈现出先上升后平缓的规律，但其整体趋势与共生菌相比存在一定差异，其在0~12 h（延缓期）发育缓慢，在12~30 h（对数生长期）快速生长，在30 h（平稳期）以后则生长速度又开始减缓。同样对比4个处理组生长曲线发现，在0~12 h内4个处理组生长曲线相近，OD值变化不明显，未表现出差异。而在12~30 h，4个处理组间生长曲线开始出现变化，其OD值分别为1∶500胰岛素处理组0.2~1.4，1∶5 000胰岛素处理组0.2~1.2，林格氏液处理组与空白对照为0.2~1.0。发现添加胰岛素的处理组与对照组都有差异，其中以1∶500胰岛素处理组差异显著。而在30 h后，各处理组差异不显著，但1∶500胰岛素处理组生长速率依然最快。

分析两种共生菌Xenorhabdus SB 0627L和Photorhabdus SB 0641TY的生长曲线，虽然它们在最佳生长时间上有差异，即 共生菌Xenorhabdus SB 0627L 6~24 h生长最佳，共生菌Photorhabdus SB 0641TY在12~30 h生长最佳，但都表现为1∶500胰岛素处理组生长最好，且与对照组差异明显。说明胰岛素对两种共生菌生长速率都有促进作用，其中以1∶500胰岛素处理组作用最为明显。

3 讨论

本研究采用了两种方法进行胰岛素对昆虫病原线虫共生细菌生长发育影响的比较，但两种方法所得结果有所差异。初步猜想，其一可能是在涂布的过程中没有考虑到药品与培养基之间比例的关系，导致涂布药品的量不足以表现出明显差异；其二为了避免水分存在对菌落生长造成影响，本试验是将涂布药品的培养基放置了一段时间才接菌，这个过程可能造成了药品的损耗，导致最终结果不理想。而测生长曲线时，药品与菌液是同时添加到液体培养基中，且对药品与培养基进行了比例换算；此外，不同培养基和不同培养基pH对药品也会产生不同影响，这都可能是导致两种方法存在差异的原因。

于峰等^［34］对昆虫病原线虫共生菌的研究中，发现发光杆菌属和致病杆菌属共生菌次生代谢产物种类存在很大差异，如致病杆菌属次生代谢产物种类更多，据此推测本试验中两种共生菌所表现出的差异是否和二者次生代谢产物的不同有关？对共生菌次生代谢产物的影响，也是我们后续实验研究的方向。本试验的研究结果表明，胰岛素对两种共生菌有促进作用，但这种促进作用通过何种途径达到，是否会影响次生代谢产物的合成，这都需要我们后续通过分子手段继续探讨。如韩云飞等^［17］的研究发现致病杆菌属的化合物中，Xcn1（1）可以影响蛋白翻译的过程，用胰岛素作用是否会影响类似过程还需要进一步研究。而昆虫病原线虫共生菌作为与线虫互惠共生的一种细菌，胰岛素对其产生的影响是否进一步影响到线虫？Ghazi等^［35］的研究表明，对胰岛素表达相关基因daf-16沉默，会降低秀丽阴杆线虫的寿命，詹成修等^［36］对崇明拟异小杆线虫的研究中也有同样结果，而对昆虫病原线虫是否有同样的作用，有待深入研究。所以在分子层面探究胰岛素对昆虫病原线虫及其共生菌的影响，对二者后续的开发利用将有着重要意义。

4 结论

本试验选用了两种方法探究胰岛素对共生菌细菌生长发育的影响，通过试验结果的对比，发现常规涂布法下，两种共生细菌在不同浓度胰岛素处理下其生长发育无明显差别，菌落形态、数量也无差异。而通过测定吸光值绘制生长曲线发现，不同浓度胰岛素对两种共生菌的生长发育表现出一定的促进作用。由此可得出，吸光值法测定生长曲线，能清晰的反映出共生菌在不同浓度胰岛素下生长发育的变化，相较涂布法是更为适合的一种方法。

胰岛素对昆虫病原线虫共生细菌的生长发育有明显的促进作用，且不同种之间存在差异。用吸光值法确定了不同浓度的胰岛素对生长发育的影响，通过对两种共生细菌48 h内生长曲线分析可得出：两种共生细菌虽然生长速率有差异，但其总体趋势一致，都呈现先上升后平缓的趋势。将添加了胰岛素的处理组与对照组相比，虽然Xenorhabdus SB 0627L 0627L主要在对数生长期差异表现明显，而Photorhabdus SB 0641TY共生细菌在平稳期前期差异明显，但胰岛素都对其生长发育表现出了促进作用，且这种促进作用都表现为高浓度>低浓度>林格式液和空白对照。

通过对生长曲线的观察，发现两种共生菌生长速率虽然存在差异，但都有相同的生长趋势，尤其是在某一时间段生长最好。通过对两种共生菌不同培养时间的分析，发现二者都有一段最佳生长时间。即培养6~18 h为Xenorhabdus SB 0627L共生菌生长的最佳时期，培养12~24 h为Photorhabdus SB 0641TY生长的最佳时期，同样也是胰岛素促进作用最明显的时间段。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960559)

甘肃省科技计划项目(21JR7RA819)

甘肃农业大学大学生科研训(202213021)

甘肃兴隆山国家级自然保护区第二期综合性科学考察项目