酶解烘烤处理对小米小扁豆混合粉理化特性的影响

A study on the effects of enzyme hydrolysis and baking treatment on physicochemical characteristics of millet-lentil flour blend

摘要

目的 为探讨烘烤后酶解处理对小米-小扁豆混合粉理化特性与结构的影响。 方法 以小米-小扁豆粉为原料，设置了原粮、烘烤、烘烤后酶解3种处理，并对3种处理混合粉的主要成分、微观形态、淀粉晶型、蛋白二级结构等进行了研究。 结果 与原粮相比，烘烤处理的水分、淀粉含量减少，但烘烤酶解处理后的混合粉的蛋白质、粗脂肪、WSI、WAI、糊化焓值均显著增加（P<0.05）；烘烤处理后混合粉的表面粗糙、有孔隙且D_［4，3］增加，烘烤酶解处理后混合粉呈无规则碎片状，D_［4，3］减小；烘烤处理L^* 值降低，但a^* 、b^* 值增加，而烘烤酶解后仅a^* 值增加；烘烤后淀粉短程有序度增加，淀粉晶型没变；酶解后淀粉短程有序度减小，淀粉晶型被破坏；烘烤后α-螺旋、β-转角含量增加；酶解后的α-螺旋、无规则卷曲降低。烘烤与烘烤后酶解的悬浮液均属于假塑性流体性，损耗角tanδ值均降低。 结论 烘烤与烘烤后酶解均使小米扁豆混合粉流动性减弱。研究结果可以为小米小扁豆冲调粉类产品的加工提供参考。

Abstract

Objective This study aimed to investigate the effects of enzymatic hydrolysis after baking treatment on the physicochemical properties and structure of a millet-lentil flour blend. Method Millet and lentil bean flour were used as raw materials. The changes in the main components， micromorphology， starch crystal，and protein secondary structure of three mixed flours， including raw grain， baked grain， and enzymatically hydrolyzed after baking，were studied. Result The results showed that compared to raw grain，the moisture and starch content of baked grain decreased. However， protein， ether extract， WSI， WAI，and gelatinization enthalpy were significantly increased after enzymatic hydrolysis （P<0.05）.The surface of baked grain was rough and porous， and D_［4，3］ increased，while D_［4，3］ decreased after enzymatic hydrolysis.Baking L^* value decreased， but a^* and b^* values increased. Only a^* value increased after enzymatic hydrolysis.After baking， the short-range order degree of starch increased， and the crystal shape of starch did not change.After enzymatic hydrolysis，the short-range order degree of starch decreased，and the starch crystal was destroyed.The contents of α-helix and β-corner increased after baking.After enzymolysis，α-helixand irregular curl were reduced.The suspension of baked and enzymatically hydrolyzed samples were pseudoplastic fluids，and the loss angle tan value decreased，indicating weakened fluidity. Conclusion Baking and enzymatic hydrolysis after baking reduced the fluidity of the millet-lentil flour blend.These findings could provide reference for the processing of millet and lentil flour blending products.

Graphical abstract

关键词

小米粉 / 小扁豆粉 / 烘烤-酶解 / 流变特性

Key words

millet flour / lentil flour / baking-enzymatic digestion / rheological properties

据《中国居民营养与慢性病状况报告（2020年）》报道，我国慢性病患者基数在不断扩大^［1］。杂粮和豆类富含B族维生素、植物甾醇、黄酮类化合物，对降低Ⅱ型糖尿病、心血管病和肿瘤等慢性疾病的发病风险具有重要作用^［2］。研究表明，小米、小扁豆与几种慢性病，如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、癌症等发病率呈负相关^［3-4］。

