河西地区玉米田棉铃虫对2种Bt蛋白的敏感性监测

Sensitivity of cotton bollworms to two types of Bt proteins in cornfield of Hexi Corridor

摘要

目的 明确河西走廊棉铃虫对玉米Bt蛋白的敏感性，为科学监测棉铃虫的发生危害规律提供科学依据。 方法 饲料表面覆盖毒素法测定了河西走廊嘉峪关（JYG）、酒泉（JQ）、张掖（ZY）、武威（WW）4个棉铃虫地理种群对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性，计算LC₅₀和LC₉₉. 结果 JYG、JQ、ZY和WW种群对Cry1Ab的LC₅₀分别为0.116 2、0.146 0、0.172 1、0.200 4 μg/cm²，LC₉₉分别为7.277 8、6.080 7、97.066 6和27.103 7 μg/cm²；JYG、JQ、ZY和WW地理种群对Cry1Ac的LC₅₀分别为0.105 0、0.255 4、0.017 2和0.045 6 μg/cm²，LC₉₉分别为0.159 8、11.795 3、1.190 4、7.470 9 μg/cm²，其中JQ地理种群对Cry1Ac的LC₅₀值显著高于其他地理种群. 结论 河西走廊玉米棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性较高，暂未对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白产生抗性。但应该持续加强监测，以避免Bt交互抗性产生应用风险.

Abstract

Objective The study aimed to determine the sensitivity of Bt proteins to the corn bollworm of Hexi Corridor，laying a scientific basis for monitoring the occurrence and damage of cotton bollworm. Method The susceptibility of four geographical populations of cotton bollworm in JYG，JQ，ZY，and WW in Hexi Corridor to Cry1Ab and Cry1Ac proteins was determined using Diet-overlay bioassays，and LC₅₀ and LC₉₉ were calculated. Result The results showed that the LC₅₀ of Cry1Ab protein in JYG，JQ，ZY，and WW geographic populations were 0.116 2，0.146 0，0.172 1，and 0.200 4 μg/cm²，respectively，while the LC₉₉ of Cry1Ab were 7.277 8，6.080 7，97.066 6，and 27.103 7 μg/cm²，respectively.The LC₅₀ of Cry1Ac protein in JYG，JQ，ZY，and WW geographic populations were 0.102 5，0.255 4，0.017 2，and 0.045 6 μg/cm²，respectively，while the LC₉₉ of Cry1Ac were 0.159 8，11.793 5，1.190 4，and 7.470 9 μg/cm²，respectively.The LC₅₀ of Cry1Ac in the JQ geographic population was significantly higher than that of other geographic populations. Conclusion In conclusion，the corn bollworm of Hexi Corridor is highly sensitive to Cry1Ab and Cry1Ac proteins，and has not yet developed resistance to them.However，monitoring should be continuously strengthened to avoid the creation of application risks due to cross-resistance.

关键词

河西走廊 / 玉米 / 棉铃虫 / Bt蛋白 / 敏感性

Key words

Hexi Corridor / corn / cotton bollworm / Bt protein / sensitivity

棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）是世界十大植物害虫之一^［1］。该成虫繁殖力强，不仅种间杂交能够产生对寄主适合度更高的种群，提高对逆境的适应性^［2］；而且幼虫寄主范围广泛，取食棉花和玉米等50属170余种作物的繁殖器官^［3］。常常引起棉花蕾铃脱落、玉米果穗“戴帽”、腐烂或霉变等典型症状。全球每年因棉铃虫造成作物经济产量损失巨大^［4］，且为害玉米能够传播黄曲霉毒素与伏马菌素，严重威胁着人类和动物健康^［5］。

