⁶⁰Co-γ辐射对北美红花七叶树的诱变效应

The mutation induction effect of ⁶⁰Co-γ ray radiation on Aesculus pavia

摘要

目的 为探讨⁶⁰Co-γ射线对北美红花七叶树种子的诱变效应并确定其辐射半致死剂量。 方法 以北美红花七叶树种子为试材，采用不同辐照剂量（0、100、200、300、400 Gy）⁶⁰Co-γ进行辐射处理，分析辐射对北美红花七叶树种子出苗及幼苗生长的影响。 结果 辐照剂量与种子相对出苗率为极显著负相关，种子辐射半致死剂量为217.76 Gy。辐射后幼苗出现叶型改变、叶面扭曲、叶边缘变异等，300 Gy剂量下叶型和叶边缘变异比例最高。辐射处理的北美红花七叶树生长性状与对照差异不显著。随着⁶⁰Co-γ射线辐照剂量的增加，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，叶绿素及类胡萝卜素含量均呈现先升高后下降的趋势，抗氧化酶活性在300 Gy最高。相关性分析得出，辐照剂量与复叶宽、小叶宽、可溶性蛋白、相对电导率存在显著相关性。 结论 综合种子半致死剂量和生长、生理指标，确定北美红花七叶树种子适宜的辐照剂量为200~300 Gy。可为七叶树属植物辐射育种提供科学参考。

Abstract

Objective The study aimed to investigate mutagenic effect of ⁶⁰Co-γ radiation on seeds of Aesculus pavia and to determine the semi-lethal dose of radiation. Method Seeds of A.pavia were treated with different doses of ⁶⁰Co-γ rays （i.e.，0，100，200，300，400 Gy） to assess the effects of radiation on emergence rate and seedling growth. Result The results showed that there was a significant negative correlation between radiation dose and relative seeding emergence rate，with the seed radiation semi-lethal dose （LD₅₀） being 217.76 Gy.After radiation，the leaves of the plant exhibited leaf shape changes，twisted leaf blades，and variable leaf margins，with the highest variation proportion for leaf shape and leaf margins observed at 300 Gy.However，there were no significant differences in growth traits of A.pavia between the radiation treatment and the control.Furthermore，the antioxidant enzyme activities （SOD，POD，CAT），chlorophyll and carotenoid contents showed a trend of increasing and then decreasing with increasing doses of ⁶⁰Co-γ radiation，with the highest antioxidant enzyme activities observed at 300 Gy.Correlation analysis showed significant correlations between irradiation dose and compound leaf width， leaflet width， soluble protein，and relative electric conductivity （REC）. Conclusion Based on the semi-lethal dose of seeds and physiological indexes of seedlings，the study suggests that the suitable radiation dose for A.pavia is 200~300 Gy，which can provide scientific reference for radiation mutation breeding of Aesculus.

Graphical abstract

关键词

⁶⁰Co-γ射线 / 北美红花七叶树 / 辐射诱变 / 半致死剂量 / 抗氧化酶

Key words

⁶⁰Co-γ radiation / Aesculus pavia / radiation induced / semi-lethal dose / antioxidant enzyme

七叶树属（Aesculus）为无患子目七叶树科植被（Hippocastanaceae），世界约有30个种，主要分布在欧洲、美洲及亚洲^［1］。北美红花七叶树（Aesculus pavia）为七叶树属落叶小乔木或灌木，原产于北美洲，树皮呈灰褐色，掌状复叶，小叶5~7枚，花序为红色圆锥形，小花4瓣（2个长柄勺状花瓣和2个宽的侧面花瓣），果实近圆形。该树种生长速度中等，耐阴，适宜在温暖、湿润的环境生长，在中国黄河流域及东部各地都有引种栽培，具有重要的观赏及药用价值。

辐射育种是利用物理因素（如射线、电子束）诱导植物遗传物质发生突变而产生新种质的方法，具有诱变成功率高、突变谱广、育种周期短等特点^［2-3］，被广泛应用于农作物^［4］、果树^［5-6］、观赏植物^［7-9］、药用植物^［10］及林木^［11］上。辐射常用的诱变源包括可电离辐射源（γ、X、β等射线源和中子、电子束）和非电离辐射源（重离子束、激光和紫外线），据统计利用γ和X射线成功诱变的品种占注册品种总数的70%以上^［12-13］，γ射线又以⁶⁰Co-γ应用最为普遍。研究表明，γ射线能刺激植物细胞组织生长，促进生理生化反应，从而影响植物生长发育^［14］。在辐射育种中，诱变材料的选择非常关键，需要选择综合性能好，适应环境强的作为诱变材料。诱变材料非常广泛，分为植株、种子、无性繁殖器官、花粉、子房、单细胞、胚状体、愈伤组织等，以种子应用最多^［4，15］。