膳食指南建议谷物与豆类食物搭配食用营养更均衡，小米营养成分易于被人体吸收，消化率达90%以上，是一种具有食疗作用的优质粮源，被称为五谷之王^［5］。小扁豆含有所有人体必需氨基酸且富含赖氨酸^［2］，可以与小米进行氨基酸互补以提高食物的整体营养价值^［6］，此外，小扁豆的脂质比动物脂和乳脂都具有更强的降低血液胆固醇的能力，可防止动脉硬化及高血压症^［7］。在谷物熟化工艺中，家庭常用的加工方法有蒸煮、微波和烘烤等。烘烤是一种典型的高温热处理方法，可以提高谷物豆类的消化率，减少抗营养素及营养成分流失^［8］，同时还能产生大量挥发性风味物质，提升产品香气。Bi等^［9-10］研究认为小米、小豆烘烤后挥发性化合物增加，产生令人愉快的香气。Farida等^［11］对烘烤的小扁豆粉理化性质及功能特性进行研究，发现烘烤后褐变指数、吸水性、乳化性及起泡稳定性均有所提高。袁嘉渝等^［12］报道了烘烤代餐粉的颗粒结构疏松且表面粗糙，淀粉的相对结晶度降低，但吸水性指数、水溶性指数与起始糊化温度均升高。Maria等^［13］以小扁豆和高蛋白营养酵母粉为原料，采用挤压膨化技术，制作出适合普通消费者和乳糜泻人群的安全、功能性无麸质食品的新型零食。酶解处理反应条件温和、高效且成本低，常用来辅助挤压膨化等加工方式。戴晓慧等^［14］采用蒸汽酶解调质-挤压膨化技术改善速食米粉的冲调特性及其预消化性。郝姣月等^［15］研究了酶解杂粮效果，发现蛋白质、必需氨基酸、膳食纤维等物质含量均提高。

目前，小扁豆多直接蒸煮籽粒作为小扁豆汤、粥等食用；或与其他谷类面粉混合制成各种面包、糕点；或与其他食品配制成婴幼儿或老年人的营养食品^［7］。小扁豆拥有均衡的营养成分及丰富营养素，但国内小扁豆加工附加值相对较低，选含丰富营养的小米与小扁豆按照质量比1∶1混合制作冲调类产品基料，利用合理的加工方式充分发掘小米-小扁豆混合粉营养功能与利用价值。目前关于小米、小扁豆品质特性的研究还以单粉研究为主，混合粉的研究鲜有报道。

本研究以小米小扁豆混合粉为原料，探讨烘烤、烘烤后酶解处理对混合粉微观结构、蛋白质二级结构、热力学、流变学、色度等特性的影响，以期为进一步加工冲调粉类产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米、小扁豆：甘肃发滋瑞小杂粮食品有限公司；α-淀粉酶（α-amylase，4 000 U/g）、木瓜蛋白酶（papain，800 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；盐酸、硼酸、硫酸、甲基红、亚甲基兰、石油醚、NaOH、CuSO₄、K₂SO₄均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

H-1850R高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；DHR-1流变仪、DSC 25差示扫描量热仪，美国TA仪器公司；MIRA-3场发射扫描电镜，泰斯肯贸易有限公司；MSAL XD-3XRD，北京普析通用仪器有限责任公司；Bettersize2600激光粒度分布仪，丹东百特仪器有限公司；NEXUS 670傅里叶红外光谱仪，美国Thermo公司；SC 10色差计，杭州远方光谱有限公司；高速粉碎机，浙江红景天工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合粉样品制备

原粮混合粉（raw grain mixed flour，RGMF）：将小米、小扁豆原料筛选除杂，放入高速粉碎机内粉碎后过60目筛，按质量比1∶1混合，即为原粮混合粉，作为对照。

烘烤混合粉（baking grain mixed flour，BGMF）制备参考Farida等^［11］方法稍作修改：分别称取小米、小扁豆原料各400 g，均匀平铺于锡箔纸上，置于160 ℃的烤箱中烘烤30 min后冷却至室温，粉碎并过60目筛，按质量比为1∶1混合，即为烘烤混合粉，密封袋保存备用。