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis Berliner）是全球开发转基因作物与杀虫剂、高效防治棉铃虫的一种革兰氏阳性细菌。该菌芽孢形成中产生的伴胞晶体蛋白如Cry1毒素能够通过与受体结合而在昆虫中肠细胞的细胞膜上形成孔道，使中肠细胞的渗透平衡遭到破坏，并最终导致昆虫死亡。Cry1Ab和Cry1Ac蛋白因其与棉铃虫中肠刷状缘膜囊泡体（BBMVs）的特异性结合力强^［6］，早已成为转Bt抗虫作物开发应用的杀虫蛋白。由于Cry1Ab和Cry1Ac蛋白作用位点相同，棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac能够产生交互抗性^［7-10］。伴随Bt棉花的长期广泛种植，棉铃虫对Cry1Ac蛋白的适应性增强，显著降低了Bt棉花的杀虫效能，同时产生的交互抗性对Cry1Ab+玉米构成了潜在威胁，成为持续应用Cry1Ab和Cry1Ac蛋白，跨作物全局化生物防治棉铃虫的关键科学问题。全球监测数据表明，种植Bt棉花与Bt玉米5~15 a后，棉铃虫对Cry1Ac抗性等位基因频率大幅增加^［11］。例如：美洲棉铃虫对Cry1Ac的抗性等位基因频率由2000年的0.43×10^-3升高至2002年的1.36×10^-3，最大抗性比率由1993年的1.2倍上升至2004年的578倍^［12-13］；澳洲棉铃虫对Cry1Ac的抗性等位基因频率由2002年的0.5×10^-3升高到2016年的33.0×10^{-3［14-15］}。相比美澳，中国棉铃虫Cry1Ac抗性水平正在逐年增加^［16-17］，黄河和长江流域的抗性水平较高^［18-20］，西北内陆的抗性水平较低^［21］。

河西走廊是中国“丝绸之路经济带”上农作物种子精品繁育的黄金走廊，为国家粮棉补给和丰产增收发挥着重要作用。然而，随着作物结构调整优化，棉花/玉米比例呈现几何指数减少。2016~2020年间，酒泉、张掖和武威棉花/玉米生产尺度为1∶2、1∶1 600和1∶180^［22］。这种生产尺度为棉铃虫提供了丰富食源和优良栖境，致使棉铃虫灾难性暴发，每年造成作物经济产量损失巨大，尤其是成虫羽化高峰期重叠、交流释放的适合度潜能，使棉铃虫成为玉米的优势害虫^［23-24］。2019年起，国家批准了若干个转Cry1Ab/Cry1Ab+玉米抗虫品种进入西北玉米区生产应用中。开放转Bt玉米在河西走廊地区的种植可能导致现有转Bt棉花上棉铃虫的自然庇护所比例降低，棉铃虫将面临来自转Bt棉花与转Bt玉米的多种蛋白的选择压力。当不明确田间种群抗性水平时，将Bt棉花与Bt玉米规模化种植，转Cry1Ab+玉米的杀虫效能很可能因为转Cry1Ac+棉花的交互抗性流动而有所折损，产生应用风险。因此，亟需开展河西走廊玉米棉铃虫对Bt蛋白的敏感性监测工作。

1 材料与方法

1.1 供试材料

Bt蛋白：5.22 mg/mL Cry1Ab蛋白、4.14mg/mL Cry1Ac蛋白，北京绽诺思特生物科技有限公司生产（http：//www.genralpest.com）。

仪器：eppendorf Multlpette^® M4移液器（艾本德（上海）国际贸易有限公司）；人工气候箱：SANYO MLR-351H。

玉米田棉铃虫地理种群：2021年8月上、中旬分别人工采集嘉峪关新城镇新城村（JYG）、酒泉肃州区总寨镇总寨村（JQ）、甘肃省农业科学院张掖试验场（ZY）、张掖甘州区沙井镇沙井村（ZY）、张掖甘州区党寨镇下寨村（ZY）、武威凉州区吴家井镇农场村（WW）、武威凉州区清源镇清源村（WW）和武威凉州区永昌镇白云村（WW）玉米田中包裹5~6龄幼虫的玉米雌穗≥500个，迅速运回室内剥去苞叶、挑选虫龄相对一致的高龄幼虫，单头放入装有10 g人工饲料的料杯、放入30孔塑料托盘中，（26±1）℃、RH（70±10）%和光周期16L∶8D气候箱内培养，每日检查更换饲料直至化蛹，鉴别雌雄后，每个地区种群分别按20♀×20♂等量混合配对法交配产卵，（26±1）℃、RH（70±10）%和光周期16L∶8D气候箱饲养，孵化的初孵幼虫根据采集地点命名为JYG、JQ、ZY和WW种群，备用。

生测平板：参考梁革梅等^［26］改进的饲料配方。试验前先将15 g白糖加入160 mL 50 ℃温水溶化，加入60 g玉米粉、30 g黄豆粉、27 g酵母粉混匀，再加入KOH溶液5 mL、10%甲醛溶液4.5 mL和6%乙酸溶液12 mL拌匀至糊状；然后，再将5 g琼脂粉、0.55 g山梨酸和0.55 g对羟基苯甲酸甲酯加入到250 mL开水中轻煮2 min，倒入面糊中混匀；最后，依次加入1.9 g抗坏血酸、4.5 mL维生素复合液、0.75 g金霉素眼膏和0.2 mL0.1%噻菌灵，混匀制备成液态饲料，65 ℃水浴保温备用。