北美红花七叶树引种到国内栽培已有几十年，种质资源相对单一，且辐射育种在北美红花七叶树上的研究未见报道，因此本研究采用⁶⁰Co-γ对北美红花七叶树种子进行辐射处理，探索其种子半致死剂量及幼苗的变异情况，旨在为提升北美红花七叶树辐射诱变效率，丰富七叶树属种质资源及选育北美红花七叶树新品种打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年10月在山东省潍坊市采集健康、成熟的北美红花七叶树种子，进行层积沙藏贮存。当年12月于山东泉港辐射科技发展有限公司对北美红花七叶树种子进行⁶⁰Co-γ辐射处理，剂量率为5 Gy/min。试验设0（CK）、100、200、300、400 Gy剂量梯度，对应辐照时间为0、20、40、60、80 min，每个剂量辐射20粒种子，3次重复。辐射后的种子播种在费县国有大青山林场温室育苗圃的营养钵中。育苗基质为园土∶珍珠岩∶草炭土∶蛭石，体积比10∶5∶4∶1，常规育苗水肥管理。

1.2 试验方法

1.2.1 出苗率统计

定期观察北美红花七叶树种子出苗情况，统计90 d内出苗的种子数占比来计算出苗率。

出苗率=\frac{\mathrm{90}\mathrm{d}\mathrm{内出}\mathrm{苗种}\mathrm{子数}}{\mathrm{辐射}\mathrm{种子}\mathrm{数}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

相对出苗率=\frac{\mathrm{辐射}\mathrm{种子}\mathrm{出苗}\mathrm{率}}{\mathrm{对照}\mathrm{种子}\mathrm{出苗}\mathrm{率}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.2 半致死剂量计算

参考周小梅等^［16］的方法，以辐照剂量x为自变量，不同剂量下种子相对出苗率y为因变量，利用SPSS 20.0得出直线回归方程y=a+bx，计算北美七叶树种子的半致死剂量（LD₅₀）。

1.2.3 叶片形态统计

观察北美红花七叶树成活植株叶片形态变异情况，计算发生叶片变异的植株比例。

叶片变异植株比例=\frac{\mathrm{发生}\mathrm{变异}\mathrm{叶片}\mathrm{的植}\mathrm{株数}}{\mathrm{统计}\mathrm{植株}\mathrm{数量}}×100%

1.2.4 生长性状测定

调查测量辐射诱变北美红花七叶树的株高、地径、复叶长和宽、叶柄长、小叶长和宽、小叶叶脉数等生长性状。

1.2.5 生理指标测定

每个辐射剂量处理随机挑取北美红花七叶树幼苗3株，每株采集不同部位的3片小叶。采用NBT光还原法测定超氧化物歧化酶活力，愈创木酚比色法测定过氧化物酶活力^［17］；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶活，硫代巴比妥酸显色（TBA）法测定丙二醛含量，考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质量分数，乙醇萃取法测定叶绿素及胡萝卜素质量分数^［18］；电导率采用梅特勒FE30-FiveEasy电导率仪测定。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0进行多重比较、相关性及回归分析，利用Microsoft Office Excel 2017进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 辐射诱变对北美红花七叶树出苗的影响

出苗率可体现出种子发芽并能正常破土生长的能力，是种子活力的直接表现。不同辐照剂量处理对北美红花七叶树出苗率具有不同程度的影响。从表1可以看出，随着辐照剂量的增加，种子出苗率降低，与辐照剂量成负相关，这与辐射会使种胚组织受到伤害，抑制细胞分裂和生长，影响萌发过程中的生理活动有关^［19］。辐照剂量和种子相对出苗率相关性分析表明两者为显著负相关，相关系数r为-0.957（表2）。

2.2 辐射半致死剂量

通过辐照剂量与北美红花七叶树种子相对出苗率线性回归方程可得出（表3），回归系数b=-0.273，截距（常量）a=109.450，其直线回归方程为：y=109.450-0.273x（y为种子相对出苗率，x为辐照剂量）。从直线回归方程可以计算出，当y=50时，x=217.76，即北美红花七叶树种子的半致死剂量LD₅₀=217.76 Gy。另外，表3中回归系数b的检验统计量t值为-5.713，P=0.011，也说明辐照剂量和种子相对出苗率存在显著的线性关系。