烘烤后酶解混合粉（enzymatic hydrolysis with baking grain mixed flour，EBGMF），制备参考郝姣月^［15］方法稍作修改：称取烘烤混合粉30 g，加入300 mL蒸馏水，自然pH条件下，加入木瓜蛋白酶，添加量20 000 U/g，再加入α-淀粉酶，添加量40 U/g，酶解温度60 ℃，酶解时间4 h，95 ℃沸水浴灭酶10 min。离心去上清液，沉淀物在30 ℃下鼓风干燥12 h后，即为酶解烘烤混合粉，密封袋保存备用。

1.3.2 混合粉主要成分测定

水分含量参照GB/T 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》进行；蛋白质含量参照GB/T 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行；脂肪含量参照GB/T 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》进行；淀粉含量采用索莱宝淀粉含量检测试剂盒测定。

1.3.3 混合粉微观形态观察

参照袁嘉渝等^［12］方法并稍作修改。混合粉样品粉末粘在样品台上，在真空室中喷金。用扫描电子显微镜（SEM）于1 000倍、5 000倍下观察混合粉样品的微观形态特征。

1.3.4 混合粉粒度分布测定

参照王博等^［16］方法并稍作修改。样品池中加入少量混合粉样品，蒸馏水为分散介质，样品充分均匀分散，获得适当折光率后进行测定。

1.3.5 混合粉色度测定

参照张冬媛等^［17］方法并稍作修改。使用色差计，采用L*-a*-b*色彩空间。每次测量色差计显示L*（0表示黑色、100表示白色）、a*（正值表示红色，负值表示绿色）、b*（正值表示黄色，负值表示蓝色）。

1.3.6 混合粉晶体结构测定

用X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）对原粮、烘烤、酶解烘烤混合粉的晶体结构进行表征。试验条件为电压40 kv，电流30 mA，扫描范围10°~50°，扫描步宽0.01°，连续扫描。

1.3.7 混合粉傅立叶红外光谱测定

参照王钰麟等^［18］方法并稍作修改。采用溴化钾压片法，取适量溴化钾，加入干燥样品粉末，碾磨至无颗粒感后压片，扫描波长为4 000~450 cm^-1。使用红外软件OMNIC对傅立叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）图进行去卷积处理，采用Peakfit软件对去卷积FT-IR光谱酰胺I带（1 700~1 600 cm^-1）拟合，并计算α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量。

1.3.8 混合粉流变学特性测定

静态流变学测定参照韩晶等^［19］方法并稍作修改。取4 g样品，用70 ℃的热水28 mL冲调，待样品冷却至室温，将其放置在样品台。选用直径为40 mm的不锈钢平行板夹具，平行板测定间隙为1 000 μm。设定25 ℃，剪切速率范围为0.1~300 s^-1，分别测定原粮、烘烤、酶解烘烤混合粉悬浮液的黏度和剪切应力的变化，采用幂律方程对其流变曲线进行拟合分析，得到不同混合粉流变曲线的幂律模型拟合参数。方程为：

\tau =K{D}^n（1）

式中：τ为剪切应力（Pa）；K为黏度系数（Pa⋅s）；D为剪切速率（s^-1）；n为流动指数。

动态流变学测定选用直径为40 mm不锈钢2°锥板夹具，平行板测定间距为1 000 μm，振荡模式下设定应变5%，25 ℃条件下测定原粮、烘烤、酶解烘烤混合粉储能模量G′和损耗模量G΄΄在角频率为1~100 rad/s扫描范围内的变化。

1.3.9 混合粉的热力学特性测定

参照张晶等^［20］方法：称取3.0 mg混合粉样品置于铝质坩埚内，加入9 μL去离子水，密封压盖，4 ℃下平衡24 h。空铝质坩埚为对照，DSC扫描温度范围40~200 ℃，温度上升速率为10 ℃/min。