1.2 试验方法

生测方法采用饲料表面覆盖毒素法^［26］。首先，用无菌注射器吸取液态饲料、每孔注入0.75 mL至24孔板冷却后，制备成24孔生测平板饲料；然后，用灭菌水将5.22 mg/mL Cry1Ab和4.14 mg/mL Cry1Ac母液由高到低稀释成浓度为3.16、1.00、0.316、0.10、0.0316、0.01 μg/mL的溶液，以等量灭菌水为空白对照；其次，用M4移液器2.5 mL量程，调到50 μL×50次档位，由低到高顺序吸取各浓度Cry1Ab和Cry1Ac溶液、单穴滴定50 μL至24孔生测平板饲料上，自然阴干制备成空白对照（CK）和0.01、0.031 6、0.10、0.316、1.00、 3.16 μg/mL的带毒饲料，每种蛋白的每个浓度各滴定4个24孔板，即每个处理4次重复，需接种96头幼虫；最后，毛笔轻挑JYG、JQ、ZY和WW种群的初孵幼虫，接种于上述空白对照和带毒饲料平板上，每孔接入1头幼虫，加盖装有吹塑纸的盖子，防治幼虫逃跑，用橡皮筋十字交叉法系紧后，置于（26±1）℃、RH（70±10）%和光周期16L∶8D的气候箱饲养7 d后，检查记载存活的幼虫数量，分别计算LC₅₀与LC₉₉。

1.3 数据分析

Microsoft Office Excel 2010计算河西走廊玉米棉铃虫JYG、JQ、ZY和WW种群对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的死亡率和校正死亡率，DPS数据处理系统V 9.50软件的数量型数据机值分析法，计算JYG、JQ、ZY和WW种群对Cry1Ab和Cry1Ac的蛋白的LC₅₀和LC₉₉及95%置信区间。

2 结果与分析

2.1 棉铃虫对Cry1Ab蛋白的敏感性

由表1表明，河西走廊玉米棉铃虫JYG、JQ、ZY和WW地理种群对Cry1Ab蛋白的LC₅₀值分别为0.116 2（0.066 0~0.204 7）、0.146 0（0.092 3~0.230 9）、0.172 1（0.085 4~0.347 1）、0.200 4（0.146 5~0.274 1），LC₉₉值分别为7.277 8（2.235 5~23.692 8）、6.080 7（2.382 4~15.519 8）、97.066 6（9.274 5~1 015.901）、27.103 7 μg/cm²（11.513 1~63.806 5）。LC₅₀值高低顺序依次为WW>ZY>JQ>JYG，LC₉₉值高低顺序依次均为ZY>WW>JYG>JQ。

2.2 棉铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感性

结果表明（表2），河西走廊玉米棉铃虫JYG、JQ、ZY和WW地理种群对Cry1Ac蛋白的LC₅₀分别为0.105 0（0.002 2~0.051 2）、0.255 4（0.166 0~0.393 0）、0.017 2 μg/cm²（0.008 7~0.034 0）、0.045 6 μg/cm²（0.035 5~0.061 0），LC₉₉分别为0.159 8（0.064 4~0.396 4）、11.795 3（4.357 4~31.929 4）、1.190 4（0.645 9~2.194 1）、7.470 9 μg/cm²（4.623 2~12.072 4）。LC₅₀值高低顺序依次为JQ>WW>ZY>JYG，LC₉₉值高低顺序依次均为ZY>WW>JYG>JQ。其中JQ地理种群的LC₅₀值显著高于其他3个地理种群。