2.3 辐射诱变对北美红花七叶树叶片形态的影响

经过⁶⁰Co-γ射线辐射，北美红花七叶树幼苗叶片变化最直观，图1选取了不同剂量辐射后部分植株叶片，和对照相比，出现叶型变化（图1-A、C、F、G、H、I、K）、叶边缘变化（图1-B、D、E）、叶片扭曲褶皱（图1-E）、叶裂（图1-F、L）4种叶片变异情况（表4）。叶型变异和叶边缘变异的比例都随着辐照剂量增加，出现先增大后减小，在300 Gy时达到峰值。

2.4 辐射诱变对北美红花七叶树生长的影响

辐射处理对北美红花七叶树的生长性状影响不明显，辐射处理和对照无显著性差异（表5）。株高、复叶长、复叶宽在不同辐照剂量间有部分差异，株高在100 Gy和300 Gy时有显著性差异，且100 Gy株高最大，300 Gy株高最小。复叶长在100 Gy （300 Gy）和400 Gy有显著性差异，复叶宽在100 Gy和400 Gy呈现显著性差异。总体看，北美红花七叶树在100 Gy处理下生长指标值均大于对照，400 Gy生长指标均小于对照。表明低剂量辐射能促进北美红花七叶树生长，高剂量辐射对生长起到一定抑制作用。

2.5 辐射诱变对北美红花七叶树生理生化指标的影响

随着辐照剂量逐渐增加，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性均呈现先升高后下降的趋势，均在300 Gy时达到峰值（表6）。可推断出低剂量辐射能增强抗氧化酶活性，高剂量辐射对抗氧化酶有较强的抑制作用。和对照相比，辐射处理的丙二醛含量略有增加，但差异不显著。辐射处理的可溶性蛋白含量均小于对照，200 Gy最小。相较于对照，辐射处理的相对电导率均显著性增加，400 Gy最大。

光合色素（叶绿素a、叶绿素b、叶绿素及类胡萝卜素）质量分数变化趋势一致，随着辐照剂量增加，均是先升高后降低，在200 Gy，4种光合色素质量分数均达到最大值（表7）。超过200 Gy，光合色素质量分数显著下降，表明高剂量辐射对叶片光合色素的破坏程度更大。

2.6 辐照剂量与生长、生理生化指标的相关性

通过辐照剂量与所测定生长及生理生化指标的相关性分析，由表8可知，辐照剂量与复叶宽、小叶宽、可溶性蛋白、相对电导率有显著相关性，辐照剂量与复叶宽、小叶宽及可溶性蛋白为显著负相关，与相对电导率为显著正相关。

3 讨论

3.1 辐射适宜剂量

辐射诱变是快速创制植物新种质的有效手段，利用该技术在木本植物中已经成功获得了较多优良突变体材料^［11］。辐射诱变成功的关键因素是找到最适宜辐照剂量，这需综合考虑植株成活率和有益变异性状出现的几率。目前普遍采用半致死剂量（LD₅₀）作为参考标准^［20］，LD₅₀通常也是诱变效果最佳剂量，但LD₅₀的测定尚无统一标准，通常依据种子相对出苗率、相对发芽率、植株成活率、生长的抑制程度等指标来确定。如威灵仙（Clematis chinensis）根据相对发芽率确定LD₅₀为109.5 Gy^［21］，广宁红花油茶（Camellia semiserrata）根据植株成活率50%的剂量确定LD₅₀为47 Gy^［22］。栀子（Gardenia jasminoides Ellis）根据插条的相对存活率确定LD₅₀为81.65 Gy，根据相对生根率确定半生根剂量为21.22 Gy，根据相对成株率确定半成株剂量为20.30 Gy^［23］。本研究根据北美红花七叶树种子相对出苗率为50%的辐照剂量，得出种子半致死剂量为217.76 Gy。综合种子辐射半致死剂量及幼苗生长情况，确定200~300 Gy为北美红花七叶树种子适宜辐照剂量。

3.1 辐射对北美红花七叶树生长发育的影响

辐射后植株叶片形态变异最直观并且丰富多样，有叶型改变、叶缘和叶色变化等。威灵仙辐射出现7种变异叶形，主要出现在叶缘、叶基部等^［21］。如木槿属（Hibiscus）植物辐射后第1~3片真叶有扭曲，缺刻等表型变化^［24］。⁶⁰Co-γ辐射板栗（Castanea mollissima Bl.），叶面积增大且出现卷曲^［25］。紫叶狼尾草（Pennisetum setaceum ‘Rubrum’）经辐射后叶片出现白化、全株变绿、叶色变红等颜色变异^［26］。本研究中北美红花七叶树经⁶⁰Co-γ辐射处理，出现叶型变化、叶边缘变化、叶片扭曲褶皱、叶裂的表型变化。