1.3.10 混合粉吸水性指数与水溶性指数测定

水溶性指数（water solubility index，WSI）和吸水性指数（water absorption index，WAI）根据Kaisangsri等^［21］方法稍作修改。分别称取原粮、烘烤、酶解烘烤混合粉0.5 g（M₀，g）样品，放入10 mL离心管（M₁，g）中，加入7 mL蒸馏水，在30 ℃水浴锅中加热30 min，每隔5 min振荡30 s，保持悬浮状态，水浴后4 000 r/min离心15 min，将上清液倒入称量瓶中（M₂，g），105 ℃烘干至恒重（M₃，g）。同时称量离心沉淀的凝胶质量（M₄，g）。计算公式为

WSI（%）=\frac{M_{\mathrm{3}}-M_{\mathrm{2}}}{M_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

WAI（g/g）=\frac{M_{\mathrm{4}}-M_{\mathrm{1}}}{M_{\mathrm{0}}}（3）

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2019进行数据处理，Origin 2021进行基本作图，SPSS 26 软件的Duncan’s法进行差异显著性分析，设α=0.05。每组试验重复3次，数据用平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 混合粉的主要成分分析

由表1可知，原粮水分含量为6.81%，烘烤和酶解处理使水分含量分别显著降低51.54%和20.41%（P<0.05），这是再干燥时水分蒸发所致；烘烤处理使少部分淀粉热分解及热损失致淀粉含量降低，α-淀粉酶水解淀粉为麦芽糊精和单糖，使淀粉含量显著降低（P<0.05），淀粉含量降低对提高混合粉的溶解性有利。与原粮对比，烘烤混合粉的蛋白质含量与脂肪含量变化不显著，酶解烘烤混合粉的蛋白质含量显著增加，一方面是外源蛋白酶的添加，另一方面是酶解时释放出较多的游离氨基酸。酶解烘烤混合粉的粗脂肪含量显著增加（P<0.05），这可能与酶解后淀粉-脂质复合物的形成有关^［22］。

2.2 混合粉的微观形态

小米淀粉颗粒呈多角形与球形，小扁豆淀粉颗粒呈椭圆形与圆形。混合粉中淀粉颗粒较大，表面相对光滑，蛋白质和纤维素颗粒附着在淀粉颗粒上面（图1-A、1-D）；烘烤中水分蒸发，使淀粉颗粒表面变粗糙，能观察到部分淀粉颗粒表面出现裂缝或凹陷（图1-B、1-E）；王钰麟等^［18］对青稞粉进行蒸煮-老化处理，发现炒制青稞淀粉表面变得粗糙，这一结果与本研究一致。酶作用淀粉和蛋白质颗粒，使其分解为糊精、麦芽糖、氨基酸和肽类等小分子物质^［23］，颗粒变小且呈无规则碎片状（图1-C、1-F）。

2.3 混合粉的粒度及分布

由表2可知，烘烤处理的体积平均粒径（D_［4，3］）显著增加38%（P<0.05），中位径（D₅₀）和粗端粒度（D₉₀）分别增加了73%、27%，可能与淀粉等的凝胶化和颗粒膨胀有关。Span（跨度）是衡量粒径分布均匀性的指标，其值越小物料粒度分布越均匀，原粮与酶解烘烤混合粉的粒径分布无明显变化，烘烤处理后混合粉的Span值变小，表明其颗粒粒径分布更趋均匀；与原粮相比，酶解烘烤混合粉的D_［4，3］、D₅₀、D₉₀分别减少17%、13%、16%，这与电镜观察结果一致。粒径变小与水分接触的通道增加，更有利于水分的传导，溶解性较好^［24］。