3 讨论

棉铃虫对Bt蛋白的敏感性直接影响着转Bt作物的防治效果，事关应用转Bt作物控制棉铃虫的全局。本研究首次发现：河西走廊玉米地发生的棉铃虫对Cry1Ab蛋白的LC₅₀值范围在0.116 2~0.200 4 μg/cm²之间，LC₉₉值范围在6.080 7~97.066 6 μg/cm²之间；对Cry1Ac蛋白的LC₅₀值范围在0.010 5~0.255 4 μg/cm²之间，对Cry1Ac蛋白的LC₉₉值在0.159 8~11.795 3 μg/cm²之间。近年来对国内各棉区棉铃虫的抗性发展情况报道不少，其中黄河流域和长江流域棉区棉铃虫对Bt蛋白的抗性水平较高^［17-19］，而西北内陆棉区棉铃虫对Bt的抗性水平较低^［21］，例如2004~2005年陈海燕等测定的河南、河北和新疆采集的棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的LC₅₀值范围为河南地理种群：0.197~0.131 μg/cm²，河北地理种群：0.066~0.106 μg/cm²，新疆地里种群：0.025~0.029 μg/cm²；2007~2009年张洋等测定的河北、河南和山东的棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的LC₅₀值范围为河北地理种群：0.467~0.509 μg/cm²，河南地理种群：0.209~0.314 μg/cm²，山东地理种群：0.224~0.258 μg/cm²；2012年潘利东等测定了河北、湖北和安徽棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的LC₅₀值范围为河北邱县地理种群：14.38 μg/cm²，湖北枣阳地理种群：6.94 μg/cm²，湖北枣阳荆州地理种群：5.89 μg/cm²，安徽地理种群：3.64 μg/cm²；2014年刘艳^［27］测定了北疆棉花种植区棉铃虫对Cry1Ac毒蛋白的LC₅₀范围为1.22~7.31 μg/cm²。本研究对河西走廊制种基地棉铃虫各地理种群的敏感性检测结果中LC₅₀值最高在0.25左右，与2004~2005年河南、河北，2007~2009年河南地、山东等地的检测结果相接近，说明河西走廊玉米棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性较高，尤其对Cry1Ac蛋白的敏感性高于Cry1Ab蛋白。

此外，由于Cry1Ab和Cry1Ac作用位点相同，且Cry1Ac蛋白与BBMVs的结合力强于Cry1Ab蛋白，促使棉铃虫易对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白产生交互抗性。例如：Cry1Ac单边筛选5代、11代、28代和210代后，棉铃虫对Cry1Ac蛋白的抗性增加13倍、123倍、564倍和606倍，同时对Cry1Ab蛋白的抗性增加5倍、46倍、48倍和100倍^［7-10］。此类研究表明，棉铃虫若对Cry1Ac产生抗性，必对Cry1Ab产生交互抗性。本次研究测定的棉铃虫敏感性水平较高，尚未发现河西地区棉铃虫种群对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白存在明显的交互抗性的现象，但测定结果显示，WW和JQ地理种群对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白产生抗性的风险性较高，因此应该持续加强监测，以避免Bt交互抗性产生应用风险。

4 结论

河西走廊地区棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性水平较高，且对Cry1Ac蛋白的敏感性高于Cry1Ab蛋白，尚未发现存在交互抗性的现象，因此在河西走廊地区应用转Cry1Ab+或转Cry1Ac+基因的作物防治棉铃虫，暂无防效折损风险。但是应该持续加强监测，进一步明确田间种群抗性的发展情况及趋势，以避免Bt交互抗性产生应用风险。

参考文献

[1] Willis K J.State of the World’s Plants.Royal Botanic Gardens Kew，2017.

[2] Leite N A， Corrêa A S， Alves-Pereira A，et al.Cross-species amplification and polymorphism of microsatellite loci in Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea （Lepidoptera：Noctuidae） in Brazilian cropping systems ［J］.Genetics and Molecular Research：GMR，2016，15（2）：1-12.

[3] Zhang S， Gu S H， Ni X Z，et al.Genome Size Reversely Correlates with Host Plant Range in Helicoverpa Species ［J］.Frontiers in Physiology，2019，10（29）：1-10.

[4] Archer T L， Bynum E D.Corn earworm （Lepidoptera：Noctuidae） damage at various kernel development stages on food maize ［J］.Crop Protection，1998，17（9）：691-695.

[5] Chalivendra S， Huang F， Busman M，et al.Low aflatoxin levels in Aspergillus flavus-resistant maize are correlated with increased corn earworm damage and enhanced seed fumonisin ［J］.Frontiers in plant science，2020，11：1-11.

[6] Adang M J， Crickmore N， Jurat-Fuentes JL.Diversity of Bacillus thuringiensis crystal toxins and mechanism of action ［J］.Advances in Insect Physiology，2014，47：39-87.

[7] Xu X J， Yu L Y， Wu Y D.Disruption of a cadherin gene associated with resistance to Cry1Ac δ-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71（2）：948-954.