对于同一种植物而言，低剂量辐射能促进植物生长，而高剂量抑制植物生长^［27］。如紫叶狼尾草在低辐照剂量（15 Gy）下根长和芽长均较对照增加，高辐照剂量（15~95 Gy）时，根长和芽长均低于对照，且随着辐照剂量的增加逐渐降低^［26］。低剂量辐射促进威灵仙种子发芽及幼苗成活和生长，高剂量（大于50 Gy）处理下威灵仙种子成活率下降，幼苗光合能力减弱且抑制生长^［21］。和对照相比，低辐射剂量（200~400 Gy）对西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum.& Na⁃kai）果实生长发育影响不显著，而高辐射剂量（800~1 000 Gy）抑制西瓜果实生长发育 ^［28］。本研究中辐射处理的北美红花七叶树生长发育与对照差异不显著，但总体看，在100 Gy处理下生长指标值均大于对照，400 Gy处理生长指标均小于对照，一定程度上说明低剂量辐射促进北美红花七叶树幼苗生长，高剂量辐射对其生长有一定抑制作用。

3.3 辐射对北美红花七叶树生理生化指标的影响

在逆境环境下，植物体内活性氧积累，过量活性氧会造成细胞膜受损，最终导致细胞死亡。丙二醛（MDA）是细胞膜损伤程度的重要指标。植物体内存在抗氧化酶及还原性物质等保护性物质，来降低和消除细胞内的活性氧，调节正常生理生化过程，使植物免受伤害。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是重要的抗氧化酶，SOD能清除超氧自由基，避免细胞膜透性受损；POD和CAT共同分解细胞中由SOD产生的H₂O₂，生成H₂O，同时降低细胞活性氧的含量_{^［29］。逆境胁迫也会引起细胞膜脂过氧化，膜透性升高，相对电导率是反映膜透性的重要指标^［30］。本试验中SOD、POD和CAT活性均随着辐照剂量的增加呈现先增加后减小的趋势，在300 Gy时达到峰值。说明到达300 Gy前，植物细胞内的活性氧快速积累，细胞需要维持较高的抗氧化酶含量来清除活性氧。同时也说明低剂量辐射会增强抗氧化酶活性，进而可以修复辐射的损伤；高剂量抑制抗氧化酶活性，细胞保护酶系统产生破坏，这与水蜡^［31］、 葡萄^［32］得出的结论相似。丙二醛（MDA）和相对电导率变化规律相似，100~400 Gy处理下，表现为先降低后升高，在300 Gy最低，可能是此剂量下3种抗氧化酶活性最高，对辐射引起的膜损坏起到一定修复作用。同时也说明，在一定的逆境环境下，植物通过增强细胞保护酶活性来提高抵抗逆境能力，维持植物正常的生理代谢活动。}

可溶性蛋白含量与植物抗逆境能力密切相关，其含量的高低与植物抗逆性成正比。本试验0~400 Gy辐射处理，可溶性蛋白呈现先降低再升高（300 Gy处理）后又略有降低，推测此剂量下3个抗氧化酶活性最高，增强了植物抗逆性。4个剂量辐照处理的可溶性蛋白含量均比对照低，这与辐射处理桂花的结果一致^［29］，可能是辐射引起了相关蛋白酶活性升高而加快蛋白质分解速度，导致可溶性蛋白质含量下降。

叶绿素是一种重要的光合色素分子，主要进行光能的吸收、传递及转化，直接影响植物的光合效率。本研究中，辐照剂量在0~200 Gy时，叶绿素含量逐渐升高，超过200 Gy，叶绿素含量显著下降。说明在低辐射剂量下，植物通过刺激叶绿素的合成来提高光合效率，而高剂量的辐射会破坏叶绿体结构及光合生理生化进程，抑制叶绿素的合成，导致叶绿素含量显著降低，水蜡辐射后叶绿素含量变化也表现为相似的结果^［31］。

4 结论

利用5个剂量的⁶⁰Co-γ射线辐射北美红花七叶树种子，根据半致死剂量和幼苗生长情况确定200~300 Gy为种子适宜辐照剂量。辐射幼苗出现叶片形态变异，300 Gy剂量下叶型和叶边缘变异比例最高，但辐射处理的幼苗生长性状指标与对照差异不显著。辐射处理对北美红花七叶树抗氧化酶活性和光合色素的影响是一致的，随着辐照剂量的增加，均呈现先升高后下降的趋势。相关性分析表明辐照剂量与北美红花七叶树复叶宽、小叶宽、可溶性蛋白、相对电导率有显著相关性。本研究为北美红花七叶树辐射诱变的首次探索，为将来提升北美红花七叶树辐射诱变效率及选育新品种打下坚实基础。

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基金资助

山东省农业良种工程项目(2020LZGC011-3)