2.4 混合粉的色度

如表3所示，与原粮相比，烘烤的a*值（红色）、b*值（黄色）显著增加（P<0.05），L*值（亮度）降低，说明烘烤处理使得混合粉的亮度减弱，红度与黄度颜色加深；酶解烘烤的a*值显著增加，L*值、b*值显著降低（P<0.05），说明酶解烘烤使混合粉亮度与黄度均减弱，混合粉颜色稍变红。烘烤处理引起原有色素氧化或降解而使a*、b*值增加，酶解后美拉德反应和多酚热氧化强度加剧，生成棕色物质的量增加^［25］。L*值越低，表明褐变程度越大，酶解后褐变较大。张冬媛等^［17］在研究α-淀粉酶酶解糙米L*值时有同样的结论。

2.5 混合粉的淀粉晶型

XRD可以检测不同淀粉的结晶型。小米淀粉、小扁豆淀粉分别是A-型、C-型结晶，两种晶型在17°和23°附近均有强衍射峰。XRD测定发现，原粮与烘烤在2θ为15.23°、17.02°、18.12°和23.12°处出现强衍射峰（图2），表明原粮与烘烤混合粉中的淀粉结晶呈A型和C型结晶，烘烤没有改变混合粉内淀粉的晶型结构，这与袁嘉渝等^［12］烘烤处理代餐粉的淀粉晶体结构研究结果一致；酶解烘烤的特征衍射峰几乎全部消失，α-淀粉酶酶解后，淀粉颗粒结晶区域被破坏；在2θ为20°附近的峰为直链淀粉与脂类的无定形峰（EBGMF），说明酶解使更多直链淀粉暴露出来，促使直链-脂类复合物的量增加^［26］。

2.6 混合粉的淀粉有序结构、蛋白质二级结构分析

如图3所示，烘烤混合粉在3 440 cm^-1处吸收峰强度变低（图3-A、3-B），这可能是混合粉的淀粉分子内和分子间氢键作用力降低，淀粉结晶区内双螺旋间某些氢键的解离和解卷所致。红外光谱中1 200~800 cm^-1处的吸光带强度对淀粉分子构象，短程有序结构敏感，常用来表征淀粉的短程有序结构。1 047 cm^-1和1 022 cm^-1处的谱带分别与淀粉的有序结构和无定形结构有关。用吸光度1 047/1 022 cm^-1的比值来量化淀粉的有序度^［27］，比值越大，淀粉分子短程有序化程度越高。试验结果显示，酶解使淀粉短程有序度降低，即淀粉结构破坏无定形区比例相对较高（表4）；烘烤使淀粉短程有序度增加。Huang等^［28］在研究DSC热处理淀粉短程分子有序结构有同样增加的变化。

采用Peakfit软件对酰胺I带1 700~1 600 cm^-1去卷积光谱拟合分析，α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规则卷曲的特征吸收分别在1 650~1 660 cm^-1、1 660~1 700 cm^-1、1 610~1 640 cm^-1、1 640~1 650 cm^-1波段^［29］。由表4可知，与原粮相比，烘烤混合粉的α-螺旋、β-转角分别增加了31.13%、79.34%，β-折叠、无规则卷曲分别降低了23.46%、21.89%；酶解烘烤混合粉的α-螺旋、无规则卷曲分别降低了11.57%、7.42%，β-折叠增加了20.58%，β-转角没有改变。α-螺旋是常见的蛋白质二级结构，陶汝青等^［30］发现热处理使大豆蛋白的α-螺旋结构增多。β-折叠与豆类蛋白质的消化率呈负相关，试验结果显示，酶解处理使β-折叠增加，表明此处理更利于消化^［31］。β-转角的增加可能与球蛋白热聚集有关^［32］。

2.7 混合粉的流变学特性

在25 ℃条件测定不同处理的混合粉悬浮液下静态流变学特性，幂律方程拟合后参数见表5。幂律模型可以用来准确描述各样品在一定剪切速率范围内的流动曲线（R²>0.98），各样品均表现出触变性（n<1）；原粮混合粉悬浮液中淀粉颗粒保存完整，具有低浓度高粘度的特性，使得连续相的粘度增加，流动性能指数（n）较小；烘烤和酶解处理后，淀粉变性或被分解，悬浮液的连续相被破坏，从而改变了体系的流变学特性，也造成表观粘度常数（K）逐渐降低，流动性能指数（n）逐渐增大，表现为易于冲调。剪切速率与剪切应力、表观黏度均呈非线性关系，剪切应力随剪切速率的增大而增大，表观黏度则逐渐减小（图4），这与李艳霞^［33］的研究结果一致。