[8] Shanmugam P S， Balagurunathan R， Sathiah N，et al.Inheritance and cross-resistance of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein Cry1Ac resistance in cotton bollworm Helicoverpa armigera Hübner population from Tamil Nadu，India ［J］.Journal of Pest Science，2007，80（3）： 175-181.

[9] Anilkumar K J， Rodrigo-Simn A，Fe.rr J，et al.Production and characterization of Bacillus thuringiensis Cry1Ac-resistant cotton bollworm Helicoverpa zea （Boddie） ［J］.Applied & Environmental Microbiology，2008，74（2）：462-469.

[10] 刘臣，张丹丹，王泽宇，等.棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性及交互抗性研究［J］.应用昆虫学报，2018，55（1）：55-60.

[11] Tabashnik B E， Gassmann A J， Crowder D W，et al.Insect resistance to Bt crops：evidence versus theory ［J］.Nature Biotechnology，2008，26（2）：199-202.

[12] Burd A D， Gould F， Bradley J R，et al.Estimated frequency of nonrecessive Bt resistance genes in bollworm，Helicoverpa zea （Boddie） （Lepidoptera：Noctuidae） in Eastern North Carolina ［J］.Journal of Economic Entomology，2003，96（1）：137-142.

[13] Ali M I， Luttrell R G， Young S Y.Susceptibilities of Helicoverpa zea and Heliothis virescens （Lepidoptera：Noctuidae） populations to Cry1Ac insecticidal protein ［J］.Journal of Economic Entomology，2006，99（1）：164-175.

[14] Downes S， Parker T L， Mahon R J.Frequency of alleles conferring resistance to the Bacillus thuringiensis toxins Cry1Ac and Cry2Ab in Australian populations of Helicoverpa punctigera （Lepidoptera：Noctuidae） from 2002 to 2006 ［J］.Journal of Economic Entomology，2009，102（2）：733-742.

[15] Walsh T， James B， Chakroun M，et al.Isolating，characterizing and identifying a Cry1Ac resistance mutation in field populations of Helicoverpa punctigera ［J］.Scientific Reports，2018，2626（8）：1-9.

[16] Liu F Y， Xu Z P， Zhu Y C.Evidence of field-evolved resistance to Cry1Ac-expressing Bt cotton in Helicoverpa armigera （Lepidoptera：Noctuidae）in northern China ［J］.Pest Management Science，2010，66（2）：155-161.

[17] Gao Y L， An J J， Liu C X.Monitoring of Bt resistance from field-collected Helicoverpa armigera populations in Northern China［J］.Southwestern Entomologist，2010，35（3）：399-402.

[18] 陈海燕，杨亦桦，吴益东，等.棉铃虫田间种群Bt毒素Cry1Ac抗性基因频率的估算［J］.昆虫学报，2007，50（1）：25-30.

[19] 张洋，张帅，崔金杰.黄河流域田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性监测［J］.棉花学报，2010，22（4）：297-303.

[20] 刘标，方志翔，徐文华，等.盐城棉区棉铃虫田间种群对Bt蛋白的抗性基因频率［J］.生物安全学报，2014，23（4）：253-255.

[21] 王冬梅，李海强，丁瑞丰，等.新疆地区棉铃虫自然种群对Bt棉的抗性频率监测［J］.植物保护学报，2012，39（6）：518-522.

[22] 甘肃发展年鉴委员会.甘肃发展年鉴［M］.2016-2020.

[23] 袁伟宁，郭建国，张新瑞，等.河西地区玉米田棉铃虫发生规律及其化学防治技术［J］.植物保护，2018，44（4）：177-182.

[24] 张宣，罗进仓，李怡萍，等.河西走廊棉田主要害虫发生动态及植物源杀虫剂防治技术［J］.植物保护学报，2021，48（5）：1125-1138.

[25] 梁革梅，谭维嘉，郭予元.人工饲养棉铃虫技术的改进［J］.植物保护，1999，25（2）：15-17.

[26] Leite N A， Pereira R M， Durigan M R，et al.Susceptibility of brazilian populations of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea （Lepidoptera：Noctuidae） to Vip3Aa20［J］.Journal of Economic Entomology，2018，111（1）：399-404.

[27] 刘艳.新疆北部地区棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Ab的抗性监测及亚洲玉米螟对Cry1Ab敏感性的测定［D］.石河子：石河子大学，2014.

基金资助

甘肃省科学技术厅重点研发计划项目(20YF8NA108)

嘉峪关市科学技术局重点研发计划项目(21-21)

甘肃省农业科学院农业科技创新专项(2019GAAS26)