储能模量G′表示粉的弹性性质，反映变形程度；损耗模量G″表示粉的粘度特性，反映阻碍物体流动的特性。随着角频率增大，3种混合粉的G′大于G″（图5），表明该体系是典型的弱凝胶。损耗角正切值tanδ为G″和G′的比值，tanδ值越大，体系流动性越强，tanδ值越小，固体特性越强。烘烤、酶解烘烤混合粉的tanδ值均减小，表明处理后混合粉体系的流动性减弱，固体特性增强。

2.8 混合粉的热特性

烘烤混合粉的起始糊化温度、峰值温度、终止糊化温度、糊化焓变均无显著变化（P>0.05），表明烘烤处理不改变混合粉热力学特性，酶解处理造成淀粉和蛋白质降解，对热力学性质影响较大（表6），这与XRD试验结果中淀粉晶型未变化相一致。混合粉吸热过程包括混合粉内淀粉糊化过程与直链淀粉-脂质复合物蛋白质变性和融化过程^［26］；酶解烘烤混合粉的脂质复合物的糊化焓变值等明显高于原粮、烘烤混合粉，这与酶解混合粉的脂肪含量较高相符。这与赵德厚等^［34］通过压热-酶法制备的大豆蛋白肽-玉米淀粉复合物的热稳定性增加，复合物的糊化焓显著高于未处理的玉米淀粉趋势一致。郭世龙等^［35］在挤压加工重组米后形成淀粉酯复合物的终止温度和糊化焓也显著增大。

2.9 混合粉的WSI与WAI分析

烘烤处理对WAI和WSI影响不显著，酶解处理后混合粉的WAI（（3.45±0.02） g/g）高于原粮（（2.51±0.11） g/g）与烘烤处理（（2.59±0.03） g/g）；酶解WSI（（32.93±4.24）%）也显著高于烘烤处理（（7.31±0.14）%）和原粮（（12.21±1.09）%）。烘烤处理不改变淀粉晶型，WSI与原粮无差别；与淀粉糊化程度有关、反映混合粉中淀粉吸水能力的WAI差异不大。WAI的值与大分子的亲水性和成胶能力有关，值越高，产品与水的结合能力越强，混合粉的成糊性和稳定性越好^［36］；WSI值越高，混合粉中的小分子物质越多，产品冲调性越好。试验结果显示，酶解处理更有利于产品的冲调性、成糊性和稳定性，也更易于人体消化吸收^［37-38］。

3 结论

烘烤处理使混合粉的水分、淀粉、蛋白质、L*、WAI值降低，平均体积粒径、a*、b*显著增加；酶解处理使混合粉的水分、淀粉含量降低，蛋白质、脂肪、糊化焓、WAI增加。烘烤能使部分淀粉颗粒产生多孔结构，淀粉短程有序度较高，但不改变淀粉结晶类型，蛋白的β-折叠降低、α-螺旋增加。酶解使淀粉颗粒分解成碎片状，淀粉短程有序度较低，结晶结构被破坏，无定形区比例增高；蛋白的α-螺旋减少，无规则卷曲、β-折叠增加。烘烤对混合粉热力学特性无显著影响，酶解对混合粉热力学特性影响显著；烘烤后酶解处理更有利于冲调粉产品的冲调性、成糊性和稳定性，也更易于人体消化吸收。

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基金资助

甘肃省科技厅“糜谷加工特性研究及系列方便食品研发与转化应用”项目(20YF8NA33)